Đang tải... (xem toàn văn)
CHUYÊN ĐỀ: SINH TỔNG HỢP NANO BẠC BẰNG VI KHUẨN E.COLI HỌC PHẦN: TỔNG HỢP SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ 1. Tổng quan 3 1.1 Giới thiệu 3 1.2 Tìm hiểu chung 3 1.2.1 Cái khái niệm liên quan tới nano 3 1.2.2 Hạt nano bạc 4 1.3 Chủng vi khuẩn Escherichia Coli 7 1.3.1.Hình thái 7 1.3.2 Nuôi cấy 7 1.3.3 Tính chất hoá sinh 8 2. Nguyên liệu và phương pháp 9 2.1 Nguồn vi sinh vật 9 2.2.1 Khái quát 9 2.3 Cách tiến hành 10 2.3.1 Tạo sinh khối 10 2.3.2 Tổng hợp các hạt nano bạc 10 2.3.3 Đặc tính của hạt nano bạc 11 2.3.4 Đo kích thước hạt 11 3. Kết quả và thảo luận 11 3.1 Ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp hạt nano bạc 11 3.2 Đặc tính của hạt nano bạc 14 3.3 Máy phân tích cỡ hạt 16
``` ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HOÁ HỌC -- BÀI BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ: SINH TỔNG HỢP NANO BẠC BẰNG VI KHUẨN E.COLI HỌC PHẦN: TỔNG HỢP SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ Họ tên sinh viên: Nhóm Lớp 14CHD NĂM HỌC 2016 – 2017 Mục lục Tổng quan 1.1 Giới thiệu .3 1.2 Tìm hiểu chung 1.2.1 Cái khái niệm liên quan tới nano 1.2.2 Hạt nano bạc 1.3 Chủng vi khuẩn Escherichia Coli 1.3.1.Hình thái 1.3.2 Nuôi cấy 1.3.3 Tính chất hố sinh .8 Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguồn vi sinh vật 2.2.1 Khái quát .9 2.3 Cách tiến hành 10 2.3.1 Tạo sinh khối .10 2.3.2 Tổng hợp hạt nano bạc .10 2.3.3 Đặc tính hạt nano bạc 11 2.3.4 Đo kích thước hạt 11 Kết thảo luận 11 3.1 Ảnh hưởng môi trường đến tổng hợp hạt nano bạc .11 3.2 Đặc tính hạt nano bạc .14 3.3 Máy phân tích cỡ hạt .16 MỞ ĐẦU Phương pháp sinh học khả nghiên cứu hình dạng hạt tạo nên người ý công nghệ nano đại Các chuẩn vi khuẩn Escherichia coli, dùng tổng hợp vi sinh hạt nano bạc tìm hiểu Những hạt nano bạc phân tích phương pháp quang phổ UV-VIS, phân tích kích thước hạt Các hạt nano có độ hấp thụ tối đa bước sóng 400nm quang phổ UV-VIS tương ứng với cộng hưởng plasmon hạt nano bạc Tổng quan 1.1 Giới thiệu Công nghệ nano lĩnh vực lên liên ngành nghiên cứu, đặc biệt công nghệ sinh học Sự tổng hợp nguyên liệu nano bạc/ hạt nano bạc nghiên cứu rộng rãi phương pháp hóa lý, phát triển công nghệ đảm bảo để sản xuất hạt nano khía cạnh quan trọng cơng nghệ nano Tiến trình tổng hợp sinh học cung cấp nhiều phương pháp chấp nhận mặt mơi trường, chi phí sản xuất thấp thời gian cần thiết tối thiểu Đồng thời hạt nano bạc tổng hợp đường sinh học có nhiều ứng dụng như: xúc tác phản ứng hóa học, chất đánh dấu sinh học, chất kháng khuẩn, pin điện hóa, quang thụ thể Nguồn vi sinh để tạo hạt nano bạc cho thấy mối quan tâm lớn kết tụ hạt nano độ hoạt động trao đổi chất Tất nhiên sựkết tụ hạt nano mơi trường bên ngồi tế bào, cho thấy hoạt động ngoại bào sinh vật Sự tổng hợp ngoại bào hạt nano sử dụng màng lọc tế bào có lợi tổng hợp nội bào, nấm đối tượng tốt cho q trình ngoại bào thân thiện với mơi trường Có báo cáo cơng bố thành tài liệu tổng hợp sinh học hạt nano bạc từ nấm Sử dụng vi khuẩn trình sản xuất sinh học có lợi hơn, dễ dàng xử lý nấm Trong nghiên cứu này, sản xuất vi sinh hạt nano bạc tìm hiểu cách sử dụng chủng vi khuẩn E.coli Nghiên cứu bao hàm thành phần trung bình khác để sản xuất hạt nano bạc mơ tả đặc tính hạt phương pháp phổ UV phân tích nhiễu xạ laser kích thước hạt Theo hiểu biết chúng tôi, tổng hợp ngoại bào hạt Ag chuẩn vi khuẩn E.coli với hai thành phần trung bình khác chưa báo cáo 1.2 Tìm hiểu chung 1.2.1 Cái khái niệm liên quan tới nano 1.2.1.1 Công nghệ nano Là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo ứng dụng cấu trúc thiết bị hệ thống việc điều khiển hình dáng, kích thước qui mơ nanomet Đối tượng công nghệ nano vật liệu nano 1.2.1.2 Vật liệu nano Là loại vật liệu có cấu trúc hạt, sợi, ống, mỏng, có kích thước đặc trưng khoảng từ nanơmét đến 100 nanômét 1.2.1.3Hạt nano kim loại Là khái niệm để hạt có kích thước nano tạo thành từ kim loại Người ta biết hạt nano kim loại hạt nano vàng, nano bạc sử dụng từ hàng nghìn năm Khi nghiên cứu, nhà khoa học thiết lập phương pháp chế tạo hiểu tính chất thú vị hạt nano Một tính chất màu sắc hạt nano phụ thuộc nhiều vào kích thước hình dạng chúng 1.2.2 Hạt nano bạc 1.2.2.1 Khái niệm Bạc nano hạt bạc có kích thước nằm khoảng 0,1 đến 100nm Bạc nano thường dạng dung dịch keo với chất bảo vệ polymer(polyvinylalcol PVA, polyethylenglycol PEG, polyvinyl pyrolidone PVP) để cáchạt nano bạc không bị kết tụ 1.2.2.2 Đặc điểm Diệt 650 loại vi khuẩn Hiệu cao Tác dụng nhanh Không độc Khơng kích thích Khơng gây dị ứng 1.2.2.3 Ứng dụng Do thể tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường sử dụng để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể vài sản phẩm chứa hạt nano bạc như: - Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùng nhựa có pha thêm hạt nano bạc có tác dụng khử trùng Qua kiểm tra cho thấy chúng có khả diệt 99.9% vi khuẩn Bình sữa làm nhựa có pha thêm nano bạc - Đồ may mặc: hạt nano bạc tẩm vào loại sợi để diệt khuẩn khử mùi Tất làm sợi nilon có pha nano bạc - Các thiết bị điện tử: Điều hòa, tủ lạnh, máy giặt Điều hòa sử dụng lọc nano bạc - Y tế: + Khẩu trang nano bạc: Được thiết kế với 3-4 lớp gồm lớp vải, lớp vật liệu tẩm nano bạc than hoạt tính giữa, loại trang có khả diệt khuẩn, diệt virus, lọc khơng khí tốt Lớp vải tẩm nano bạc có chức diệt vi khuẩn, virus, nấm bị giữ lại trang đồng thời có tác dụng khử mùi Khẩu trang nano bạc viện môi trường sản xuất + Sản xuất thuốc chữa bệnh Các dược phẩm sử dụng nano bạc + Màng hơ hấp: Đó màng mỏng cho khí nước qua khơng thể cho chất lỏng qua, có vơ số lỗ khí nhỏ tồn film Các hạt nano bạc gần kết hợp với film polyolefin với đặc tính kháng khuẩn tốt - Trong nơng nghiệp Sản phẩm thuốc trừ bệnh MIFUM 0,6 DD sản xuất với nồng độ hạt nano bạc 1000 ppm Chitosan 5000 ppm MIFUM 0,6 DD khảo nghiệm trừ bệnh đạo ôn, lem lép hạt lúa thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng chứng tỏ ưu việt mình, cà liều lượng, 0,5 lít MIFUM 0,6 DD lít MIFUM 0,6 DD/ha cho đạt hiệu cao việc phòng trừ bệnh đạo ôn cổ bông, lem lép hạt lúa, giai đoạn – ngày sau phun - Trong cơng nghệ xử lýnước Phòng thí nghiệm Cơng nghệ Nano sử dụng vật liệu polyurethane mút xốp tẩm nano bạc (PU/Ag) để xử lý nước uống nhiễm khuẩn E.coli Nước qua hệ lọc PU/Ag khơngcònvi khuẩn uống theo tiêu chuẩncủa WHO 1.3 Chủng vi khuẩn Escherichia Coli Escherichia coli (E coli) Ruchner tìm vào năm 1885 Escherich nghiên cứu cách chi tiết từ năm 1886 Bình thường E coli sống đại tràng người động vật, chiếm 80% tổng số vi khuẩn ưa khí ruột khơng gây bệnh E coli tổng hợp số vitamin B, C, K tạo nên trạng thái cân vi khuẩn ruột 1.3.1.Hình thái E coli trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước 0.5-3 um, thường đứng riêng rẽ, đơi chuỗi ngắn Vi khuẩn có lơng xung quanh thân nên di động được, số chủng có vỏ, khơng có bào tử 1.3.2 Ni cấy E coli vi khuẩn dễ ni cấy, ưa, kỵ khí tùy ngộ, phát triển tốt môi trường dinh dưỡng thông thường Một số phát triển mơi trường tổng hợp nghèo chất dinh dưỡng Hiếu kỵ khí tuỳ tiện Có thể phát triển nhiệt độ từ – 40°c Trong điều kiện thích hợp E coli phát triển nhanh, thời gian hệ khoảng 20 đến 30 phút Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau – làm đục nhẹ môi trường, sau 24 làm đục đều; sau hai ngày mặt mơi trưòng có váng mỏng Những ngày sau đáy ống thấy cặn Trên mơi trường thạch thường, sau khoảng – 10 giò, dùng kính lúp quan sát khuẩn lạc Sau 24 khuẩn lạc khoảng 1,5 mm Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng II gặp dạng R, M 1.3.3 Tính chất hố sinh E coli có khả lên men nhiều loại đường có sinh hơi, khử nitrate thành nitrite Tất E coli lên men lactose sinh trừ ngoại lệ E coli loại EIEC E coli có khả sinh indol, Không sinh H2S Không sử dụng nguồn carbon citrat mơi trường Simmons Có decarboxylase có khả náng khử carboxyl lysin, ornitin, arginin acid glutamic Betagalactosidase dương tính Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguồn vi sinh vật Các chủng vi khuẩn Escherichia coli, lấy từ trung tâm thu mẫu vi khuẩn, Chandigarh, Ấn Độ Kết cho thấy môi trường nuôi cấy tinh khiết thu môi trường thạch môi trường dinh dưỡng (HiMedia, Mumbai, Ấn Độ) 27 ° C nuôi cấy thời điểm để điều chỉnh tính khả thi phòng thí nghiệm vi sinh học (Bộ Cơng nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Manipal, Manipal Đại học, Manipal, Ấn Độ) thời gian nghiên cứu 2.2 Tổng hợp phương pháp sinh học Có nhiều phương pháp để chế tạo hạt nano Ag phương pháp hóa học, sinh học, vật lý…Nhiều phương pháp vật lý hóa học sử dụng rộng rãi để tạo hạt nano Ag đơn phân tán Nhưng độ ổn định sử dụng hóa chất độc hại vấn đề quan tâm Việc sử dụng hóa chất độc hại bề mặt hạt nano dung môi không phân cực trình tổng hợp giới hạn ứng dụng vào lâm sàng Do vậy, việc phát triển phương pháp sạch, tương hợp sinh học, không độc hại, thân thiện với môi trường công nhận Q trình tổng hợp sinh học mang lại lợi ích mặt mơi trường, chi phí sản xuất thấp, thời gian tối thiểu cần thiết, tiết kiệm lượng không độc hại Các vi sinh vật vi khuẩn, nấm nghiên cứu tổng hợp hạt nano kim loại Sinh tổng hợp hạt nano giúp tiến tới “hóa học xanh” kết nối công nghệ nano công nghệ vi sinh 2.2.1 Khái quát 2.2.1.1 Cơ chế Cơ chế trình tổng hợp nano bạc vi sinh vật chưa tìm hiểu tường tận đa số giả thuyết cho trình liên quan đến hoạt động enzyme khử nitrate (nitrate reductase) vi sinh vật tiết Quá trình khử bắt đầu vận chuyển electron từ chất cho electron đến Ag + để khử ion Ag+ tạo thành nguyên tử Ag Các enzyme phụ thuộc NADH nitrate reductase đóng vai trò chất vận chuyển điện tử Bên cạnh enzyme này, số naphthoquinone anthraquinone tìm thấy nấm Fusarium oxysporum đóng vai trò chất truyền điện tử trình khử kim loại tính chất oxi hóa khử đặc trưng chúng 2.2.1.2 Phân loại Dựa vào vị trí đám nguyên tử nano bạc tổng hợp mà người ta chia trình tổng hợp sinh học thành hai dạng: * Tổng hợp nội bào: - Sản phẩm nano bạc tạo nằm bên tế bào - Các chủng vi sinh vật có khả tổng hợp nano bạc nội bào Psedomonas stutzeri, Rhodococcus sp, Verticillium sp, Bacillus licheniformis - Vì sản phẩm nano bạc tạo nằm tế bào nên để nhận sản phẩm cần phải phá vỡ màng tế bào hóa chất sóng siêu âm, sau ly tâm tách bỏ mãnh vỡ tế bào - Ưu điểm trình kiểm sốt kích thước hạt nanobạc * Tổng hợp ngoại bào: - Sản phẩm tạo nằm bên tế bào vi sinh vật - Các chủng Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Aspergillus fumigatus , Aspergillus flavus , Phaenerochaete chrysosporium, Lactobacillus sp, Thermomonospora, Penicillium fellutanum,Pleurotus sajor caju - Để thu sản phẩm nano bạc ngoại bào cần dùng phương pháp tách tế bào khỏi dịch ni cấy ly tâm, lọc… sau thu lấy phần dịch - Ưu điểm trình khơng cần đến phương pháp phá màng tế bào để thu nhận sản phẩm 2.3 Cách tiến hành 2.3.1 Tạo sinh khối Các chủng vi khuẩn Escherichia coli nuôi cấy, để sinh khối sinh tổng hợp hai môi trường lỏng khác môi trường nước dinh dưỡng môi trường LB Các lọ nuôi cấy ủ máy lắc quỹ đạo 27oC khuấy 220 rpm Sinh khối thu hoạch sau 24 tăng trưởng ly tâm 12000 rpm 10 phút Các vật liệu bề mặt thu thập để tiếp tục phản ứng để tổng hợp hạt nano 2.3.2 Tổng hợp hạt nano bạc Các chủng vi khuẩn Escherichia coli nuôi cấy, để sinh khối sinh tổng hợp hai môi trường lỏng khác môi trường nước dinh dưỡng môi trường LB Mẫu bổ sung riêng vào bình phản ứng có chứa bạc nitrat (AgNO3) nồng độ 10-3 (1% v / v) kiểm sốt (khơng có sinh khối silentitrate, có sinh khối) chạy với điều kiện thực nghiệm Phản ứng ion Ag + thực điều kiện sáng 24 2.3.3 Đặc tính hạt nano bạc Việc xử lý ion Ag + dung dịch theo dõi mẫu 2ml thu hồi khoảng thời gian khác độ hấp thụ đo độ phân giải nm sử dụng quang phổ quang phổ UV (PHARMASPEC UV-1700, SHIMADZU CORPORATION Ltd., KYOTO , JAPAN) với mẫu cuvet thạch anh 2.3.4 Đo kích thước hạt Các thí nghiệm phân tích kích thước hạt thực phương pháp đo độ nhiễu laser (máy phân tích kích thước hạt laser); sử dụng băng quang học nhỏ gọn, CILAS 1064 tích hợp nguồn laser có trình tự với 0º 45º Các phép đo thực khoảng từ 0,04 đến 500 μm Thông qua phần mềm, đường cong phân phối thể 100 lớp phạm vi đề cập Kết thảo luận Hệ thống nghiên cứu sinh học hoạt động mơi trường ni cấy điều kiện hố lý để tổng hợp vật liệu vô Phương pháp sinh học tổng hợp hạt nano bạc biểu hấp thụ mạnh mẽ sóng điện từ phạm vi khả kiến tính cộng hưởng quang học chúng, gọi cộng hưởng bề mặt Plasmon (SPR), xảy dao động tập hợp electron dẫn, kết hợp với ánh sáng tới SPR ảnh hưởng lớn hình dạng kích thước hạt nano Tương tự vậy, vi sinh vật có tương tác kim loại vi khuẩn để sản xuất ion kim loại vô có nhiều ứng dụng lĩnh vực cơng nghệ sinh học, bao gồm xử lý sinh học, biomineralization, ngâm chiết sinh học ăn mòn vi sinh vật 3.1 Ảnh hưởng môi trường đến tổng hợp hạt nano bạc Các chủng vi khuẩn E coli tiêm vào môi trường khác LB môi trường Broth Nutrient (canh nuôi cấy) Cả hai môi trường cho thấy lượng sinh khối, tổng hợp hạt nano bạc môi trường LB tối đa so với môi trường chứa chất dinh dưỡng (dữ liệu không hiển thị) Thể cấu tạo tổng hợp hạt nano môi trường đặc trưng thay đổi màu sắc từ trắng ngà sang nâu Khi thêm ion Ag + vào bề mặt môi trường nuôi cấy kết mẫu hình thành màu nâu, cường độ màu tăng lên thời gian lên men giảm Ag0 (Hình 2a 2b) Kiểm sốt (khơng có bạc nitrat) cho thấy khơng có hình thành màu sắc nuôi cấy thời gian điều kiện nuôi cấy Trong thay đổi màu sắc bề mặt môi trường nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian lên men, môi trường nuôi cấy cần thời gian lâu để tạo màu Tổng hợp hạt nano bạc phụ thuộc vào thời kỳ lên men môi trường nuôi cấy 3.2 Đặc tính hạt nano bạc Sự xuất màu nâu rõ rệt hình thành hạt nano bạc hỗn hợp phản ứng việc giảm hiệu ion Ag xảy ngoại bào so với nuôi cấy nội bào Các kiến thức việc giảm ion bạc hình thành hạt nano bạc không rõ ràng, tin phân tử protein enzyme, bao gồm enzyme reductase nitrat hoạt động chất điều hòa tốt tổng hợp hạt nano bạc Dung dịch màu tạo cho phép đo độ hấp thụ bước sóng riêng biệt để phù hợp với hình thành hạt nano bạc Phổ hấp thụ UV / vis tương ứng Hình Dung dịch điều chỉnh (khơng có dung dịch bạc nitrat) cho thấy khơng có rõ ràng hấp thụ khoảng 300 đến 900 nm Các mẫu tiếp xúc với dung dịch bạc nitrat cho thấy phổ rộng khoảng 390 đến 410 nm Sự diện cộng hưởng rộng cho thấy kết hợp hạt nano bạc dung dịch Thấy 370 nm tương ứng với chuyển động ngang plasmon hạt nano bạc, đỉnh 390 nm kích thích dao động plasmon theo chiều dọc Phổ với dải dải liên kết với cộng hưởng plasmon bề mặt kim loại bạc nano kích cỡ, xác nhận xuất hạt nano bạc dung dịch nuôi cấy sau tiếp xúc với tia UV Sự tổng hợp sinh học hạt nano kim loại có liên hệ trực tiếp với ảnh hưởng giai đoạn khác phát triển vi sinh vật Sinh khối tối đa thu giai đoạn mũ trung gian (giai đoạn đầu pha tĩnh) tổng hợp tối đa hạt nano thu thời kỳ lên men (Hình 4) [12] Báo cáo tổng hợp tối đa hạt nano thu môi trường giai đoạn tĩnh, điều tra chúng tơi trì kết tương tự Đồng thời kết đồng ý với [14], cho thấy tổng hợp sulfua cadmium tối đa giai đoạn tĩnh Các kết hỗ trợ nghiên cứu trước cho thấy hạt nano bạc hình thành có hoạt động tối đa giai đoạn tĩnh Bacillus licheniformis [15] Kết thí nghiệm giải thích tế bào giai đoạn hàm mũ (sinh sản tối đa vi sinh vật) tạo hoạt tính tối đa enzym tham gia vào việc kết hợp giảm ion bạc để tạo hạt nano bạc Lập tài khoản cho kết điều tra cung cấp ý tưởng sản xuất hạt nano bạc, đặc tính 139 phát triển vi sinh vật tiếp xúc với dung dịch bạc nitrat giải thích hạt nano bạc sản xuất sản phẩm liên kết tăng trưởng 3.3 Máy phân tích cỡ hạt Máy phân tích kích thước phân tử laser nhiễu xạ cung cấp chi tiết chất hạt, chẳng hạn phân tán đơn lẻ, không làm xáo trộn đa phân tán Nghiên cứu cho thấy hạt nano hỗn hợp đa phân tán có kích cỡ khác khoảng 40 đến 60 nanomét (dữ liệu không hiển thị) Kết chúng tơi có tương đồng với báo cáo sản xuất kích thước hạt nano thay đổi gần 100 nm giải pháp có phân tử nano phân tách polydi Kích thước hạt dao động từ 35 đến 45 nm giai đoạn phát triển khác tế bào điều kiện lên men kim loại khác Công việc tương lai tập trung vào việc kiểm sốt kích thước hạt cách thay đổi thành phần môi trường tính chất hóa lý KẾT LUẬN Chúng tơi chứng minh q trình cơng nghệ sinh học đơn giản để tổng hợp nội bào ngoại bào hạt nano bạc cách sử dụng dòng vi khuẩn Sự hình thành hạt nano sử dụng môi trường khác nghiên cứu tới; mơi trường LB có khả tối đa hóa việc tổng hợp hạt nano bạc Đặc tính ion bạc tiếp xúc với dòng vi sinh vật tính khử bạc nitrat hạt nano bạc khẳng định phổ quang phổ UV Sự tổng hợp hạt nano bạc tối đa sản sinh sinh khối tối đa xảy pha tĩnh thời kỳ lên men Nó cho thấy hạt hình thành từ mơi trường định liên kết với sinh trưởng Sự hình thành ngoại bào hạt nano bạc thể nhiều hình thành nội bào Ngoài ra, tổng hợp ngoại bào làm cho trình dễ dàng cho trình xử lý hạ nguồn Hơn nữa, nghiên cứu để hiểu cấu thể cấu trúc để dự đốn hình dạng hạt nano thí nghiệm tương lai Thêm vào nghiên cứu ứng dụng hoạt tính kháng khuẩn hạt nano bạc ... kim loại Sinh tổng hợp hạt nano giúp tiến tới “hóa học xanh” kết nối cơng nghệ nano công nghệ vi sinh 2.2.1 Khái quát 2.2.1.1 Cơ chế Cơ chế trình tổng hợp nano bạc vi sinh vật chưa tìm hiểu tường... hóa vi c tổng hợp hạt nano bạc Đặc tính ion bạc tiếp xúc với dòng vi sinh vật tính khử bạc nitrat hạt nano bạc khẳng định phổ quang phổ UV Sự tổng hợp hạt nano bạc tối đa sản sinh sinh khối tối... liệu tổng hợp sinh học hạt nano bạc từ nấm Sử dụng vi khuẩn trình sản xuất sinh học có lợi hơn, dễ dàng xử lý nấm Trong nghiên cứu này, sản xuất vi sinh hạt nano bạc tìm hiểu cách sử dụng chủng vi