GIÁO TRÌNH VI SINH THỰC PHẨM

PHẦN I – LÝ THUYẾT Bài 1: Hình thái, cấu tạo yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động sống vi sinh vật Hình thái, cấu tạo vi sinh vật Vi sinh vật sinh vật vô nhỏ bé mà mắt thường nhìn thấy mà phải quan sát kính hiển vi Vi sinh vật gồm: vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam; nấm men, nấm mốc, tảo, nguyên sinh động vật 1.1 Hình thái, cấu tạo vi khuẩn Vi khuẩn (bacteria) nhóm vi sinh vật có nhiều hình dạng, có nhân nguyên thủy sinh sản cách phân đơi Các nhóm vi khuẩn Kích thước Cầu khuẩn Đường kính 0,5 – micromet Hình dạng Hình tròn, ovan, Gồm nhóm: - Đơn cầu khuẩn: Micrococcus - Song cầu khuẩn Diplococcus - Tứ cầu khuẩn: Tetracoccus - Bát cầu khuẩn: Sarcina - Tụ cầu khuẩn: Staphylococcus - Liên cầu khuẩn: Streptococcus 0,5-1 x 1-4 micromet Hình que Gồm nhóm: -Bacillus: Gram (+), sinh bào tử -Bacterium: Gram (-), khơng sinh bào tử, thường có chu mao - Pseudomonas: Gram (-), khơng sinh bào tử, có tiêm mao - Corynebacterium: Gram (+), không sinh bào tử, có hình dạng thay đổi tùy loại - Clostridium: Gram (+), sinh bào tử hình thoi hình dùi trống (0,5-3)x(5-40) µm Là vi khuẩn có từ hai vòng xoắn trở lên, Gram (+) (0,5-3)x(5-10) µm Là vi khuẩn có hình dấu phẩy, vòng xoắn Trực khuẩn Xoắn khuẩn Phẩy khuẩn Cấu tạo vi khuẩn: Gồm màng nhầy (màng tế bào) có vai trò trì áp suất thẩm thấu, khống chế vận chuyển, trao đổi vào chất dinh dưỡng sản phẩm trao đổi chất, sinh tổng hợp chất, tiến hành phosphoryl hóa phosphoryl quang hợp, Tế bào chất gồm toàn phần nằm màng tế bào, vùng dịch thể dạng keo tế bào non có cấu trúc phức tạp tế bào già Gồm chất tương bào chứa enzim, quan mesosome, ribosome, không bào, hạt sắc tố, chất dự trữ Chất nhân Bào tử Tiên mao nhung mao Hình 1: Cấu tạo vi khuẩn 1.2 Hình thái, cấu tạo nấm men Hình dạng:hình cầu, hình trứng, hình oval, Cấu tạo: gồm màng tế bào, tế bào chất: lưới nội chất, nhân, ribosome, ty thể, lysosome, golgi Hình 2: Hình dạng cấu tạo nấm men 1.3 Hình thái, cấu tạo nấm mốc Hình sợi Sinh sản bào tử, có dạng: bào tử đính, bào nử nang, Hình 3: Hình thái nấm mốc Ảnh hưởng yếu tố lý học sinh trưởng , phát triển vi sinh vật ứng dụng bảo quản chế biến thực phẩm 2.1Ảnh hưởng tác nhân vật lý Độ ẩm Hoạt động sống vi sinh vật liên quan đến nước tỷ lệ nước tế bào chúng cao Nấm men 73-82%, nấm mốc 84- 90%, vi khuẩn 75-85% Vì thiếu nước tế bào bị chết tượng loại nước khỏi tế bào Sự đề kháng vi sinh vật với trạng thái khô phụ thuộc vào: +Nguồn gốc vi sinh vật: vi sinh vật không khí chịu khơ tốt vi sinh vật đất, nước +Loại hình vi sinh vật: đề kháng với trạngthái khơ nhóm xạ khuẩn > vi khuẩn > nấm mốc +Trạng thái tế bào:tế bào già, tế bào có nha bào đề kháng đè kháng tốt tế bào khơ, tế bào khơng có nha bào Do vi khuẩn cần độ ẩm định để sinh trưởng nên cách phơi khơ sấy khơ, ta bảo quản lâu dài nhiều loại sản phẩm (hoa khô, cỏ khô, ruốc thịt khô, ) Nhiệt độ Hoạt động trao đổi chất vi khuẩn coi kết phản ứng hóa học Vì phản ứng phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ, nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến trình sống tế bào Tế bào thu nhiệt độ chủ yếu từ mơi trường bên ngồi, phần thể thải ra, kết hoạt động trao đổi chất Như nói trên, hoạt động vi sinh vật bị giới hạn môi trường chứa nước dạng hấp thụ Vùng nước nằm từ 20 đến khoảng 1000 gọi vùng sinh động học Hầu hết tế bào sinh dưỡng vi sinh vật bị chết nhiệt độ cao protein bị biến tính, hàng loạt enzyme bị bất hoạt Các enzyme hô hấp đặc biệt enzyme chu trình Krebs mẫn cảm với nhiệt độ Sự chết vi khuẩn nhiệt độ cao hậu bất hoạt hóa ARN phá hoại màng tế bào chất (nói chung acid nucleic mẫn cảm với nhiệt độ so với enzyme) Nhiệt độ thấp: (dưới vùng sinh động học) làm bất hoạt chất vận chuyển chất hòa tan qua màng tế bào chất, thay đổi cấu hình khơng gian permease chứa màng ảnh hưởng đến việc hình thành tiêu thụ ATP cần cho trình vận chuyển chủ động chất dinh dưỡng Vi khuẩn thường chịu đựng nhiệt độ thấp Ở nhiệt độ điểm băng thấp chúng hoạt động trao đổi chất rõ rệt Nhiệt độ thấp coi yếu tố chế khuẩn làm lạnh nhanh Trong trường hợp làm lạnh xuống điểm băng, cấu trúc tế bào bị tổn hại tinh thể băng tạo thành kích thước nhỏ, tế bào không bị phân hủy Nếu làm lạnh chân không, tinh thể băng thăng hoa, phương pháp đơng khơ vi sinh vật Nhiệt độ cao: Nhiệt độ cao 65oC gây tác hại cho vi sinh vật nhiệt độ 100 oC vi sinh vật bị tiêu diệt gần hết thời gian định Đó nhiệt độ cao làm biến tính protein tế bào, enzyme bất hoạt, mang tế bào bị phá hủy tế bào bị đốt cháy hồn tồn Tác dụng nhiệt độ cao vi sinh vật có quan hệ với nhân tố khác thời gian tác động, sức chịu nhiệt vi sinh vật , sức chịu nhiệt phụ thuộc vào chất tế bào tính di truyền, tuổi có hay khơng có nha bào sau tồn chúng mơi trường có độ pH, thẩm áp hợp chất hữu khác Đây sở việc khử trùng nhiêt độ cao có hiệu Giới hạn nhiệt độ cực tiểu nhiệt độ cực đại vùng nhiệt sinh trưởng vi sinh vật Giới hạn khác loài vi khuẩn: tương đối rộng vi khuẩn hoại sinh hẹp vi khuẩn gây bệnh Tùy theo quan hệ với vùng nhiệt chia vi khuẩn thành số nhóm + Vi khuẩn ưa lạnh: sinh trưởng tốt nhiệt độ 20 oC thường gặp nước biển, hồ sâu suối nước lạnh, chẳng hạn vi khuẩn phát quang, vi khuẩn sắt, hoạt tính trao đổi chất vi khuẩn thấp Trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhiều vi khuẩn ưa lạnh dễ dàng thích ứng với nhiệt độ cao + Vi khuẩn ưa ấm: chiếm đa số, cần nhiệt độ khoảng 20- 400C Ngồi dạng hoại sinh ta gặp dạng ký sinh gây bệnh cho người động vật, chúng sinh trưởng tốt 37 oC (tương ứng với nhiệt độ thể người động vật) + Vi khuẩn ưa nóng: giới hạn nhiệt độ sinh trưởng 30-70 oC, thích hợp 55-60oC gồm vi sinh vật sinh trưởng đất, phân rác, suối nước nóng Các vi khuẩn ưa nóng gồm chủ yếu xạ khuẩn, vi khuẩn sinh bào tử Thường gặp chúng suối nước nống, phân ủ Các giới hạn nhiệt độ cực tiểu, tối thích cực đại trình bày bảng sau Các lồi Bacillus sống đất, thường có nhiệt độ sinh trưởng rộng (15 – 40 oC) Vi khuẩn E coli có nhiệt độ sinh trưởng 10 - 47,5oC Vi khuẩn gây bệnh lậu gonococcus phát triển nhiệt độ 36 – 40 oC Năm 1983 J A Baross phát có lồi vi khuẩn ưa nhiệt, sinh trưởng thích hợp 25 – 30oC Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu áp lực thủy tĩnh ảnh hưởng đến phát triển tế bào vi khuẩn Màng tế bào vi khuẩn màng bán thấm việc điều chỉnh thẩm áp qua hệ thống permease có liên quan đến màng Trong môi trường ưu trương tế bào khả hút nước chất hòa tan, tế bào chịu trạng thái khô sinh lý, bị co nguyên sinh chất chết kéo dài Trong thực tế người ta áp dụng tượng để bảo quản cá muối, muối dưa, bảo quản trái Ngược lại đưa vi khuẩn vào dung dịch nhược trương nước xâm nhập vào tế bào, áp lực bên tế bào tăng lên Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt mơi trường chứa 20% muối Nồng độ muối cao có hại cho tế bào, có loại vi khuẩn sinh trưởng tốt môi trường chứa 30% muối, ta gọi chúng vi khuẩn ưa muối, nhiều vi khuẩn biển thuộc nhóm Chúng phát triển tốt mơi trường có nồng độ đường cao gọi vi khuẩn ưa đường Sóng siêu âm Sóng âm đặc biệt vùng siêu âm có ảnh hưởng lớn đến phát triển vi khuẩn Với tần số 8.800-8.900Hz xử lý 40-60 phút giảm 99% vi khuẩn Các tế bào sinh dưỡng bị chết nhanh chóng, tế bào non mẫn cảm nhiều so với tế bào già Mẫn cảm tác dụng sóng siêu âm lên tế bào hình sợi, mẫn cảm tế bào hình cầu Nhưng sóng siêu âm khơng có tác dụng với bào tử tế bào vi khuẩn kháng acid Do tác dụng siêu âm mà độ nhớt môi trường tăng lên, xuất chất nâng cao sức căng bề mặt nguyên sinh chất hình thành bọt khí nhỏ Kết tế bào bị hủy hoại Hiện người ta ứng dụng siêu âm để thu nhận chế phẩm vô bào để tách enzyme nội bào, phân lập số thành phần tế bào, riboxom, thành tế bào màng tế bào chất Sức căng bề mặt Khi sinh trưởng môi trường dịch thể, vi khuẩn chịu ảnh hưởng sức căng bề mặt môi trường Đa số môi trường dịch thể dùng phòng thí nghiệm có sức căng bề mặt khoảng 5,7- 0,63 mN/cm Những thay đổi mạnh mẽ sức căng bề mặt làm ngừng sinh trưởng làm chết tế bào Khi sức căng bề mặt thấp, thành phần tế bào bị tách khỏi tế bào Điều chứng tỏ thành tế bào bị tổn thương Các chất nâng cao sức căng bề mặt, hầu hết muối vô cơ, chất làm giảm sức căng bề mặt hầu hết acid béo, anchol, chất gọi chất có hoạt tính bề mặt Tác dụng chúng thể việc làm thay đổi đặc tính bề mặt tế bào vi khuẩn, trước hết nâng cao tính thấm tế bào Trong thực tế người ta ứng dụng tượng nuôi cấy vi khuẩn kháng acid Khác với vi khuẩn khác, vi khuẩn kháng acid, có bề mặt kỵ nước giảm sức căng bề mặt môi trường kích thích sinh trưởng chúng Sức căng bề mặt ngăn cản vi khuẩn gắn vào bề mặt cứng, tránh cho chúng khỏi cạnh tranh sinh trưởng Tia xạ Ánh sáng gây biến đổi hóa học tổn thương sinh học, tế bào hấp thu Mức độ gây hại tùy thuộc vào mức lượng lượng tử ánh sáng hay tùy thuộc vào chiều dài bước sóng ánh sáng Các tia xạ gây nên biến đổi hóa học nguyên tử phân tử có chiều dài sóng khoảng 10000 A0 Thuộc loại sau: ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại, tia X, tia Gamma tia vũ trụ, tia sáng có frnăng lượng lớn Khi vật chất hấp phụ chúng làm bắn electron từ vật chất Vì tia gọi tia xạ ion hóa Những xạ với chiều dài bước sóng lớn có lượng q nhỏ, khơng đủ gây nên biến đổi hóa học tác dụng biểu chủ yếu nhiệt tia hồng ngoại Ánh sáng mặt trời: Là nguồn tia sáng chiếu tự nhiên có tác dụng phá hủy tế bào vi khuẩn (ngoại lệ vi khuẩn quang hợp sử dụng ánh sáng mặt trời làm nguồn lượng) Tác dụng bị yếu vi khuẩn chứa sắc tố hay vỏ nhầy Ánh sáng mặt trời gián tiếp tác động lên tế bào làm biến đổi môi trường Chẳng hạn, tụ cầu khuẩn Staphylococcus không sinh trưởng môi trường thạch bị chiếu tia sáng mặt trời vài Ảnh hưởng ánh sáng mặt trời lên tế bào vi khuẩn tăng cường xử lý tế bào số thuốc nhuộm (metylen, ) Người ta gọi tượng có tác dụng quang động học ánh sáng Tia tử ngoại (tia cực tím -UV): So với xạ ion tia tử ngoại có lượng nhỏ Khi bị vật chất hấp phụ, tia tử ngoại không gây nên tượng ion hóa kích thích phân tử, nghĩa chuyển điện tử đến mức cao Tác dụng mạnh tia tử ngoại là vùng có chiều dài bước sóng khoảng 254-260 nm nghĩa vùng hấp thụ cực đại acid nucleic nucleoprotein Dưới ảnh hưởng tia tử ngoại, vi khuẩn bị chết bị đột biến theo loại vi khuẩn liều lượng chiếu, bào tử mốc có sức đề kháng cao Điều đáng ý hư hại tia tử ngoại gây cho tế bào phần có tính đảo ngược Nếu sau chiếu tia tử ngoại, ta lại cho vi khuẩn chịu tác dụng ánh sáng ban ngày, nhiều vi khuẩn có khả sống sót tiếp tục phân chia Tia sáng mặt trời có chứa phần tia tử ngoại phần lớn tia bị khí (mây, ozon, ) giữ lại Vì ánh nắng có tác dụng diệt khuẩn nhỏ so với tia tử ngoại dùng phòng thí nghiệm Do lực xun sâu tia tử ngoại kém, xuyên qua lớp nước thủy tinh mỏng nên thường sử dụng khử trùng khơng khí, buồng cấy vi sinh vật, phòng mổ 2.1.1 Ứng dụng bảo quản chế biến thực phẩm Dưới tác động yếu tố lý học, tế bào vi sinh vật bị ức chế phần hồn tồn Trên sở đó, người ta áp dụng phương pháp vật lý để bảo quản thực phẩm khỏi tác hại vi sinh vật Thanh trùng, tiệt trùng sản phẩm: sử dụng nhiệt độ cao để tiêu diệt vi sinh vật Khử trùng dụng cụ, buồng cấy tia UV Bảo quản rau cách ướp đường, ướp muối… 2.2 Ảnh hưởng yếu tố hóa học đến sinh trưởng, phát triển vi sinh vật ứng dụng bảo quản chế biến thực phẩm 2.2.1 Ảnh hưởng yếu tố hóa học sinh trưởng, phát triển vi sinh vật Độ pH Độ pH có quan hệ lớn sinh trưởng VSV Giới hạn pH sinh trưởng: khoảng pH từ cực tiểu đến cực đại mà vsv có khả sinh trưởng Trong khoảng pH có pH thích hợp nhất, vsv có sinh trưởng phát triển cao Tác dụng pH có ảnh hưởng trực tiếp đến trình trao đổi chất tế bào pH cần cho hoạt động nhiều enzyme, nồng độ ion H ảnh hưởng trực tiếp đến độ hòa tan số muối khống K, Na, Mg… ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển vsv Đa số vsv thích ứng pH từ 4,5 đến 9,0, tùy chủng giống vsv khác mà thích ứng khác Ví dụ: Rhizobium , pH thích hợp 6,5 đến 7,5 Saccharomyces, pH thích hợp 4,0 đến 6,0 Điện oxi hóa khử Trong hoạt động sống vsv chịu ảnh hưởng lớn điện oxi hóa khử mơi trường, thường vsv yếm khí chịu rH2 thấp từ 0-12 vôn, vsv hảo khí từ 10-30 vơn Tùy chủng giống vsv khác mà chịu rH2 khác 2.2.1.1 Các chất sát trùng, ức chế, diệt khuẩn Chất sát trùng chất giết chết vsv gây bệnh không gây bệnh không giết chết nha bào Chất ức chế chất làm ngừng q trình sinh trưởng, phát triển, vsv khơng bị giết chết mà trạng thái tiềm tàng Chất diệt khuẩn chất giết chết tồn vi khuẩn kể nha bào Ví dụ: HgCl, AgNO 3, CuSO4… Một chất vừa chất sát trùng, ức chế hay diệt khuẩn… tùy thuộc vào nồng độ, thời gian, loại vsv tác động yếu tố khác 2.2.1.2 Các chất hóa trị liệu Các chất hóa trị liệu gồm chất tổng hợp phương pháp hóa học, có tác dụng độc vsv không gây hại cho động vật Các chất hóa trị liệu có hoạt tính cao nên tranh chỗ phản ứng sinh tổng hợp tế bào, hình thành nên hợp chất không cần thiết cho thể làm cho phản ứng sinh hóa tế bào bị kìm hãm, gây ức chế trình sinh trưởng, phát triển tế bào vi khuẩn Ví dụ: sunfolamit Các chất kháng sinh Kháng sinh chất vsv sinh ra, nồng độ thấp, kháng sinh có khả ức chế tiêu diệt vsv cách đặc hiệu, kháng sinh tác động lên vi khuẩn nhóm vi khuẩn cách gây rối loạn phản ứng sinh vật ngưỡng phân tử Cơ chế tác động thuốc kháng sinh lên vsv: + Ức chế sinh tổng hợp phá hủy vách tế bào, nên vi khuẩn sinh khơng có vách tế bào, bị tiêu diệt + Gây rối loạn chức màng nguyên sinh, đặc biệt chức thẩm thấu, chọn lọc, làm ngừng trình trao đổi chất + Làm ngừng trình tổng hợp protein + Gây ức chế tổng hợp axit nucleic, ngăn cản chép AND, ngăn cản ính tổng hợp ARNpolimeraza, tức ức chế sinh tổng hợp chất cần thiết cho tế bào Tùy chủng giống vsv khác mà khả chịu loại thuốc liều lượng kháng sinh khác 2.2.2 Ứng dụng bảo quản chế biến thực phẩm Căn vào tác động chất hóa học lên tế bào vi sinh vật mà có cách bảo quản chế biến thực phẩm khác Ứng dụng giảm pH để bảo quản rau sản phẩm rau dầm giấm, rau muối chua Sử dụng số chất bảo quản có chất chất ức chế vi sinh vật… Bài 2: Sự phân giải hợp chất hữu tác dụng Vi sinh vật ứng dụng công nghiệp Sự phân giải hợp chất hữu có Nitơ Nitrogen cycle chu trình nitơ, tuần hồn nitơ sinh vật mơi trường Nitơ dạng khí khí sử dụng trực tiếp số vi sinh vật (clostridium) số tảo lam (nostoc) Chúng biến đổi nitơ thành dạng amon, nitrit nitrat, chất sau giải phóng vào đất q trình tiết phân giải Có cách khác để niư tơ khí quyền cố định nhờ tia lửa điện sấm sét Phần lớn thực vật sử dụng nitơ dạng nitrat, trừ số thực vật cộng sinh với vi khuẩn nốt sần Rhizobium sinh vật khác tạo nốt sẵn rễ Khi thực vật động vật chất nitơ hữu chúng biến đổi trở lại thành dạng nitrat q trình gọi nitrat hố Một phần nitrat thực vật hấp thụ, phần bị trình khử nitrit tình rửa trơi Sự tăng cường sử dụng phân bón nông nghiệp (nitrat amon) trở thành nhân tố quan trọng chu trình nitơ x.nitrogen fixation 1.1 Vai trò vi sinh vật vòng tuần hồn Nitơ Trong mơi trường tự nhiên, nitơ tồn dạng khác nhau, từ nitơ phân tử dạng khí hợp chất hữu phức tạp có thể động, thực vật người Trong thể sinh vật, nitơ tồn chủ yếu dạng hợp chất đạm hữu protein, axit amin Khi thể sinh vật chết đi, lượng nitơ hữu tồn đất Dưới tác dụng nhóm vi sinh vật hoại sinh, protein phân giải thành axit amin Các axit amin lại nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3 NH4+ gọi nhóm vi khuẩn amơn hố Q trình gọi khống hố chất hữu qua nitơ hữu chuyển thành dạng nitơ khoáng Dạng NH 4+ chuyển hố thành dạng NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hoá Các hợp chất nitrat lại chuyển hố thành dạng nitơ phân tử, q trình gọi phản nitrat hố thực nhóm vi khuẩn phản nitrat Khí nitơ cố định lại tế bào vi khuẩn tế bào thực vật sau chuyển hố thành dạng nitơ hữu nhờ nhóm vi khuẩn cố định nitơ Như vậy, vòng tuần hồn nitơ khép kín Trong hầu hết khâu chuyển hố vòng tuần hồn có tham gia nhóm vi sinh vật khác Nếu hoạt động nhóm ngừng lại, tồn chuyển hố vòng tuần hồn bị ảnh hưởng nghiêm trọng 1.2 Quá trình amơn hố Trong thiên nhiên tồn nhiều dạng hợp chất nitơ hữu protein, axit amin, axit nucleic, urê Các hợp chất vào đất từ nguồn xác động, thực vật, loại phân chuồng, phân xanh, rác rưởi Thực vật khơng thể đồng hố dạng nitơ hữu phức tạp trên, sử dụng sau q trình amơn hố Qua q trình amơn hố, dạng nitơ hữu chuyển hoá thành dạng NH4+ NH3 1.3 Sự amơn hố urê Urê có thành phần nước tiểu người động vật, chiếm khoảng 2,2% nước tiểu Urê chứa tới 46,6% nitơ, nguồn dinh dưỡng đạm tốt với trồng Tuy nhiên, thực vật khơng thể đồng hố trực tiếp Urê mà phải qua q trình amơn hố Q trình amiin hố Urê chia làm giai đoạn, giai đoạn đầu tác dụng enzym ureaza tiết vi sinh vật Urê bị thuỷ phân tạo thành muối cacbonat amoni, giai đoạn cacbonat amoni chuyển hoá thành NH 3, CO2 H2O: Trong nước tiểu có axit uric, tồn đất thời gian axit uric bị phân giải thành urê axit tactronic Sau urê tiếp tục bị phân giải thành NH3 Nhóm vi sinh vật phân giải Urê axit uric có khả amơn hố cyanamid canxi loại phân bón hố học Chất sau vào đất bị chuyển hoá thành Urê sau qua q trình amơn hố chuyển thành NH3: Nhiều lồi vi khuẩn có khả amơn hố Urê, chúng tiết enzym ureaza Trong có số lồi có hoạt tính phân giải cao Planosarcina ureae, Micrococcus ureae, Bacillus amylovorum, Proteus vulgaris Một số lồi vi khuẩn có khả amơn hoá Urê Đa số vi sinh vật phân giải Urê thuộc nhóm háo khí kỵ khí khơng bắt buộc, chúng ưa pH trung tính kiềm Bởi sử dụng Urê làm phân bón người ta thường kết hợp với bón vơi tro, đồng thời xới xáo làm thống đất 1.4 Sự amơn hố protein Khác với lên men, chất trình thối rữa protein Protein thành phần quan trọng xác động vật, thực vật vi sinh vật Protein thường chứa khoảng 15,0 - 17,6% nitơ (tính theo chất khô) Nếu tổng lượng cacbon thể sinh vật sống mặt đất vào khoảng 700 tỉ tổng lượng nitơ tới 10 - 25 tỉ Trong lớp đất sâu 30 cm bao quanh Trái Đất người ta thấy thường xuyên có khoảng - 7,5 tỉ nitơ mà phần lớn tồn hợp chất hữu chứa nitơ Sự phân giải hợp chất hữu chứa nitơ có ý nghĩa lớn nơng nghiệp vòng tuần hồn vật chất tự nhiên Người ta gọi q trình phân giải q trình amơn hố Muốn phân giải protein, giống hợp chất cao phân tử khác, vi sinh vật phải tiết enzym phân giải protein ngoại bào làm chuyển hoá protein thành hợp chất có phân tử nhỏ (các polipeptit oligopeptit) Các chất tiếp xúc phân huỷ thành axit amin nhờ peptidaza ngoại bào, xâm nhập vào tế bào vi sinh vật sau chuyển hoá thành axit amin Một phần axit amin vi sinh vật sử dụng trình tổng hợp protein chúng, phần khác tiếp tục phân giải theo đường khác để sinh NH3, CO2 nhiều sản phẩm trung gian khác Những vi sinh vật khơng có khả sinh enzym phân giải protein ngoại bào rõ ràng khơng có khả đồng hố loại protein thiên nhiên Chúng sử dụng sản phẩm thuỷ phân protein (polipeptit, oligopeptit, axit amin) + Một số axit amin bị deamin hoá VSV nhờ enzym deaminaza, số phản ứng, sản phẩm cuối amơn, ví dụ: Đối với axit amin có vòng Triptophan, phân giải tạo thành hợp chất có mùi thối Indo vàScaton Khi phân giải axit amin chứa S Metionin, Xistin, vi sinh vật giải phóng H2S, chất độc trồng Một số hợp chất amin sinh q trình amơn hố có tác dụng độc người động vật Ví dụ histamin, acmatin ngun nhân bị nhiễm độc ăn thịt cá thiu thối thịt hộp để lâu (ô nhiễm thực phẩm) Tỷ lệ C : N đất quan trọng nhóm vi sinh vật phân huỷ protein Nếu tỷ lệ cao, đất đạm vi sinh vật tranh chấp thức ăn đạm trồng, chúng phân huỷ hấp thụ hết vào tế bào Nếu tỷ lệ C : N thấp, đạm dư thừa, trình phâ huỷ chậm lại, trồng khơng có đạm khống mà hấp thụ Nhiều cơng trình nghiên cứu rút tỷ lệ C:N 20 thích hợp cho q trình amơn hố protein, có lợi trồng Nhiều vi sinh vật có khả amơn hố protein Trong nhóm vi khuẩn có Bacillus mycoides, Bacillus mesentericus, B subtilis, Pseudomonas fluorescens, Clostridium sporogenes Xạ khuẩn có Streptomyces rimosus, Stretomyces griseus Vi nấm có Aspergillus oryzae, A flavour, A niger, Penicilium camemberti v.v Ngoài protein ure, nhiều loài vi sinh vật có khả naăg amơn hố kitin hợp chất cacbon chứa gốc amin Kitin thành phần vỏ nhiều loại côn trùng, giáp xác Hàng năm kitin tích luỹ lại đất với lượng khơng nhỏ Nhóm vi sinh vật phân huỷ kitin có khả tiết enzym kitinaza kitobiaza phân huỷ phân tử kitin thành gốc đơn phân tử, sau gốc amin amơn hố tạo thành NH3 1.5 Q trình nitrat hố Sau q trình amơn hố, NH3 hình thành phần trồng hấp thụ, phần phản ứng với anion đất tạo thành muối amôn Một phần muối amôn trồng vi sinh vật hấp thụ Phần lại oxy hố thành dạng nitrat gọi q trình nitrat hố Trước người ta cho q trình nitrat hố q trình hố học t Sau người ta tìm chất vi sinh vật học Nhóm vi sinh vật tiến hành q trình gọi chung nhóm vi khuẩn nitrat hố bao gồm hai nhóm tiến hành giai đoạn q trình Giai đoạn oxy hố NH4+ thành NO2- gọi giai đoạn nitrat hoá, giai đoạn oxy hoá NO 2- thành NO3- gọi giai đoạn nitrat hoá Giai đoạn nitrit hố Q trình oxy hố NH4+ tạo thành NO2+ tiến hành nhóm vi khuẩn nitrit hố Chúng thuộc nhóm vi sinh vật tự dưỡng hố có khả oxy hố NH 4+ oxy khơng khí tạo lượng: NH4+ + 3/2 O2 → NO2+ + H2O + 2H + Năng lượng Năng lượng dùng để đồng hoá CO2 → Cacbon hữu Enzym xúc tác cho trình enzym q trình hơ hấp háo khí Nhóm vi khuẩn nitrit hoá bao gồm chi khác nhau: Nitrozomonas, Nitrozocystis, Nitrozolobus Nitrosospira chúng thuộc loại tự dưỡng bắt buộc, khơng có khả sống mơi trường thạch Bởi phân lập chúng khó, phải dùng silicagen thay cho thạch Giai đoạn nitrat hóa Quá trình oxy hố NO2- thành NO3- thực nhóm vi khuẩn nitrat Chúng vi sinh vật tự dưỡng hố có khả oxy hố NO 2- tạo thành lượng Năng lượng dùng để đồng hoá CO2 tạo thành đường NO2- + 1/2 O2 → NO3- + Năng lượng Nhóm vi khuẩn tiến hành oxy hoá NO 2- thành NO3- bao gồm chi khác nhau; Niitrobacter, Nitrospira Nitrococcus Ngồi nhóm vi khuẩn tự dưỡng hố nói trên, đất có số lồi vi sinh vật dị dưỡng tiến hành q trình nitrat hố Đó loài vi khuẩn xạ khuẩn thuộc chi Pseudomonas, Corynebacterium, Streptomyces Q trình nitrat hố khâu quan trọng vòng tuần hồn nitơ, nơng nghiệp có nhiều điều bất lợi: Dạng đạm nitrat thường dễ bị rửa trôi xuống tầng sâu, dễ bị vào q trình phản nitrat hố tạo thành khí nitơ làm cho đất đạm Anion NO 3- thường kết hợp với ion H+ đất tạo thành HNO3 làm cho pH đất giảm xuống bất lợi trồng Hơn nữa, lượng NO3 dư thừa đất trồng hấp thu nhiều làm cho hàm lượng nitrat sản phẩm lương thực, thực phẩm cao gây độc cho người Bởi ngày người ta thường hạn chế việc bón phân đạm hố học có gốc nitrat Q trình phản nitrat hóa Các hợp chất đạm dạng nitrat đất dễ bị khử biến thành nitơ phân tử Quá trình gọi q trình phản nitrat hố Nó khác với q trình oxy hố nitrat tạo thành NH 4+ gọi q trình amơn hố Có thể phân biệt hai trình qua sơ đồ sau: Quá trình amơn hố nitrat số vi khuẩn dị dưỡng tiến hành điều kiện hiếu khí có chức cung cấp NH4+ cho tế bào vi khuẩn để tổng hợp axit amin Phản ứng khử NO3 → N2 xảy điều kiện kỵ khí NO3- chất nhận điện tử cuối chuỗi hô hấp kỵ khí, lượng tạo dùng để tổng hợp nên ATP Nhóm vi sinh vật thực trình phản nitrat hố phân bố rộng rãi đất Thuộc nhóm tự dưỡng hố có Thibacillus denitrificans, Hydrogenomonas agilis Thuộc nhóm dị dưỡng có Pseudomonas denitrificant, Micrococcus denitrificanas sống điều kiện kỵ khí (ngập nước) Đối với nơng nghiệp q trình phản nitrat hố q trình bất lợi cho đất đạm Quá trình xảy mạnh điều kiện kỵ khí Oxy có tác dụng ức chế enzym xúc tác cho q trình khử nitrat, enzym nitrat reductaza nitrit reductaza Ở ruộng lúa nước người ta thường làm cỏ xục bùn để hạn chế q trình này, đồng thời bón đạm amơn khơng bón đạm nitrat Trong mơi trường tự nhiên ngồi q trình phản nitrat sinh học nói có q trình phản nitrat hố học thường xảy pH < 5,5 Các q trình khơng có tham gia vi sinh vật: Sự phân giải hợp chất hữu khơng có Nitơ Vòng tuần hồn cacbon tự nhiên Carbon cycle chu trình cacbon : Sự chu chuyển nguyên tố cacbon thể môi trường nhờ hoạt động sống sinh vật hệ sinh thái Cacbon đioxit ( CO 2) khí hay nước sinh vật tự dưỡng hấp thụ biến đổi thành hợp chất hữu phức tạp hyđrat cacbon, protein, lipit thơng qua q trình quang hợp phản ứng sinh hoá Một phần chất tạo thành cấu trúc nên thể thực vật Thực vật động vật hay sinh vật dị dưỡng sử dụng, sau đó, chất tiết xác chết sinh vật bị vi khuẩn phân huỷ đến giai đoạn cuối ( giai đoạn kháng hố ) trả lại Cacbon đioxit cho mơi trường 10 Mực động vật chân đầu phân bố rộng biển, tồn thể mực có lớp da bao phủ bên ngồi, mực bị nhiễm vi sinh vật trình sống Tuy nhiên da mực lại có chất nhớt thích hợp cho vi sinh vật phát triển sau mực chết Về thành phần dinh dưỡng mực thực phẩm giàu dinh dưỡng: protein 17÷19%, lipid 0,2÷0,5%, nước 80%, nhiều chất khoáng vitamin…Cấu tạo thịt mực chặt chẽ cá, tôm nên sau đánh bắt mực lâu hư, thối b Hệ vi sinh vật mực dạng hư hỏng Dạng hư hỏng phổ biến mực chủ yếu dạng thối rữa Về chế thối rữa vi sinh vật gây thối rữa giống tôm Các vi khuẩn gây thối rữa chủ yếu Pseudononas flourescens, Clostridium sporogenes, Clostridium putrificus, Proteus vulgaris… Mực khô bị vết màu nấm mấn mốc phát triển tạo thành khuẩn lạc có màu đen, vàng, trắng… c Phương pháp bảo quản mực Mực chủ yếu bảo quản đông lạnh phơi khô Hệ vi sinh vật động vật thân mềm a Đặc điểm động vật thân mềm Động vật thân mềm có vỏ cứng đá vơi bao phủ, phần mềm ăn chiếm từ 30÷40%, lượng nước chiếm tới 80%, protein chiếm 17÷19%, gluxid từ 2÷10%, lipid từ 0,2÷0,4% Cấu tạo động vật thân mềm lỏng lẻo nên dễ tiêu hố Vì chúng dễ bị vi sinh vật gây thối phân huỷ b Hệ vi sinh vật thân mềm dạng hư hỏng Sự hư hỏng động vật thân mềm chủ yếu trình thối rữa, ngồi sản phẩm cấp thấp cá, tơm, mực có axit nên tạo thành mùi thối khó chịu Ngồi ướp đơng thịt động vật thân mềm thường có màu vàng q trình oxi hoá c Phương pháp bảo quản động vật thân mềm Người ta thường bảo quản thịt động vật thân mềm phương pháp đông lạnh, sấy khô Bài 5: Vi sinh vật bảo quản chế biến đường bột bánh kẹo Vi sinh vật bột Vi sinh vật bột hai nguồn nhiễm từ hạt (chủ yếu) từ khơng khí, nước, dụng cụ xay xát, đồ chứa đựng… Hạt dùng để xay bột chứa số lựơng vi sinh vật định Trong q trình nghiền phần lớn vi sinh vật bề mặt hạt chuyển vào bột Số lượng vi sinh vật có bột ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng bột vi sinh vật thường nhiều cám bột có chất lượng cao vi sinh vật 21 Trong bột thường có vi khuẩn nấm mốc Trong lồi vi khuẩn thấy tế bào sinh dưỡng hay bào tử trực khuẩn khoai tây (Bacillus mesentericus ) trực khuẩn cỏ khô (Bacillus subtilis) Những trực khuẩn lẫn bột sau gây bệnh khoai tây bánh mì Ngồi gặp E.coli nước dùng để nghiền bột không hợp vệ sinh Ảnh hưởng vi sinh vật đến phẩm chất bột bảo quản Bột tương đối đủ chất dinh dưỡng vi sinh vật dễ sử dụng chất dinh dưỡng để phát triển Hơn bột khơng có tính chất bảo vệ hạt ngun vẹn Vì cần nâng ẩm độ nhiệt độ lên đủ tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển gây hư hỏng bột Trong điều kiện độ ẩm khơng khí 79% nhiệt độ 20 oC, ẩm độ hạt 15% vi sinh vật bột không tăng lên mà chết bảo quản bột thời gian dài Nếu ẩm độ bột cần tăng lên 1-2% vi khuẩn nấm mốc bột phát triển mạnh Tuỳ thuộc vào mức độ nhiễm vi sinh vật bột mà bột bị hư hỏng sau: mốc, tự bốc nóng, chua, ơi… Mốc tượng hay gặp bột Ở ta thấy loài nấm mốc như: Aspergillus, Penicilium mọc bột điều kiện ẩm độ thấp vi khuẩn Bột bị mốc điều kiện ẩm độ khơng khí cao 80%, bột mốc bị giảm phẩm chất nhanh chóng mốc tạo cho bột hôi khử Mùi hôi chủ yếu Penicilium gây Mốc làm tăng độ axit bột, mốc phân huỷ chất béo tạo thành axit tự do, đồng thời làm giảm chất lượng gluten, bị tính đàn hồi thẩm màu Mốc bên lan dần vào bên sau gây tượng tự bốc nóng Mốc tự bốc nóng làm cho bột giảm chất lượng cảm quan bột bị kết vón Bột chua thường lớp bên khác với tượng mốc Nguyên nhân gây bột chua vi khuẩn lactic số vi khuẩn khác lên men đường có bột thành axit khác Kết tạo cho bột có độ chua độ axit bột tăng lên rõ rệt Đường có bột enzyme amylase thân bột vi khuẩn phân huỷ tinh bột tạo thành đường Bột bị ôi oxi hố chất béo bột oxi khơng khí tạo thành chất có vị Để bảo quản bột tốt cần bảo quản bột ẩm độ không khí 79%, ẩm độ bột khơng q 14÷15% điều kiện nhiệt độ ổn định Ở điều kiện giữ bột 3÷5 tháng, điều kiện ẩm độ bột từ 12÷13% giữ năm Vi sinh vật sản xuất bánh mì Quá trình làm bánh mì dựa hàng loạt phản ứng hố sinh nấm men gây chuẩn bị nhào bột nướng bánh Nấm men biến đổi đường bột thành rượu khí cacbonic Khí làm phồng gluten bột làm bánh nở Ngoài nấm men có vi khuẩn lactis Những vi khuẩn hoạt động tạo axit làm giảm pH môi trường tạo điều kiện cho nấm men phát triển Những giai đoạn quan trọng trình làm bánh mì: chuẩn bị nguyên liệu hỗn hợp bột lên men nặn bánh nướng bánh thành phẩm Bột mì làm bánh đánh giá phẩm chất dựa vào hai số tạo khí giữ khí Ngồi cò ý đến độ mịn, màu sắc, độ axit… Vi sinh vật dùng sản xuất bánh mì chủ yếu Saccharomyces cerevisiae a Vi sinh vật làm nở bột nhào tạo hương bánh mì Trong nhào bột có hai trình xảy lên men rượu etylic tạo khí cacbonic nhờ nấm men bánh mì Saccharomyce cerevisiae, với trình tạo axit hữu (chủ yếu axit lactic) nhờ vi khuẩn lactic có bột, sau axit hữu tác dụng với rượu tao este có mùi vị thơm ngon Để làm bánh mì người ta dùng loại men nước, men khơ, men ép từ loài Saccharomyce cerevisiae Những vi sinh vật tạo hương bánh mì: bột nhào có vi khuẩn lactic lên men điển hình khơng điển hình Ngồi axit lactic nhóm lên men khơng điển hình tạo axit bay 22 hơi, khí hydro, khí cacbonic, rượu etylic Các vi khuẩn tạo este axit làm cho bánh mì có mùi thơm đặc biệt Một số vi sinh vật khác: bột có số nấm men tạo màng lẫn vào Candida, Torulopsis Những nấm men có sẵn bột lẫn vào nấm men ướt men ép Những nấm men có áp lực nở thấp, lên men chúng tạo sản phẩm phụ làm cho bánh mì có vị cay Đây nấm men tạp làm giảm chất lượng bột nhào bánh mì Đơi thấy Escherichia aerogenes, dạng trực khuẩn đường ruột phát triển bột nhào, ngồi gặp trực khuẩn khoai tây trực khuẩn cỏ khô Các vi khuẩn có bột nhào làm xấu bánh mì, bào tử chúng ruột bánh không bị chết nướng, gặp điều kiện thuận lợi chúng nẩy mầm phát triển làm hỏng bánh mì b Các chất bổ sung bột nhào ảnh hưởng chúng đến hoạt động vi sinh vật Trong làm bột nhào người ta thường thêm số muối, đường, chất béo Những chất đếu có ảnh hưởng đến hoạt động nấm men bánh mì vi khuẩn lactis Muối ăn: nồng độ muối ăn 0,8% kiềm hãm hoạt lực tạo khí nấm men, làm giảm hoạt lực tạo axit vi khuẩn lactic Đường: thêm 5% đường làm tăng hoạt lực nấm men vi khuẩn lactic, khí tao thành nhiều hơn, thêm đường 10% hoạt lực nấm men vi khuẩn lactic bị giảm Khi thêm 20% đường hoạt lực nấm men vi khuẩn bị ức chế hoàn toàn Chất béo: lượng chất béo cho vào bột nhào 5% không ảnh hưởng đến hoạt lực nấn men Khi nồng độ cao 10% khả tạo khí nấm men hoạt lực vi khuẩn bị giảm Điều giải thích sau chất béo bao phủ tế bào nấm men vi khuẩn lactic làm trở ngại cho trình trao đổi chất c Hệ vi sinh vật bánh mì Hệ vi sinh vật bánh mì bắt nguồn từ bột mì, men bánh mì tạp nhiễm Khi làm bột nhào men bánh mì hoạt động mạnh tao rượu khí cacbonic làm nở bột nhào Khi nắn bánh đem nướng hầu hết vi sinh vật bị tiêu diệt trừ số bào từ chịu nhiệt tồn Khi nướng bánh nhiệt độ bên tới 180÷200 oC, vi sinh vật ngồi vỏ bánh chết hết ruột bánh nóng dần lên khơng q 95÷98 oC tế bào sinh dưỡng vi sinh vật bị chết bào tử chúng sống Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử trực khuẩn khoai tây trực khuẩn cỏ khơ phát triển làm hỏng bánh mì Trong q trình vận chuyển bảo quản bị tạp nhiễm vi sinh vật có trực khuẩn đường ruột nguy hiểm Vì vận chuyển bảo quản cần đảm bảo vệ sinh an toàn d Hư hỏng bánh vi sinh vật Do bánh mì thành phẩm số bào tử trực khuẩn không bị tiêu diệt nướng bánh hay tế bào sinh dưỡng số vi sinh vật tạp nhiễm trình vận chuyển bảo quản Đó ngun nhân gây hư hỏng bánh mì Bệnh nhớt ruột bánh mì vi khuẩn Bacillus : bệnh trực khuẩn khoai tây trực khuẩn cỏ khơ gây Bệnh gọi hỏng nhớt bánh mì Trong bột mì có chất lượng có nhiễm bào tử hai loại trực khuẩn Khi chúng phát triển tiết enzyme protease thuỷ phân protein làm ruột bánh mì bị dính nhớt, thẫm màu có mùi khó chịu Để hạn chế bệnh cần tăng độ axit bột nhào, làm pH giảm xuống khoảng 4,5÷5 kiềm hãm trực khuẩn Bacillus mesentericus Bacillus subtilis phát triển Ruột bánh mì bị đỏ: có số vi khuẩn nấm sinh sắc tố phát triển ruột bánh mì làm ruột bánh mì có màu đỏ Bệnh không nguy hiểm người, thường gặp vi khuẩn Bacillus prodigiosum Mốc bánh mì: bánh mì thường bị mốc bên tạp nhiễm bào tử nấm mốc bảo quản điều kiện nóng ẩm ẩm độ bánh mì cao xếp chặt 23 Bệnh say bánh mì: bệnh nấm Fusarium sporotrichioides có lẫn bột mì từ hạt lúa mì có nấm ký sinh đồng ruộng Nấm chiụ nhiệt cao không bị chết nướng bánh Khi chúng phát triển bánh mì khơng thấy dấu hiệu hư rỏ rệt chúng tiết độc tố ăn phải người bị ngộ độc thấy ngây ngất say rượu Bài 6: Vi sinh vật bảo quản chế biến rau Đặc điểm rau Là thành phần thức ăn thiếu phần ăn, cung cấp nhiều chất dinh dưỡng, hợp chất hữu cơ, đường, tinh bột, vitamin muối khoáng Sản phẩm tươi hay qua chế biến có nhiều dạng: lá, thân, củ, quả, hạt Mỗi loại rau có đặc điểm sinh lý khác Nước chiếm phần lớn rau từ 85 ÷ 90% Trong dịch tế bào có đường, axit hữu cơ, vitamin, khoáng chất sử dụng dễ dàng pH nhỏ 4,5, rau từ 4,5÷5 24 Rau sau hái sống, q trình trao đổi chất hô hấp tác động xấu đến trình bảo quản héo, mềm , dập làm cho vi sinh vật dễ xâm nhập Quả rau tươi có khả miễn dịch thời gian định mơ thành tế bào ngun lớp bảo vệ Có tinh dầu, tanin ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật Hệ vi sinh vật rau a Nguồn lây nhiễm Do hạt giống hay trình chăm bón phân bón hữu hay vi sinh vật đất, khơng khí, nước Do q trình thu hái, vận chuyển chế biến vi sinh vật xâm nhiễm vào rau Thành phần số lượng vi sinh vật nhiễm vào rau phụ thuộc vào loại, điều kiện địa lý thu hái, tình trạng rau b Hệ vi sinh vật rau qủa Thường gặp vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Hoa tươi lành lặn bên coi vô trùng Các hệ vi sinh vật xâm nhiễm vào rau làm hư hỏng, hư hỏng nấm, hư hỏng rau vi khuẩn Hệ vi sinh vật rau gồm hai loại: Vi sinh vật hoại sinh: liên quan đến điều kiện trồng, thu hoạch rau qủa Gồm vi khuẩn gram dương vi khuẩn gram âm: vi khuẩn lactis, vi khuẩn axetic, vi khuẩn gây thối rữa Ngồi có nấm men, nấm mốc dạng bào tử Vi sinh vật hoại sinh từ 10 ÷ 106 tế bào cm2 không gây hư hại rau lành lặn điều kiện thu hái, vận chuyển tốt Vi sinh vật gây bệnh: xuất rau điều kiện định như: chăm bón, thu hái, vận chuyển, giống…Đây vi sinh vật không tìm thấy trực tiếp rau làm giảm sức đề kháng rau công mẹ tạo điều kiện cho vi sinh vật khác công rau sau thu hoạch c Sự hư hỏng rau Nấm mốc nguyên nhân gây hư hỏng rau quả, pH rau nhỏ 4,5 tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển nhanh pH tăng lên vi khuẩn khác công rau Nấm mốc tồn dạng sợi phát triển nhanh rau có nhiều cenlulose, hemicenlulose, pectin Vi sinh vật thường rau bị dập nát sau lan sang rau khác làm hư hỏng rau Nếu độ dập nát rau cao vi sinh vật xâm nhiễm phát triển nhiều phong phú Chúng tiêu thụ nhiều chất khô dịch tế bào nấm mốc xâm hại phá huỷ thành tế bào chảy Sự hư hỏng vi khuẩn: Do nấm men phá vỡ thành tế bào làm cho vi khuẩn xâm nhập phát triển mạnh làm pH giảm nên vi khuẩn gây thối chậm phát triển Cuối làm cho rau có vị chua giảm chất lượng cảm quan d Bảo quản rau qủa + Bảo quản tươi Sư hư hỏng thường số chín cần loại Rau bảo quản nhiệt độ thường mà phải bảo quản nhiệt độ lạnh cho thêm hoá chất bảo quản Các hoá chất bảo quản thường dùng là: khí SO2, axit benzoic, muối benzoat… chất tốt cho bảo quản khơng độc hại Ngồi dùng số hợp chất hữu như: nizin, axit sorbic, muối sorbat… Nizin chất sinh từ kháng sinh độc tố vi khuẩn lactic chúng tiêu diệt vi khuẩn gây thối không độc hại người + Sấy khô Người ta thường sấy khô đến độ ẩm khoảng 15 đến 20% rau đến 10% Ngày thị trường có nhiều sản phẩm sấy khô từ rau + Chế biến Rau qua chế biến thành nhiều sản phẩm phù hợp vị, tạo phong phú đa dạng thức ăn giúp bảo quản lâu Phương pháp thường dùng ngâm đường để chiết suất dịch bào sau 25 đem sử dụng Tuy nhiên dịch bào thường có vi khuẩn lên men nên sản phẩm thường có mùi rượu + Muối chua Phương pháp giúp ta giữ rau lâu hơn, khoảng đến tháng Bản chất trình q trình lên men lactic + Đóng hộp Phương pháp bảo quản rau lâu, khoảng tháng Trước hết tiêt trùng rau nhiệt độ cao, sau đóng hộp trùng Hệ vi sinh vật số sản phẩm rau a Đồ hộp Bị lây nhiểm nguyên nhân sau đây: Do nguyên liệu: trình rửa, ngâm, muối, trùng diệt khoảng 90% lượng vi sinh vật, nhiên 10% vi sinh vật phát triển nhanh gây hư hại đồ hộp Do khâu chuẩn bị đóng hộp: lượng vi sinh vật khơng khí ruồi giấm mang đến, vi sinh vật nhiễm từ công nhân Nguyên nhân gây nhiễn đặc biệt quan trọng đồ hộp gia nhiệt không cao đựng dụng cụ nhựa Ngoài có ngun nhân tiệt trùng trùng khơng kỹ lượng vi sinh vật lại ảnh hưởng đến trình bảo quản Hay yếu tố chủ quan người, giai đoạn trước tiệt trùng kỹ nên giai đoạn sau khơng trùng vi sinh vật xâm nhập phát triển gây hư hại cho sản phẩm đồ hộp Nhóm vi sinh vật đặc trưng vi khuẩn ưa nóng, chịu axit có bào tử: Baccilus sporogenes, Baccilus subtilus, Clostridium botulinum… Sau đóng hộp tượng hư hỏng vi khuẩn lactisc, vi khuẩn axetic dùng đường có lên men tạo thành rượu, axit axetic, axit lactic tạo thành mùi rượu hay vị chua Hay vi khuẩn thuỷ phân thành khí H2S làm đồ hộp phồng lên Ngoài vỏ đồ hộp thường làm vỏ thiếc mơi trường axit hộp bị gỉ làm ảnh hưởng đến chất lượng rau b Muối chua Khi muối chua pH giảm nên môi trường có tính axit cao ức chế vi khuẩn gây thối rữa Tuy nhiên môi trường axit nấm mốc nấm men phát triển gây hư hỏng sản phẩm Khi nấm mốc phát triển làm giảm độ pH môi trường tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối rữa phát triển làm hư hỏng sản phẩm muối chua PHẦN II – THỰC HÀNH Bài thực hành số 1: Tiệt trùng môi trường làm việc dụng cụ 1.Tiệt trùng bề mặt môi trường làm việc Khi làm việc với vi sinh vật, để tránh bị lây nhiễm vi sinh vật không mong muốn môi trường xung quanh, cần phải đảm bảo cho môi trường bề mặt làm việc vô khuẩn - Làm môi trường làm việc 26 - Tiệt trùng bề mặt làm việc cồn 70% propanol 70% Lưu ý: Khi lau cồn, lưu ý khơng bật đèn cồn gây hỏa hoạn - Tủ cấy vơ trùng: tiệt trùng khơng khí đèn UV, quạt lọc gió 2.Tiệt trùng dụng cụ làm việc Có phương pháp để tiệt trùng dụng cụ làm việc + Phương pháp tiệt trùng nhiệt khô: Sấy tủ sấy nhiệt độ 150- 160oC 2,5 đến Dùng cho dụng cụ thủy tinh khơng chứa mơi trường ni cấy (có thể có nắp bông), pipet, hộp petri, que trang, phễu thủy tinh, đũa thủy tinh, … + Phương pháp tiệt trùng nhiệt ẩm: Hấp nồi hấp autoclave nhiệt độ 121oC 20-30 phút Dùng cho dụng cụ kim loại, dụng cụ có nắp cao su, giấy nhơm, màng; dụng cụ nhựa chịu nhiệt; ống bóp cao su; ống nghiệm hay bình thủy tinh có chứa môi trường nuôi cấy; đầu pipetman; ống nghiệm chứa nước để pha loãng… 2.1 Dụng cụ thủy tinh kim loại - Trước tiệt trùng dụng cụ thủy tinh cần làm sấy khô - Ống nghiệm thủy tinh: cần đậy nút không thấm nước, sau gói kín phần đầu ống nghiệm có nút bơng giấy - Bình tam giác: cần đậy kín nút bơng gói phần có nút bơng giấy - Hộp petri cần gói kín giấy - Pipet thủy tinh cần gắn nút bơng nhỏ phần cuối, sau bọc kín giấy - Que trang, đũa thủy tinh cần phải gói kín vào giấy 2.2 Dụng cụ nhựa chịu nhiệt Ống nghiệm có nắp nhựa chịu nhiệt, nắp cao su hay đầu micropipette tiệt trùng nhiệt ẩm 2.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường tiệt trùng nồi hấp tiệt trùng autoclave 121oC 20-30 phút Đối với thành phần môi trường dinh dưỡng nhạy cảm với nhiệt độ cao cần dùng màng lọc vi khuẩn để tiệt trùng Bài thực hành số 2: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật 1.Nguyên lý Môi trường nuôi cấy cung cấp đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cần thiết cho phát triển vi sinh vật Môi trường nuôi cấy cần tiệt trùng trước sử dụng nuôi cấy vi sinh vật Phân loại môi trường nuôi cấy: - Theo cấu trúc: 27 + Môi trường lỏng: thường để nhân giống, lên men hay nghiên cứu đặc tính vi sinh vật; mơi trường lỏng khơng chứa chất làm đặc agar, gelatin… + Môi trường rắn (đặc): có thêm hàm lượng nhỏ agar gelatin vào môi trường lỏng để làm đặc môi trường Môi trường rắn thường dùng để phân lập vi sinh vật, quan sát hình thái khuẩn lạc,… + Mơi trường bán rắn: có cấu trúc dạng dẻo, hàm lượng chất tạo độ đặc với mơi trường rắn Sử dụng để xác định khả chuyển động số vi khuẩn - Theo thành phần: + Môi trường tổng hợp: có thành phần hóa học xác định cách xác + Mơi trường tự nhiên:gồm chất chưa xác định rõ thành phần, khơng có cơng thức hóa học rõ rang VD: peptone, cao thịt, cao nấm men,… + Mơi trường hòa tan chuẩn bị sẵn: hòa tan vào nước hàm lượng định có đủ tất thành phần dinh dưỡng cần thiết Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy 2.1 Chuẩn bị mơi trường lỏng - Cân xác thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy theo hàm lượng định - Hòa tan thành phần lượng nước nhỏ Sau trộn lẫn tất thành phần dinh dưỡng với làm đầy lên thể tích định nước - Kiểm tra pH máy đo pH quỳ tím, dùng NaOH HCl để điều chỉnh pH không với yêu cầu - Phân phối môi trường vào ống nghiệm bình ni cấy, đóng nắp nút không thấm nước - Tiệt trùng - Để nguội bảo quản tủ lạnh Hình Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật 2.2 Chuẩn bị môi trường rắn bán rắn - Nấu chảy agar thể tích nước dùng để pha mơi trường - Cân hòa tan thành phần khác mơi trường ½ lượng nước lại - Trộn lẫn làm đầy lên thể tích cần thiết, sau phân phối vào ống nghiệm bình ni cấy dung dịch nóng Nếu để nguội, agar đặc lại khơng thể rót vào ống nghiệm - Đóng nắp ống nghiệm tiệt trùng giống với môi trường lỏng - Đối với thạch nghiêng: đặt nghiêng mơi trường nóng nguội - Bảo quản môi trường đông đặc tủ lạnh vị trí lật ngược Bài thực hành số 3: Quan sát tế bào vi sinh vật 1.1 - Quan sát tế bào vi khuẩn Làm tiêu cố định Rửa phiến kính xà phòng lau khơ Vẽ hai vòng tròn khơng dính lên mặt phiến kính 28 Nhỏ giọt nước vơ khuẩn lên vòng tròn Hơ đỏ que cấy, làm nguội, sau lấy phần nhỏ sinh khối vi sinh vật lên que cấy Trộn vi sinh vật que cấy vào giọt nước dàn mỏng giọt nước phiến kính Cố định vi sinh vật lên phiến kính cách hơ phiến kính nhanh vài lần qua lửa đèn cồn Chú ý không hơ phiến kính sát đèn cồn làm biến dạng vi sinh vật - Nhỏ vài giọt xanh methylene lên tiêu bản, để phút - Nghiêng phiến kính rửa nước cất hết màu thừa - Để phiến kính khơ tự nhiên khơng khí thấm khơ phiến kính giấy thấm - Quan sát hình thái vi khuẩn vật kính dầu - Sau quan sát xong, lau vật kính dầu 1.2 Làm tiêu giọt ép - Nhỏ giọt mơi trường lỏng có chứa vi khuẩn muốn quan sát lên phiến kính - Lấy kính đậy lên phiến kính cho khơng tạo thành bọt khí kính phiến kính - Quan sát phiến kính kính hiển vi vật kính dầu - Hình Cấu tạo kính hiển vi Quan sát tế bào nấm men Nấm men nhóm vi sinh vật dùng nhiều công nghiệp, hầu hết nấm men đơn bào, khơng chuyển động Hình dạng nấm men thường có hình cầu, hình trứng, hình bầu dục… kích thước 6-10 micromet 2.1Quan sát nấm men sống chết Dựa nguyên tắc: Tế bào chết dễ bắt màu, thuốc nhuộm qua tế bào chết dễ dàng qua màng tế bào sống - Cho vài giọt canh trường nấm men Saccharomyces cerevisiae giọt thuốc nhuộm xanh methylene lên phiến kính - Nhẹ nhàng trộn đều, đậy kính lại để yên 2-3 phút - Quan sát kính hiển vi quang học - Tế bào chết bắt màu xanh tế bào sống không màu 2.2 Quan sát nấm men nảy chồi - Cho giọt canh trường nấm men giọt NaOH H2SO4 10% lên phiến kính - Trộn - Đậy kính lại đặt lên kính hiển vi để quan sát - Tế bào nấm men xem nảy chồi có tế bào bé ½ tế bào mẹ Quan sát tế bào nấm sợi Nấm sợi có tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi khuẩn ty Sợi nấm có khơng có vách ngăn - Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm hộp petri 29 - Lấy miếng băng dính suốt, đặt mặt dính nhẹ lên khuẩn lạc nấm Lấy miếng băng dính áp sát vào phiến kính Quan sát phiến kính kính hiển vi Bài thực hành số 4: Xác định khả phân giải hợp chất hữu vi sinh vật Xác định khả lên men lactic vi khuẩn lactic - Tiến hành: Dưa cải bẹ để héo, rửa sạch, cắt khúc, để Pha nước muối 3- 3.5%, thêm đường Xếp vào lọ ém chặt Lên men nhiệt độ 28 – 30oC 2-3 ngày - Xác định đặc trưng trình 30 + Làm tiêu giọt ép từ nước dưa cải chua để quan sát hình dạng, xếp tế bào vi khuẩn lên men lactic + Định lượng acid lactic phương pháp chuẩn độ Cho vào ống nghiệm 10ml nước dưa, 20 ml nước cất, 1-2 giọt phenolphthalein Lắc thật kỹ để trộn chất Khối lượng acid lactic (trong 10ml dịch lên men) tính bằng: M = V NaOH 0.1N x 0.009 (g) (1 ml dung dịch NaOH tương đương với 0,009g acid lactic) Xác định khả lên men rượu nấm men - Làm môi trường lên men từ nước ép trái : nho, dâu, dứa, mơ v.v từ nước mạch nha - Điều chỉnh độ pH = - - Thanh trùng dịch ép trái theo phương pháp Tyndal khử trùng nồi hấp áp suất 0,75 atm 20 phút o - Để môi trường nguội tới 30 C cấy men giống vào với tỉ lệ - 5% thể tích dịch lên men Đậy nút bình lên men o - Đặt bình có dịch lên men vào tủ ấm 28 - 30 C, sau 1-2 ngày lấy Xác định đối tượng vi sinh vật tham gia: - Làm tiêu giọt ép, giọt treo hay nhuộm đơn để thấy hình dạng tế bào nấm men - Yêu cầu : quan sát tiêu vật kính (x40) kính hiển vi Chú ý nhận biết dấu hiệu đặc trưng hình thái loài Xác định chất lượng men giống trước cho lên men: - Xác định tỉ lệ tế bào nảy chồi dịch men giống phương pháp đếm số lượng tế bào nảy chồi khung đếm Goriaep Xác định tỉ lệ tế bào sống chết tiêu nhuộm sống nấm men (để phân biệt loại tế bào này) - Xác định số lượng tế bào/1ml dịch men giống phương pháp đếm số lượng tế bào khung đêm Goriaep Xác định tốc độ q trình lên men thơng qua lượng CO2 tạo thành : * Nguyên tắc : - Dựa vào phương trình tổng quát trình lên men : C6H12O6 → 2C2H5OH + CO2 + 27kcal - Lượng đường phân giải trình lên men nhiều lượng CO2 tạo lớn - Tốc độ trình lên men lượng CO2 bay từ thể tích mơi trường định khoảng thời gian xác định 3.Xác định khả phân giải protein vi sinh vật 3.1 Thực trình amơn hố prơtit - Cho vào bình tam giác tích 100 - 150ml - 5g thịt + 20 - 30ml nước cất + Một cục đất nhỏ nghiền để cung cấp nguồn vi sinh vật - Đun nóng bình tam giác nhiệt độ 80 - 90 C để diệt tế bào sinh dưỡng giữ lại tế bào mang bào tử 31 - Để bình vào tủ ấm nhiệt độ 27 - 28 C ngày - Kẹp miếng giấy quỳ đỏ miệng ống nghiệm để xác nhận NH3 giải phóng q trình phân giải prôtit 3.2 Xác định đặc trưng q trình a Xác định thành phần lồi vi sinh vật tham gia: - Làm tiêu từ dịch phân giải prôtit sau - ngày - Nhuộm Gram hay nhuộm đơn vết bôi - Quan sát tiêu vật kính dầu (x 100) kính hiển vi b Các phản ứng định tính số sản phẩm chủ yếu q trình phân giải prơtit * Ngun tắc: Dựa phản ứng màu, phản ứng kết tủa đặc trưng sản phẩm trình phân giải prơtit với hố chất khác để xác nhận có mặt chúng trình * Cách tiến hành: - Xác định có mặt prơtit q trình amơn hố prơtit phản ứng màu: + Cho vào ống nghiệm: ƒ 5ml dung dịch lên men thối ƒ 1ml dung dịch NaOH 30% ƒ 0,5ml dung dịch CuSO4 1% + Đun nhẹ ống nghiệm sôi Kết quả: Dung dịch có màu xanh tím có prơtit Dung dịch có màu đỏ có peptơn 32 Bài thực hành số 5: Các kĩ thuật phân lập nuôi cấy vi sinh vật Kĩ thuật phân lập vi sinh vật Trong tự nhiên, phần lớn vi sinh vật tồn lẫn với tập hợp bao gồm nhiều vi sinh vật khác Để nghiên cứu tính chất ứng dụng vi sinh vật, thường phải phân lập chúng thành vi sinh vật riêng rẽ Các phương pháp dùng để phân lập vi sinh vật phương pháp đổ đĩa, phương pháp dàn phương pháp cấy ria 1.1 Phương pháp đồ đĩa Nguyên lý: lượng nhỏ vi sinh vật pha loãng trộn với mơi trường agar nóng chảy đổ vào hộp petri vô khuẩn Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, vi sinh vật mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ Mỗi khuẩn lạc bao gồm loại vi sinh vật chùng - Nấu chảy ống nghiệm có chứa 19 ml mơi trường dinh dưỡng đặc, đặt vào bể điều nhiệt có nhiệt độ 45-50 oC - Hút 1ml dung dịch chứa hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập cho vào ống nghiệm thứ nhất, lắc kĩ vortex, ta có độ pha loãng 1/20 - Hút 1ml dung dịch độ pha loãng 1/20 sang ống nghiệm thứ 2, lắc kĩ, ta có độ pha lỗng 1/400 - Hút 1ml dung dịch độ pha loãng 1/400 sang ống nghiệm thứ 3, lắc kĩ, ta có độ pha lỗng 1/8000 - Đổ ống nghiệm vào hộp petri vô khuẩn, để nguội ni cấy vị trí lật ngược nhiệt độ thích hợp - Sau thời gian ni cấy, tách riêng khuẩn lạc riêng rẽ 1.2 Phương pháp dàn Nguyên lý: lượng nhỏ vi sinh vật pha loãng trước dàn lên bề mặt đĩa petri có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp - Đổ mơi trường agar nóng chảy vào hộp petri vô khuẩn đặc lại - Hút 0,1ml dung dịch chứa hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập độ pha loãng khác pipetman vào đĩa petri dàn khắp bề mặt hộp que trang vô khuẩn - Lật ngược hộp có chứa vi sinh vật, để vào tủ ấm 35oC 48 h - Sau tách rời khuẩn lạc mọc bề mặt môi trường đặc 1.3 Phương pháp cấy ria Nguyên lý: que cấy sử dụng để cấy ria nhiều lần hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập khắp bề mặt môi trường đặc hộp petri Sau lần cấy ria, vi sinh vật bị tách dần khỏi hỗn hợp phát triển thành khuẩn lạc riêng rẽ - Hơ đỏ que cấy, làm nguội lấy vòng que cấy đầy hỗn hợp vi sinh vật cần phân lập - Nghiêng mở hộp petri, dùng que cấy vạch đường song song phần hộp - Hơ đỏ que cấy, làm nguội gạch đường song song phần khác hộp - Lặp lại bước - Lật ngược hộp petri có chứa vi sinh vật vào tủ ấm 35oC 48h Sau tách rời khuẩn lạc mọc bề mặt môi trường đặc Kĩ thuật nuôi cấy - Nuôi cấy môi trường lỏng: Vi sinh vật phát triển tốt lớp mỏng mơi trường lỏng ( 10% thể tích bình tam giác) điều kiện nuôi cấy tĩnh Với lớp chất lỏng dày (30% thể tích) cần thêm khơng khí cách lắc hay sục khí - Ni cấy môi trường đặc Nuôi cấy vi sinh vật ống thạch nghiêng thạch đĩa 33 Nuôi cấy vi sinh vật vi hiếu khí Vi sinh vật vi hiếu khí nhóm vi sinh vật phát triển tốt mơi trường có hàm lượng khí CO2 lớn hàm lượng khí O2 nhỏ so với khí Để ni cấy nhóm vi sinh vật người ta sử dụng bình kín có đốt nến để loại trừ O2 tăng khí CO2 - Ni cấy vi sinh vật kị khí Sử dụng mơi trường có tính khử, q trình ni cấy thực tủ ni cấy kị khí, khơng khí hút hết ngồi bơm chân khơng, sau thay CO2 N2 - Bài thực hành số 6: Kiểm tra vi sinh vật mẫu thực phẩm 1.Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí thực phẩm Tổng số vi khuẩn hiếu khí tiêu thực phẩm, qua người ta đánh giá khái quát tình trạng vệ sinh thực phẩm dự đoán thời gian bảo quản thực phẩm 34 Tùy thuộc vào loại thực phẩm mà giá trị tổng số vi khuẩn hiếu khí cho phép sản phẩm khác nhau, cao 5.10 khuẩn lạc/g sản phẩm 1.1 Nguyên tắc Sử dụng mơi trường thạch tryptone glucose (còn gọi Plate Count Agar - PCA) để nuôi cấy vi sinh vật mẫu thực phẩm điều kiện hiếu khí nhiệt độ 30oC - 35oC 48-72 1.2 Thiết bị dụng cụ Thiết bị: Nồi hấp tiệt trùng, tủ ấm, tủ sấy, tủ cấy, bể điều nhiệt Dụng cụ: Ống nghiệm, bình tam giác, hộp petri, que cấy gạt, pipet, cân, 1.3 Môi trường Sử dụng môi trường thạch tryptone glucose 1.4 Cách thực Chuẩn bị mẫu Mẫu dạng rắn cần xay bình xay vơ khuẩn, sử dụng nước peptone nước cất để pha lỗng mẫu Cấy mẫu Mỗi mẫu cần ni cấy với ba độ pha loãng khác sử dụng hai hộp petri cho độ pha loãng Sử dụng phương pháp hộp đổ phương pháp cấy gạt để gieo cấy Nuôi cấy Nuôi cấy nhiệt độ 30oC 48-72 Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc tính tổng số vi khuẩn hiếu khí có 1g 1ml mẫu 1.5 Cách tính kết Tiến hành đếm khuẩn lạc hộp petri Chọn tất hộp petri có từ 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết Cơng thức tính: Trong đó: N số khuẩn lạc có 1ml mẫu huyền phù ban đầu C1, C2 số khuẩn lạc đếm hộp petri độ pha loãng chọn d hệ số pha loãng mẫu 35