Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose trong rơm rạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH-KTNN      NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG RƠM RẠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Hà Nội, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH-KTNN      NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TRONG RƠM RẠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Đinh Thị Kim Nhung Hà Nội, 2018 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới cô giáo, PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, người tận tình bảo giúp đỡ tơi thời gian học tập nghiên cứu đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo, cô giáo tổ môn Thực vật - Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kinh nghiệm suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh -KTNN, Trung tâm thơng tin thư viện, Phòng thí nghiệm VSV Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa luận Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân, người ln quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, tiến hành hồn thiện đề tài Hà Nội, Ngày 23 Tháng 05 Năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thị Ngọc Ánh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu riêng cá nhân tôi, tất số liệu thu thập từ thực nghiệm qua xử lý thống kê, hồn tồn khơng có số liệu chép Đề tài nghiên cứu không trùng với cơng trình nghiên cứu tác giả khác Trong đề tài, tơi có sử dụng số liệu số tác giả khác làm dẫn chứng, tơi xin phép tác giả trích dẫn để bổ sung cho khóa luận Nếu sai tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Hà Nội, Ngày 23 Tháng 05 Năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thị Ngọc Ánh MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Đóng góp đề tài NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cellulose rơm rạ 1.1.1 Thành phần chất rơm rạ 1.1.2 Tính chất cấu trúc cellulose 1.1.3 Hiện trạng sử dụng rơm rạ Việt Nam 1.2 Hệ VSV phân giải cellulose rơm rạ 1.2.1 Vi khuẩn 1.2.2 Xạ khuẩn 1.2.3 Các chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose rơm rạ 1.2.4 Sơ lược chủng nấm mốc Trichoderma 1.2.5 Ứng dụng Trichoderma 15 1.3 Thực tế nghiên cứu phân giải cellulose rơm rạ nhờ VSV 17 1.4 Một số biến đổi trình phân giải cellulose 18 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng nấm mốc 22 1.6 Yếu tố MT ảnh hưởng đến khả sinh enzyme cellulase 23 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Vật liệu 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Lấy mẫu 28 2.3.2 Phân lập VSV từ khối ủ 28 2.3.3 Phương pháp cấy truyền tuyển chọn giống bảo quản giống 29 2.3.4 Phương pháp quan sát đặc điểm phân loại 29 2.3.5 Xác định khả phân giải cellulose VSV 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Diễn sinh thái VSV q trình mùn hóa tự nhiên rơm rạ 33 3.2 Các chủng nấm phân lập từ q trình mùn hóa tự nhiên rơm rạ 35 3.3 Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính enzyme ngoại bào phân giải tốt cellulose 37 3.4 Đặc điểm sinh học chủng nấm có hoạt tính enzyme ngoại bào tuyển chọn 40 3.5 Tuyển chọn chủng nấm có hoạt tính enzyme nội bào phân giải tốt cellulose 43 3.6 Nghiên cứu tính đối kháng chủng nấm mốc tuyển chọn 45 3.7 Đánh giá khả phân giải rơm rạ số chủng nấm mốc tiềm tuyển chọn 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 Kết luận 53 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC VIẾT TẮT B G C M d d g : K L R B V S T M T 10 C H 11 E : : C : : : : : : : : DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc cellulose Hình 1.2 Sơ đồ phân loại nấm Hình 3.3.1 Vòng hoạt tính chủng nấm mốc N1 MT bổ sung chất bột giấy 37 Hình 3.3.2 Vòng hoạt tính chủng nấm mốc N3 MT bổ sung chất bột giấy 37 Hình 3.3.3 Vòng hoạt tính chủng nấm mốc N1 N3 MT bổ sung chất CMC 38 Hình 3.4.1 KL chủng nấm mốc N1 40 Hình 3.4.2 Bơng nấm chủng nấm mốc N1 40 Hình 3.4.3 Bọng đỉnh giá chủng nấm mốc N1 40 Hình 3.4.4 Bào tử chủng nấm mốc N1 40 Hình 3.4.5 KL chủng nấm mốc N3 41 Hình 3.4.6 Bơng nấm chủng nấm mốc N3 41 Hình 3.4.7 Bọng đỉnh giá chủng nấm mốc N3 42 Hình 3.4.8 Bào tử chủng nấm mốc N3 42 Hình 3.5.1 Vòng hoạt tính enzyme nội bào chủng nấm mốc Trichoderma N1 MT bổ sung chất CMC 44 Hình 3.5.2 Vòng hoạt tính enzyme nội bào chủng nấm mốc Trichoderma N3 MT bổ sung chất CMC 44 Hình 3.6 Kết kiểm tra tính đối kháng chủng nấm tuyển chọn với chủng vi khuẩn xạ khuẩn 45 Hình 3.7.1 Thùng xốp có bổ sung chủng nấm mốc 46 Hình 3.7.2 Thùng xốp khơng bổ sung chủng nấm mốc 46 Hình 3.7.3 Biến thiên nhiệt độ trung bình khối ủ (thể tích 1m3) 48 Hình 3.7.4 Luống rau trồng thí nghiệm 50 Hình 3.7.5 Luống rau trồng đối chứng 50 Hình 3.7.6 So sánh kích thước rau cải sau trồng 15 ngày 50 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.2.1 MT phân lập nuôi cấy VSV 25 Bảng 2.2.2 Thành phần MT thử hoạt tính enzyme ngoại bào 25 Bảng 2.3 Thành phần khối ủ 27 Bảng 3.1.1 Sự thay đổi số trạng thái rơm khối ủ U1 U2 .32 Bảng 3.1.2 Sự thay đổi độ mủn rơm rạ khối ủ 34 Bảng 3.2 Nấm mốc phân lập mẫu khối ủ 34 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng nấm mốc phân lập 36 Bảng 3.5 Hoạt tính enzyme nội bào chủng nấm mốc phân lập 42 Bảng 3.7.1 Kết theo dõi độ mủn khối ủ 46 Bảng 3.7.2 So sánh sinh trưởng rau cải trồng có khơng bổ sung nguồn nấm mốc tuyển chọn (trong 15 ngày) 49 Hình 3.5.1 Vòng hoạt tính enzyme nội Hình 3.5.2 Vòng hoạt tính enzyme bào chủng nấm mốc Trichoderma nội bào chủng nấm mốc N1 MT bổ sung chất CMC Trichoderma N3 MT bổ sung chất CMC Như vậy, hầu hết chủng nấm mốc có hoạt tính enzyme nội bào, chủng nấm mốc Trichoderma N1 Trichoderma N3 nghiên cứu định loại vừa có hoạt tính enzyme nội bào cao với hoạt tính 25mm 11mm 3.6 Nghiên cứu tính đối kháng chủng nấm mốc tuyển chọn Để đánh giá khả phân giải rơm rạ thực tế chủng nấm mốc Trichoderma N1 có hoạt tính enzyme ngoại bào nội bào mô tả tập hợp VSV tuyển chọn, tiến hành kiểm tra tính đối kháng chủng phương pháp cấy chữ thập (đối với chủng vi khuẩn) cấy hai hình chữ thập chủng vi khuẩn V1 điểm giao hình chữ thập ta đặt khối thạch chứa chủng xạ khuẩn X1 khối thạch chứa chủng nấm mốc Trichoderma N1 sau đem ni tủ ấm 300C hai ngày thu kết hình sau Hình 3.6 Kết kiểm tra tính đối kháng chủng nấm tuyển chọn với chủng vi khuẩn xạ khuẩn Từ kết quan sát cho thấy chủng VSV tuyển chọn khơng đối kháng khơng hình thành vòng vơ khuẩn vị trí đặt khối thạch nấm mốc, chủng nấm mốc Trichoderma N1 sinh trưởng phát triển tốt không đối kháng với chủng vi khuẩn V1 xạ khuẩn X1 Như vậy, chủng nấm mốc Trichoderma N1 không đối kháng với chủng vi khuẩn V1 chủng xạ khuẩn X1 tổng hợp chủng tạo chế phẩm sinh học phân giải rơm rạ 3.7 Đánh giá khả phân giải rơm rạ số chủng nấm mốc tiềm tuyển chọn Để đánh giá hiệu phân giải rơm rạ tổ hợp nấm mốc tuyển chọn đem ủ thử nghiệm tổ hợp nấm mốc khối ủ rơm rạ tích ~ 1m 3, tương ứng 10 kg rơm khơ, bổ sung dung dịch khống ammoni nitrate để đạt tỷ lệ C/N ~ 25-30 độ ẩm 60% Khối ủ thí nghiệm (TN I bổ sung tổ hợp nấm mốc tuyển chọn) khối ủ đối chứng (TN II khơng bổ sung tổ hợp nấm mốc) Thí nghiệm lặp lại lần Hình 3.7.1 Thùng xốp có bổ sung chủng nấm mốc Hình 3.7.2 Thùng xốp không bổ sung chủng nấm mốc Bảng 3.7.1 Kết theo dõi độ mủn khối ủ T h 0i 5/ 0/ 5/ 0/ 5/ 0/ -: K Th í T T N N + Thí ngh T T NN + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ : +: Thí ngh T T NN + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + ++ + ++ + ++ + Kết theo dõi độ mủn khối ủ thể bảng 3.7.1 nhiệt độ khối ủ thể hình 3.7.3 So với nhiệt MT, khối ủ có bổ sung tổ hợp nấm mốc tuyển chọn TN I khối ủ không bổ sung tổ hợp nấm mốc (các khối ủ đối chứng), TN II có nhiệt độ cao hơn, chứng tỏ khối ủ có sinh trưởng, phát triển nấm mốc Tuy nhiên, nhiệt độ khối ủ có bổ sung tổ hợp nấm mốc cao hẳn (tối đa 540C), độ mủn hóa chất diễn nhanh cao so với khối ủ đối chứng (tối đa 48 0C) Q trình mủn hóa nhanh cao lý làm cho độ giảm khối lượng khối ủ có bổ sung tổ hợp VSV tuyển chọn cao (độ giảm khối lượng trung bình 9,3kg 25 ngày) độ giảm khối lượng trung bình khối ủ khơng bổ sung tổ hợp VSV đạt 5,4kg 25 ngày Nhiệt độ (0C) 60 50 40 30 MT ĐC TN 20 10 Thời gian (ngày) Hình 3.7.3 Biến thiên nhiệt độ trung bình khối ủ (thể tích 1m3) Như vậy, tổ hợp nấm mốc tuyển chọn thể hoạt động sinh trưởng phân giải chất rơm rạ tốt hẳn VSV tự nhiên có sẵn rơm rạ Nhiệt độ khối ủ thí nghiệm tăng nhanh đạt ngưỡng cao 53 0C đến 540C vào ngày thứ 9-10; mức nhiệt tốt cho phân giải hữu trì dao động mức 500C ngày thứ 11-12 bắt đầu giảm Trong khối đối chứng, nhiệt độ tăng chậm đạt ngưỡng cao 47 0C đến 480C vào ngày thứ 10-11 Sự tăng cường nhiệt độ thể hoạt động sinh trưởng, phát triển tối ưu nhóm VSV khác khối ủ Đây giai đoạn ổn định hay giai đoạn chín khối ủ mà chất chuyển hóa dần từ dạng sang dạng khác Để xác định khả phân giải rơm rạ tạo mùn hữu hai chủng nấm mốc, tiến hành trồng rau cải đất bổ sung thêm mùn hữu có chứa nấm mốc tuyển chọn trồng rau cải đất không bổ sung thêm mùn hữu có chứa nấm mốc tuyển chọn sau 15 ngày thu kết thể bảng sau: Bảng 3.7.2 So sánh sinh trưởng rau cải trồng có khơng bổ sung nguồn nấm mốc tuyển chọn (trong 15 ngày) C hi ềS ố lư S ố lư C hi ề C â y C â y t r t r Hình 3.7.4 Luống rau trồng thí Hình 3.7.5 Luống rau trồng đối nghiệm chứng Hình 3.7.6 So sánh kích thước rau cải sau trồng 15 ngày Bên trái hình rau trồng đối chứng Bên phải hình rau trồng thí nghiệm Theo số liệu bảng hình 3.7.4; hình 3.7.5; hình 3.7.6 nguồn mùn hữu bổ sung chủng nấm mốc giúp rau cải phát triển tốt hẳn cụ thể so sánh trồng thí nghiệm với đối chứng cho thấy: thí nghiệm cao đối chứng 7cm số lượng rễ phụ nhiều 12 rễphụ chiều dài rễ dài 2cm Như hai chủng nấm Trichoderma N1 Trichoderma N3 có khả phân giải rơm rạ thực tế tốt sử dụng tập hợp VSV hữu hiệu để phân giải rơm rạ thành mùn hữu bón cho trồng giúp trồng phát triển tốt KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Qua diễn sinh thái VSV khối ủ nhận thấy tỉ lệ thành phần phối trộn khối ủ theo khối ủ U2 phù hợp Từ mẫu phân lập 18 chủng nấm mốc 18 chủng có khả tổng hợp cellulase cho thấy khả phân giải cellulose nấm mốc đa dạng 1.2 Tuyển chọn chủng nấm mốc N1, N3 có khả sinh enzyme ngoại bào hoạt tính chất CMC 34mm, 24mm chất bột giấy hoạt tính 35,5 mm 25mm Định loại sơ chủng nấm mốc thuộc chi Trichoderma đặt tên Trichoderma N1 Trichoderma N3 có hoạt tính nội bào cao với hoạt tính 25mm 11mm Chủng nấm mốc Trichoderma N1 không đối kháng với chủng vi khuẩn chủng xạ khuẩn MT sinh trưởng sử dụng khối ủ xử lý rơm rạ thành mùn hữu 1.2 Chủng nấm Trichoderma N1 Trichoderma N3 có khả phân giải rơm rạ thực tế tốt sử dụng tập hợp VSV hữu hiệu để phân giải rơm rạ thành mùn hữu bón cho trồng giúp trồng phát triển tốt Kiến nghị Phân lập thêm chủng nấm mốc có hoạt tính cao phân giải cellulose từ nhiều nguồn vật liệu phối hợp chủng nấm mốc với nhiều chủng vi khuẩn xạ khuẩn khác có khả phân giải cellulose sản phẩm có khả phân giải cellulose triệt để Nghiên cứu hướng tới xây dựng quy trình ủ rơm rạ tạo mùn hữu cơ, giới thiệu rộng rãi sản phẩm mùn hữu đến tay người tiêu dùng phổ biến rộng rãi quy trình ủ mùn hữu đến người nơng dân TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Khả phân hủy cellulose Trichoderma reesei luận văn, đồ án tốt nghiệp [2] Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Đại Học Sư Phạm Hà Nội trang 115,116 [3] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Giáo trình Vi sinh vật học, trang 88 [4] Nguyễn Thị Thảo, So sánh đặc điểm hình thái, sinh học số chủng nấm Trichoderma đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm Asprgillus niger hại lạc chúng vụ xuân 2014 huyện Nghi Lộc - Nghệ An, Luận văn Thạc sỹ Nông nghiệp [5] Phạm Thị Thanh Nhàn, 2014, Nghiên cứu diễn sinh thái đặc điểm sinh học vi sinh vật tham gia trình chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ,Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, trang 57 [6] Tạp chí khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2017, Phân lập đánh giá khả đối kháng Trichoderma asperellum tác nhân gây bệnh có nguồn gốc đất [7] Agricola 66, 304-308 28 Mba, c.c (1997) Rock phosphate solubilizing Streptosporangium isolates from casts of tropical earthworms Soil Biology and Biochemistry [8] Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma: I Production of non-volatile antibiotics, C Dennis, J Webster - Transactions of the British Mycological Society, 1971 [9] Chang, c C, et al (2009) Activity of cellulase from Thermoactinomycetes and Bacillus spp isolated from Brassica waste compost Scientia Agricola 66, 304308 [10] Huang, s, et al (2012) Isolation and identification of cellulolytic bacteria from the gut of Holotrichia parallela larvae (Coleoptera: Scarabaeidae) International journal of molecular sciences 13, 2563-2577 [11] Jeffrey, L (2008) Isolation, characterization and identification of actinomycetes from agriculture soils at Semongok, Sarawak African Journal of biotechnology [12] KLuepfel, D, et al (1986) characterization of cellulase and e activities of Streptomyces lividans Applied microbiology and biotechnology 24, 230-234 [13] Lo, C, et al (2002) Actinomycetes isolated from soil samples from the Crocker Range Sabah ASEAN Review on Biodiversity and Environmental Conservation [14] Milala, M, et al (2005) Studies on the use of agricultural wastes for cellulase enzyme production by Aspergillus niger Res J Agric Biol Sci 1, 325328 [15] Rastogi, G, et al (2009) Isolation and characterization of cellulosedegrading bacteria from the deep subsurface of the Homestake gold mine, Lead, South Dakota, USA Journal of industrial microbiology & biotechnology 36, 585598 [16] Shahriarinour, M., et al (2011) Screening, isolation and selection of cellulolytic fungi from oil palm empty fruit bunch fibre Biotechnology 10, 108113 [17] Schrempf, H and Walter, S (1995) The cellulolytic system of Streptomyces reticuli International journal of biological macromolecules 17, 353355 [18] Schwarz, W (2001) The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria [19] Semedo, L., et al (2004) Streptomyces drozdowiczii sp nov., a novel cellulolytic streptomycete from soil in Brazil International journal of systematic and evolutionary microbiology 54, 1323-1328 [20] Trichoderma: Systematics, the Sexual State, and Ecology [21] 381-385 29 Veiga, M., et al (1983) Isolation of cellulolytic actinomycetes from marine sediments Applied and environmental microbiology 46, 286 ... nhiều chủng nấm mốc ngồi tự nhiên có khả cho hoạt tính phân giải rơm rạ tốt chưa xácđịnh tơi thực đề tài: “ Nghiên cứu tuyển chọn số chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose rơm rạ 2 Mục đích nghiên. .. apatit lồi có khả phân hủy cellulose [9], [7], [21] 1.2.3 Các chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose rơm rạ Nấm mốc gọi nấm sợi tất nấm nấm men không sinh mũ nấm nấm lớn [3] Nấm sinh vật có chế... trình phân giải cellulose để nghiên cứu đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học số chủng nấm mốc khả phân giải cellulose rơm rạ Kết nghiên cứu liệu góp phần bổ sung cho nghiên cứu ứng dụng chủng nấm