XÁC ĐỊNH đột BIẾN GEN KCNJ11 gây BỆNH đái THÁO ĐƯỜNG TRÊN TRẺ sơ SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU GIANG XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN KCNJ11 GÂY BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TRÊN TRẺ SƠ SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2013 - 2017 HÀ NỘI – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU GIANG XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN KCNJ11 GÂY BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TRÊN TRẺ SƠ SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2013 - 2017 Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Huy Thịnh HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Học tập nghiên cứu trình thiếu lĩnh vực sống Là sinh viên y nhiều bỡ ngỡ lần tiến hành làm nghiên cứu, em thật may mắn nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy, cơ, anh chị, bạn bè gia đình ln bên cạnh, giúp em hồn thành khóa luận bảo cho em nhiều điều Với tất lòng kính trọng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Thịnh – Phó chủ nhiệm mơn Hóa sinh – Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy kính mến dìu dắt, cho em phương hướng thực nghiên cứu bảo tận tình giúp em hồn thiện khóa luận Với niềm yêu mến biết ơn từ tận đáy lòng, em xin gửi lời cảm ơn tới CN Nguyễn Quý Hoài, người thầy người chị, lúc tận tâm, tỉ mỉ, hết lòng chúng em, lúc đêm khuya hay lúc sáng sớm Cảm ơn chị, người truyền thêm lửa yêu nghề, yêu nghiên cứu em Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị làm việc Trung tâm Gen – Protein, tạo điều kiện tốt giúp em hồn thành khóa luận Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ, hậu phương vững chắc, truyền cho tình yêu, sức mạnh niềm tin bước đường mà chọn CHỮ VIẾT TẮT ĐTĐSS: Đái tháo đường sơ sinh DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid KCNJ11: Potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 11 Kb: Kilo base Bp: Base pair SNP: Single nucleotid polymorphism NCBI: National Center for Biotechnology Information dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate EDTA: Ethylendiamin Tetraacetic Acid PCR: Polymerase chain reaction PCI: Phenol Chloroform Isoamyl A: Adenin C: Cytosine G: Guanin T: Thymine MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đôi nét bệnh đái tháo đường sơ sinh 1.1.1 Định nghĩa .3 1.1.2 Triệu chứng lâm sàng 1.2 Gen KCNJ11 chế gây bệnh đái tháo đường sơ sinh 1.2.1 Sự tiết insulin 1.2.2 Kênh K-ATP 1.3 Gen KCNJ11 11 1.3.1 Cấu tạo, vị trí 11 1.3.2 Chức .11 1.3.3 Một số đột biến/snp tìm thấy KCNJ11 ảnh hưởng chúng đến ĐTĐSS 12 1.3.5 Các kĩ thuật phát đột biến gen KCNJ11 17 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Phương tiện nghiên cứu 23 2.2.1 Trang thiết bị nghiên cứu 23 2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 23 2.2.3 Hóa chất dùng nghiên cứu 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu .25 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu .25 2.3.2 Quy trình lấy mẫu bảo quản mẫu .25 2.3.3 Quy trình tách chiết DNA từ máu toàn phần 25 2.3.4 Quy trình khuếch đại gen KCNJ11 phản ứng PCR 28 2.3.5 Giải trình tự gen KCNJ11 .32 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Kết tách chiết DNA 35 3.1.1 Kết đo OD 35 3.1.2 Kết điện di DNA tổng số 36 3.2 Kết khuếch đại gen KCNJ11 phản ứng PCR .37 3.2.1 Kết tối ưu hóa quy trình PCR 37 3.2.2 Kết sản phẩm PCR 39 3.3 Kết giải trình tự gen xác định đột biến gen KCNJ11 40 Chương 4: BÀN LUẬN .44 4.1 Kết tách chiết DNA 44 4.2 Kết khuếch đại gen KCNJ11 45 4.2.1 Kết tối ưu quy trình PCR 45 4.2.2 Kết khuếch đại gen KCNJ11 46 4.3 Kết giải trình tự gen phát đột biến gen KCNJ11 47 4.4 So sánh kết thu với nghiên cứu khác 48 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các đột biến gen KCNJ11 gây bệnh ĐTĐSS tìm thấy cơng bố 12 Bảng 1.2 Các đa hình phổ biến gen KCNJ11 17 Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại gen KCNJ11 .29 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 31 Bảng 2.4 Thành phần mix giải trình tự 33 Bảng 3.1 Nồng độ độ tinh DNA tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân 35 Bảng 3.2 Các kiểu đột biến đa hình gen KCNJ11 phát ba bệnh nhân ĐTĐSS 42 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử insulin Hình 1.2 Hình ảnh vi thể đảo tụy nang tuyến xung quanh Hình 1.3 Cơ chế tiết insulin tế bào β tuyến tụy Hình 1.4 Cấu tạo kênh K-ATP 10 Hình 1.5 Vị trí gen KCNJ11 nhiễm sắc thể số 11 11 Hình 1.6 Chức gen KCNJ11 12 Hình 1.7 Một số vị trí acid amin gen KCNJ11 mã hóa tìm thấy đột biến 14 Hình 1.8 Đột biến gen KCNJ11 làm kênh K-ATP khơng đóng lại khiến cho insulin không tiết 15 Hình 1.9 Hỗn hợp tiểu đơn vị hoang dã đột biến Kir6.1 16 Hình 1.10 Các bước kỹ thuật PCR .19 Hình 1.11 Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP 20 Hình 1.12 Hình ảnh giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động .21 Hình 3.1 Kết đo OD mẫu SS3 máy Nanodrop 1000 35 Hình 3.2 Hình ảnh điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% 36 Hình 3.3 Kết tối ưu hóa nồng độ mồi 37 Hình 3.4 Kết điện di tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi 38 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR gel 1,5% 39 Hình 3.6 Hình ảnh kết giải trình tự đoạn gen KCNJ11 mẫu SS2 nhóm nghiên cứu 41 Hình 3.7 Kết giải trình tự bệnh nhân SS2 có đột biến p.G53S (c.157G>A) 43 Hình 3.8 Kết giải trình tự bệnh nhân SS1 có đa hình K23E 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường bệnh biết đến từ lâu với định nghĩa nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbonhydrat, mỡ protein hormone insulin tuyến tụy sản xuất bị thiếu hụt hay giảm tác động thể, biểu mức đường máu cao Đái tháo đường xảy chủ yếu người trưởng thành, nhiên xảy trẻ sơ sinh với tỉ lệ mắc bệnh hiếm, mức độ nguy hiểm cao triệu chứng khơng điển hình, khó phát sớm trẻ biết khóc Chính thế, trẻ thường vào viện tình trạng nguy kịch chẩn đoán muộn Nguyên nhân đái tháo đường sơ sinh di truyền đột biến trội lặn NST thường, gây ảnh hưởng lên trình tiết insulin, làm giảm tác động thiếu hụt insulin Gen KCNJ11 mã hóa cho protein tham gia cấu tạo nên kênh K-ATP, đóng vai trò quan trọng q trình tiết insulin Đột biến gen KCNJ11 nguyên nhân dẫn đến đái tháo đường sơ sinh Thông thường, trẻ mắc đái tháo đường phải điều trị insulin đường tiêm da, có nhiều bất tiện phụ thuộc Tuy nhiên, phát trẻ có đột biến gen KCNJ11 này, thay phải điều trị insulin đường tiêm, trẻ điểu trị hiệu thuốc sulfonylureas đường uống Vì thế, việc xác định xem trẻ mắc đái tháo đường sơ sinh có đột biến gen KCNJ11 khơng việc cần thiết Từ thực tế đó, để tài nghiên cứu: “Xây dựng quy trình xác định đột biến gen KCNJ11 gây bệnh đái tháo đường sơ sinh kỹ thuật giải trình tự gen” thực nhằm mục tiêu: Hồn thiện quy trình xác định đột biến gen KCNJ11 gây bệnh đái tháo đường trẻ sơ sinh Bước đầu xác định đột biến gen số bệnh nhân mắc đái tháo đường sơ sinh 41  Nhiệt độ gắn mồi 52oC cho kết băng mờ với nhiều băng phụ, cho thấy phản ứng PCR không đặc hiệu sản phẩm  Nhiệt độ gắn mồi 60oC cho kết băng sáng băng mờ, cho thấy sản phẩm PCR số lượng có nhiều chưa đặc hiệu  Nhiệt độ gắn mồi 56oC cho kết tốt nhất, băng sáng khơng có băng phụ, cho thấy nhiệt độ gắn mồi cho sản phẩm PCR nhiều đặc hiệu => Từ kết trên, ta chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho mồi K1 K3 56oC, mồi K2 60oC 3.2.2 Kết sản phẩm PCR Gen KCNJ11 khuếch đại phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu theo quy trình 2.3.4 Để kiểm tra hiệu độ đặc hiệu phản ứng PCR, tất sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,5% Kết minh họa hình 3.5: SS1 MK K1 K2 SS2 K3 K1 K2 SS3 K3 K1 K2 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR gel 1,5% Nhận xét: Kết điện di kiểm tra cho thấy: K3 42 - Các chứng âm không lên vạch Chứng tỏ thành phần tham gia phản ứng không bị nhiễm DNA ngoại lai, thao tác kỹ thuật đảm bảo yêu cầu - Sản phẩm PCR khuếch đại gen KCNJ11 tất mẫu lên băng nhất, rõ nét, khơng có băng phụ, khơng bị smear, kích thước 543 bp (đoạn K1), 549 bp (đoạn K2), 521 bp (đoạn K3) so thang DNA chuẩn => Phản ứng PCR đạt hiệu quả, sản phẩm PCR đặc hiệu, chứng tỏ cặp mồi K1, K2, K3 đặc hiệu nồng độ mồi chu trình nhiệt chuẩn hóa tối ưu => Sản phẩm PCR đạt yêu cầu, đảm bảo bước giải trình tự để phát đột biến điểm 3.3 Kết giải trình tự gen xác định đột biến gen KCNJ11 Sản phẩm PCR tiếp tục giải trình tự trực tiếp máy ABI-3100 so sánh với trình tự chuẩn NM_000525 GenBank phần mềm CLC Main Workbench Kết phân tích minh họa hình 3.6: 43 Hình 3.6 Hình ảnh kết giải trình tự đoạn gen KCNJ11 mẫu SS2 nhóm nghiên cứu 44  Nhận xét: - Kết giải trình tự cho thấy đoạn DNA khuếch đại có trình tự tương ứng với đoạn gen KCNJ11 GenBank Như vậy, đoạn gen KCNJ11 khuếch đại đặc hiệu việc sử dụng cặp mồi K1, K2, K3 quy trình khuếch đại đoạn gen 2.3.4 - Kết giải trình tự cho thấy hình ảnh đỉnh rõ nét, khơng bị nhiễu, tín hiệu thấp  Các đột biến đa hình gen KCNJ11 tìm thấy bệnh nhân liệt kê bảng sau: Bảng 3.2 Các kiểu đột biến đa hình gen KCNJ11 phát ba bệnh nhân ĐTĐSS STT Bệnh Đoạn nhân gen Front Back SS1 Đột biến/SNP Thể đột Chú biến thích Đa hình Đa hình p.K23E (c.67A>G) p.V337I (c.1009G>A) Không phát đột biến SS2 SS3 Front Front Back p.K23E (c.67A>G) p.G53S (c.157G>A) p.V337I (c.1009G>A) Khơng phát đột biến Đa hình Dị hợp Đa hình 45 Hình 3.7 Kết giải trình tự bệnh nhân SS2 có đột biến p.G53S (c.157G>A) Hình 3.8 Kết giải trình tự bệnh nhân SS1 có đa hình K23E 46 Chương BÀN LUẬN 4.1 Kết tách chiết DNA Để tiến hành xác định đột biến gen KCNJ11, tách chiết DNA bước quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến kết kỹ thuật sinh học phân tử DNA tách chiết phải đảm bảo không bị đứt gãy,tinh khiết, không nhiễm tạp chất đồng thời phải đạt đủ nồng độ để đảm bảo độ xác cho kết PCR giải trình tự gen Trong nghiên cứu DNA tách chiết theo phương pháp PCI cho kết tốt Tất mẫu DNA tách chiết bệnh nhân đo nồng độ kiểm tra độ tinh phương pháp đo độ hấp thụ quang máy Nanodrop 2000c bước sóng 260 nm (A 260) 280 nm (A280) Giá trị đo OD bước sóng 260 nm mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA dung dịch Tỷ số A260/280 cho biết độ tinh mẫu DNA tách chiết Các thông số nồng độ độ tinh mẫu DNA trình bày bảng 3.1 Từ bảng số liệu, ta thấy: - Tất mẫu DNA đạt nồng độ 50 ng/µl, đảm bảo đủ nồng độ để thực phản ứng PCR thành công - Tỷ số A260/280 nằm khoảng 1,8-2,0 cho thấy DNA tách chiết đạt yêu cầu tinh sạch, hoàn tồn cho kết PCR tốt Để khẳng định kết tách chiết lần nữa, DNA thực điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% Hình ảnh điện di cho thấy 47 băng DNA rõ nét, khơng có băng phụ vết mờ, chứng tỏ DNA đảm bảo độ tinh sạch, không bị đứt gãy đủ nồng độ thực kỹ thuật sinh học phân tử (hình 3.2) 4.2 Kết khuếch đại gen KCNJ11 4.2.1 Kết tối ưu quy trình PCR Kết PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố: - Chất lượng nồng độ DNA mẫu - Thiết kế nồng độ mồi - Nồng độ Mg2+ - Nồng độ dNTP - Taq polymerase - Hệ thống đệm - Chu trình nhiệt, đặc biệt nhiệt độ gắn mồi Bất kỳ yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng hiệu phản ứng PCR Do vậy, để có kết PCR tốt tất thành phần tham gia phản ứng PCR phải tốt chu trình nhiệt phải tối ưu hóa Trước hết phải đảm bảo chất lượng DNA mẫu nồng độ độ tinh (trong nghiên cứu này, tất mẫu DNA đảm bảo pha nồng độ 50pmol/µl trước tham gia phản ứng PCR) Thành phần Gold Taq theo kit nhà sản xuất chứa enzyme Taq polymerase hoạt động theo hệ đệm với pH, nồng độ Mg2+ nồng độ dNTP thích hợp Chính mà kết PCR với cặp mồi khác phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ mồi chu trình nhiệt, đặc biệt nhiệt độ gắn mồi Nồng độ mồi cao gây tượng gắn mồi không đặc hiệu, nồng độ thấp làm giảm hiệu giá phản ứng thiếu mồi cho chu kỳ cuối Nhiệt độ gắn mồi cao mồi gắn, ngược lại, nhiệt độ thấp gây tượng gắn không đặc hiệu, gắn phần, chí xảy tượng cặp mồi ức chế, bắt cặp chéo lẫn nhau, dẫn tới khơng phát 48 gen đích quan tâm Để có sản phẩm PCR tốt, ta phải tiến hành thử nghiệm phản ứng PCR nhiều lần với nồng độ nhiệt độ gắn mồi khác Sau thử nghiệm, nhận thấy phản ứng PCR tối ưu tiến hành với: Nồng độ mồi 1µl mồi 10pmol/µl 10 µl thể tích phản ứng PCR Chu trình nhiệt: Biến tính phút 94oC Biến tính 30s 94oC Gắn mồi 30s 55oC với mồi K1 60oC với mồi K2 55oC với mồi K3 Kéo dài 30s 72oC Kéo dài phút 72oC Bảo quản 15oC 4.2.2 Kết khuếch đại gen KCNJ11 Tất sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% để kiểm tra hiệu độ đặc hiệu phản ứng PCR Phản ứng PCR đạt hiệu hình ảnh điện di có băng DNA có kích thước phù hợp với kích thước đoạn gen khuếch đại với độ sáng nét cao Phản ứng PCR đặc hiệu hình ảnh điện di có băng DNA đoạn gen khuếch đại, gọn, rõ nét khơng có băng phụ Hình 3.5 cho thấy có băng sáng, gọn, rõ nét nằm đường điện di với kích thước 543 Nu, 549 Nu, 521 Nu tương ứng với mồi K1, K2, K3 gen KCNJ11 mà ta cần khuếch đại Như vây, sản phẩm PCR đạt yêu cầu nguyên vẹn, độ tinh sạch, độ đặc hiệu Với phân tích ý trình thực phản ứng PCR, thu sản phẩm mong muốn, đạt hiệu cao, chất lượng tốt để thực bước giải trình tự gen 49 4.3 Kết giải trình tự gen phát đột biến gen KCNJ11 Phương pháp giải trình tự gen trực tiếp giúp cho việc xác định đột biến gen KCNJ11 trở nên dễ dàng độ xác cao Kết giải trình tự giúp xác định đột biến gen KCNJ11 bệnh nhân cách rõ ràng Kết giải trình tự cho hình ảnh đẹp, tín hiệu giải trình tự tốt, đạt u cầu xác định xác đột biến cho thấy quy trình kỹ thuật giải trình tự gen hồn thiện, tóm tắt sau: - Lấy mẫu máu tĩnh mạch chống đông EDTA bảo quản 4-8oC tách chiết DNA - Tách chiết DNA phương pháp PCI từ mẫu máu tồn phần vòng 72h sau lấy mẫu Nếu mẫu khơng tách phải bảo quản -20oC - Khuếch đại gen KCNJ11 cặp mồi đặc hiệu: K1, K2 Điện di kiểm tra sản phẩm gel agarose 1,5%, 110V 20 phút - Thực phản ứng PCR giải trình tự Điện di kiểm tra sản phẩm tinh sản phẩm PCR giải trình tự phương pháp tủa ethanol - Giải trình tự trực tiếp máy ABI-3100, phân tích kết phần mềm CLC Main Workbench so sánh kết với trình tự chuẩn NM_000525 GenBank ĐTĐSS bệnh khơng đột biến gen KCNJ11 mà gen khác ABCC8, INS, Vì vậy, với bệnh nhân SS1 SS3 khơng tìm thấy đột biến gen KCNJ11, chúng tơi kiến nghị tìm đột biến gen ABCC8, INS,… 4.4 So sánh kết thu với nghiên cứu khác Năm 2005, Glyonyl cộng nghiên cứu đột biến gen KCNJ11 11 bệnh nhân ĐTĐSS tìm thấy đột biến G53S [ CITATION Ann05 \l 50 1033 ] Đây đột biến phát bệnh nhân SS2 nghiên cứu Glyonyl rằng, đột biến G53S làm giảm độ nhạy cảm kênh K-ATP với ATP nguyên nhân bệnh Cũng nghiên cứu này, Glyonyl cộng hai đa hình K23E V337I yếu tố nguy dẫn đến bệnh đái tháo đường type 1, type đái tháo đường thai kỳ [ CITATION Ann05 \l 1033 ] Đây đa hình phát bệnh nhân SS1 SS2 nghiên cứu 51 KẾT LUẬN Căn vào kết phân tích cho phép chúng tơi rút kết luận nghiên cứu hoàn thành mục tiêu đề ra: Đã hồn thiện quy trình xác định đột biến gen KCNJ11 gây bệnh đái tháo đường trẻ sơ sinh: - Đã tách chiết DNA mẫu bệnh nhân đạt yêu cầu: đủ nồng độ, tinh không bị đứt gãy - Đã tối ưu quy trình khuếch đại đoạn gen KCNJ11 cho kết đủ nồng độ đặc hiệu, đảm bảo yêu cầu tham gia phản ứng giải trình tự gen - Kết giải trình tự tương ứng với đoạn gen KCNJ11 cần nghiên cứu, hình ảnh tín hiệu đỉnh cao, tín hiệu thấp, đảm bảo độ tin tưởng kết đột biến/đa hình xác định Bước đầu xác định đột biến gen ba bệnh nhân mắc đái tháo đường sơ sinh: - Bệnh nhân SS1 có đa hình K23E, V337I, khơng phát thấy đột biến - Bệnh nhân SS2 có đột biến G53S đa hình K23E, V337I Như vậy, chúng tơi hồn thiện quy trình xác định đột biến gen KCNJ11 kỹ thuật giải trình tự gen xác định số đột biến bệnh nhân đái tháo đường sơ sinh Trong khn khổ khóa luận tốt nghiệp, nghiên cứu thực với cỡ mẫu nhỏ (3 bệnh nhân) nên kết nghiên cứu khơng có ý nghĩa thống kê, quy trình kỹ thuật áp dụng vào thực tế, phục vụ cho nghiên cứu sâu với cỡ mẫu lớn 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Polak, Cavé H, "Neonatal diabetes mellitus: a disease linked to multiple mechanisms.," Orphanet Journal of Rare Diseases, no 2, p 12, 2007 [2] Grulich-Henn J, Wagner V, Thon A, et al., Entities and frequency of neonatal diabetes: data from the diabetes documentation and quality management system (DPV) [3] Metz C, Cavé H, Bertrand AM, et al; Group, NDM French Study, Neonatal diabetes mellitus: chromosomal analysis in transient and permanent cases [4] Gloyn AL et al, "Activating mutations in the gene encoding the ATPsensitive potassium-channel subunit Kir6.2 and permanent neonatal diabetes," The new england journal of medicine, vol 350, pp 18381849, 2004 [5] Rudy Bilous and Richard Donnelly, "Normal Physiology of Insulin Secretion and Action," in Handbook of Diabetes, 2010 [6] Polin Haghvirdizadeh, Zahurin Mohamed, Nor Azizan Abdullah, Pantea Haghvirdizadeh, Monir Sadat Haerian Batoul Sadat Haerian , "KCNJ11: Genetic Polymorphisms and Risk of Diabetes Mellitus," Journal of Diabetes Research, p 2015: 908152, 2015 [7] Seino S, Miki T, "Physiological and pathophysiological roles of ATPsensitive K+ channels.," Prog Biophys Mol Biol, vol 81, no 2, pp 133176, 2003 [8] Andrew T Hattersley , Frances M Ashcroft, "Activating Mutations in Kir6.2 and Neonatal Diabetes," Diabetes, vol 54, no 9, pp 2503-2515, 2005 [9] Sarah E Flanagan et al, "Mutations in atp sensitive K+ channel genes cause transient neonatal diabetes and permanent diabetes in childhood or 53 adulthood," Diabetes, vol 56, no 7, pp 1930-1937, 2007 [10] Jorn V Sagen et al, "Permanent Neonatal Diabetes due to Mutations in KCNJ11 Encoding Kir6.2," Diabetes, vol 53, no 10, pp 2713-2718, 2004 [11] Tohru Yorifuji et al, " The C42R Mutation in the Kir6.2 (KCNJ11) Gene as a Cause of Transient Neonatal Diabetes, Childhood Diabetes, or LaterOnset, Apparently Type Diabetes Mellitus," J Clin Endocrinol Metab, vol 90, no 6, pp 3174-3178, 2005 [12] Flanagan, S.E., Edghill, E.L., Gloyn, A.L et al, "Mutations in KCNJ11, which encodes Kir6.2, are a common cause of diabetes diagnosed in the first months of life, with the phenotype determined by genotype," Diabetologia, vol 49, no 6, p 1190–1197, 2006 [13] Rica I et al, "The majority of cases of neonatal diabetes in Spain can be explained by known genetic abnormalities," Diabetes Med, vol 24, no 7, pp 707-713, 2007 [14] Anna L Gloyn, Frank Reimann et al, "Relapsing diabetes can result from moderately activating mutations in KCNJ11," Hum Mol Genet (2005) 14 (7): 925-934, vol 7, no 14, pp 925-934, 2005 [15] Massa O et al, "KCNJ11 activating mutations in Italian patients with permanent neonatal diabetes.," Human Mutation, vol 25, no 1, pp 2227, 2005 [16] Suzuki S et al , "Molecular Basis of Neonatal Diabetes in Japanese Patients," The Jornal of Clinical Endocrinol Metabolism, vol 92, no 10, pp 3979-3985, 2007 [17] Codner E et al, "High-dose glibenclamide can replace insulin therapy despite transitory diarrhea in early-onset diabetes caused by a novel R201L Kir6.2 mutation," Diabetes Care , vol 28, no 3, pp 758-759, 2005 [18] Edghill EL et al, "Origin of de novo KCNJ11 mutations and risk of 54 neonatal diabetes for subsequent siblings," The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, vol 92, no 5, pp 1773-1777, 2007 [19] E Markworth, C Schwanstecher and M Schwanstecher, "ATP4- mediates closure of panceatic beta-cell ATP-sensitive postasium channels by interaction with of identical sites," Diabetes, vol 49, no 9, pp 14131418, 2000 [20] Proks, Peter et al, "Molecular basis of Kir6.2 mutations associated with neonatal diabetes or neonatal diabetes plus neurological features," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , vol 101, no 50, p 17539–17544, 2004 [21] F M Ashcroft, "K-ATP channels and insulin secretion: a key role in health and disease," Biochemical Society Transactions, vol 2, no 34, pp 243 - 246, 2006 [22] McTaggart, J S., Clark, R H., & Ashcroft, F M., "The role of the KATP channel in glucose homeostasis in health and disease: more than meets the islet," The Journal of Physiology, vol 588, no 17, pp 3201-3209, 2010 55 DANH SÁCH BỆNH NHÂN STT Mã số Họ tên Giới SS1 Vũ Khả V Nữ SS2 Nguyễn Thị Khánh H Nữ SS3 Trần Gia P Nam ... trình xác định đột biến gen KCNJ11 gây bệnh đái tháo đường sơ sinh kỹ thuật giải trình tự gen thực nhằm mục tiêu: Hồn thiện quy trình xác định đột biến gen KCNJ11 gây bệnh đái tháo đường trẻ sơ sinh. .. thêm nucleotid gen Do phần lớn đột biến gen KCNJ11 gây bệnh đái tháo đường sơ sinh đột biến điểm nên phương pháp giải trình tự gen KCNJ11 coi tiêu chuẩn vàng để phát đột biến gen gây bệnh Hình 1.12... sinh Bước đầu xác định đột biến gen số bệnh nhân mắc đái tháo đường sơ sinh 3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đôi nét bệnh đái tháo đường sơ sinh 1.1.1 Định nghĩa Trong thể, để làm tăng đường huyết