Nghiên cứu tính đa hình gen ACE, AGT, NOS3 và MTHFR ở thai phụ tiền sản giật

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tiền sản giật tình trạng bệnh lý phổ biến ảnh hưởng đến phụ nữ mang thai toàn giới Tỷ lệ bệnh tiền sản giật thay đổi tùy theo vùng, nước Theo tổ chức y tế giới tỷ lệ mắc tiền sản giật khoảng 47% thai phụ [1] Tiền sản giật tai biến sản khoa thường gặp gây nhiều biến chứng cho thai phụ thai nhi, làm cho thai chậm phát triển tử cung, thai chết lưu, chậm phát triển tâm thần con, gây biến chứng sản giật, chảy máu, rau bong non nhiều biến chứng không hồi phục mẹ [2],[3],[4] Mặc dù có bước tiến vượt bậc việc chăm sóc điều trị tiền sản giật nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cho mẹ tử vong chu sản, chí quốc gia có dịch vụ chăm sóc sức khỏe tiên tiến [5] Ước năm có khoảng 50,000 thai phụ triệu trẻ tử vong tính tồn giới tiền sản giật [6] Chính vậy, việc phát sớm yếu tố nguy để có biện pháp chẩn đoán sớm can thiệp kịp thời nhằm ngăn ngừa giảm thiểu tối đa trường hợp tiền sản giật biến chứng cho thai phụ thai nhi đóng vai trò đặc biệt quan trọng cơng tác chăm sóc sức khỏe sinh sản, góp phần nâng cao chất lượng sống Tiền sản giật biết đến từ nhiều kỷ trước để chẩn đoán bệnh, chủ yếu dựa vào triệu chứng cổ điển tăng huyết áp, phù protein niệu Tuy nhiên, phương pháp chẩn đoán bộc lộ số khuyết điểm như: chẩn đoán tiền sản giật sớm từ tuần thứ 20 thai kỳ, xuất triệu chứng lâm sàng, dễ nhầm lẫn trường hợp tiền sản giật có triệu chứng khơng đầy đủ tiền sản giật xảy thai phụ có bệnh nội khoa mắc trước có thai có triệu chứng tương tự tiền sản giật Vì việc tìm kiếm phương pháp chẩn đốn có khả chẩn đốn sớm tiền sản giật việc làm cần thiết Gần đây, có nhiều nghiên cứu phân tích tương quan gen mục 2 tiêu dựa nghiên cứu đột biến đa hình thái đơn (single nucleotide polymorphisms, SNPs) gen phổ biến nhóm bệnh nhân tiền sản giật nhóm chứng Các nghiên cứu cho phép xác định gen cụ thể tham gia vào trình phát triển bệnh tiền sản giật, từ tiếp tục xác định nhóm người có nguy mắc bệnh tiền sản giật Trong năm gần đây, phương pháp sử dụng rộng rãi, góp phần xác định sớm nguy mắc bệnh tiền sản giật Các nghiên cứu cho thấy gen ACE, AGT, NOS3 MTHFR gen đa hình thái, nhiều đa hình nucleotide đơn gen tìm thấy tạo kiểu gen khác cộng đồng Chính khác biệt vài nucleotide SNPs gen làm thay đổi cấu trúc phân tử protein từ làm thay đổi tương tác hoạt động protein mã hố gen Tuy nhiên, khơng phải tất kiểu gen có khả thúc đẩy hình thành phát triển tiền sản giật Trên thực tế, người ta xác định số SNPs gen ACE, AGT, NOS3 MTHFR có vai trò quan trọng bệnh sinh tiền sản giật Việc xác định SNPs có vai trò quan trọng việc đánh giá nguy mắc bệnh tiền sản giật [7] Tại Việt Nam, việc nghiên cứu biến đổi di truyền mức độ phân tử ứng dụng kỹ thuật di truyền để chẩn đoán tiền sản giật chưa nhiều chưa có hệ thống Để đánh giá nguy mắc bệnh tiền sản giật, góp phần chẩn đốn sớm tìm biện pháp ngăn chặn kịp thời tiền sản giật nhằm mục đích giảm tỷ lệ tử vong cho thai phụ thai nhi, thực đề tài: “Nghiên cứu tính đa hình gen ACE, AGT, NOS3 MTHFR thai phụ tiền sản giật” với mục tiêu: Xác định tần số xuất SNP gen ACE, AGT, NOS3 MTHFR thai phụ tiền sản giật thai phụ bình thường Tìm hiểu mối tương quan tính đa hình gen ACE, AGT, NOS3 MTHFR với bệnh lý tiền sản giật 3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tiền sản giật 1.1.1 Khái niệm tiền sản giật Tiền sản giật tình trạng bệnh lý thai nghén gây nửa sau thời kỳ thai nghén gồm triệu chứng phổ biến phù, tăng huyết áp protein niệu [3],[4] 1.1.2 Tình hình mắc tiền sản giật giới Việt Nam Hiện chưa có nghiên cứu giải thích rõ nguyên nhân gây tiền sản giật Bệnh thường xảy vào ba tháng cuối thai kỳ, nhiên, TSG xảy giai đoạn sớm hơn, sớm vào khoảng 20 tuần tuổi thai Kể từ phát nay, tiền sản giật gọi nhiều tên khác Chủ yếu, tên gọi hội chứng tiền sản giật tên gọi tác giả Anh, Mỹ đưa [8] Năm 1928, Farber gọi “Nhiễm độc thai”, nước Đức gọi Gestosis Nước ta gọi bệnh albumin niệu có thai, thời gian dài gọi bệnh nhiễm độc thai nghén Năm 1985, tổ chức y tế giới đề nghị gọi rối loạn tăng huyết áp thai nghén thống gọi tiền sản giật Theo tổ chức y tế giới tỷ lệ mắc tiền sản giật khoảng 4-7% thai phụ toàn giới [1] Tỷ lệ mắc tiền sản giật dao động từ 2-5% thai phụ Tây Âu Bắc Mỹ đến 18% Châu Phi [9] Tại Anh thống kê năm 2003 cho thấy tỷ lệ 5-8% [10] Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc tiền sản giật tương đối cao, khoảng 56% (nếu lấy tiêu chuẩn huyết áp 140/90mmHg) [2] Theo thống kê Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2003, tỷ lệ mắc tiền sản giật 3,96% [11] 4 1.1.3 Nguyên nhân chế bệnh sinh Nguyên nhân sinh bệnh học tiền sản giật đến chưa rõ, biểu lâm sàng giống bệnh thận, hệ tim mạch, gan mắt Vì tiền sản giật có biểu bệnh nhiều quan đích nên người ta thường nghĩ tới chất, yếu tố gây ảnh hưởng đến đồng thời nhiều quan lúc Có nhiều giả thuyết nêu lên sau: * Giả thuyết co thắt mạch máu: Sự co thắt mạch máu gây tăng huyết áp, gây lắng đọng tiểu cầu, tạo huyết khối, dẫn đến thiếu oxy mô, gây hoại tử chảy máu rối loạn quan đích Co thắt mạch máu đoạn làm cho giảm lưu lượng máu qua thận, lưu lượng lọc máu cầu thận giảm dẫn đến lượng nước tiểu giảm, xuất protein niệu, urê, creatinin acid uric máu tăng Acid uric máu tăng coi dấu hiệu quan trọng đánh giá tiến triển bệnh nặng [2] * Thuyết Prostacyclin Thromboxan: Sơ đồ 1.1 Con đường tạo thành Prostacyclin Thromboxan 5 Prostacyclin (PGI2) sinh từ nội mạc mạch máu phần từ ngun bào ni có tác dụng giãn mạch, ức chế tập trung tiểu cầu, thúc đẩy tuần hoàn tử cung rau, giảm hoạt độ tử cung Thromboxan (TXA2) tổng hợp từ tiểu cầu, mô đệm nguyên bào nuôi bánh rau, chất gây co thắt mạch, ngưng tập tiểu cầu, giảm lưu lượng tuần hoàn tử cung rau tăng hoạt độ tử cung PGI2 TXA2 cân thai nghén bình thường Trong tiền sản giật, TXA2 tăng trội lên Walsh (1988) báo cáo progesteron bánh rau TSG tăng giả thiết nồng độ progesteron tăng ức chế sản sinh PGI2 [12] Spitz cộng (1988) báo cáo bệnh nhân nữ cao huyết áp dùng 81 mg aspirin ngày có khả chặn tổng hợp TXA2 khoảng 75%, tổng hợp PGI2 giảm 20%, PGE2 giảm 30% Nghĩa TSG, men cyclooxygenase biến đổi acid arachidonic (AA) thành PGI2 giảm TXA2 tăng dẫn đến tình trạng co thắt mạch nhạy cảm với truyền angiotensin II [13] Liệu pháp aspirin liều thấp làm giảm mạnh sản sinh TXA2, chẹn phần sản sinh PGI2 PGE2, tạo khả giãn mạch PGI2 Ở người thai nghén thường, PGI2 hoạt động bảo vệ, chống lại huyết khối Liệu pháp aspirin liều thấp chứng tỏ ức chế men cyclooxygenase hạn chế chuyển AA thành TXA2, ưu tiên tạo PGI2 cải thiện lâm sàng làm giảm nguy cho thai phụ bị nhiễm độc thai nghén, phòng ngừa TSG Những quan sát ủng hộ vai trò PGI2 phòng ngừa TSG sản giật [12],[13] * Thuyết tổn thương nội mạc mạch máu: Nội mạc khơng giữ vai trò giao diện dòng máu tế bào trơn mạch máu mà đóng vai trò việc điều hòa trương lực mạch máu thơng qua chất vận mạch Những chất tổng hợp tế bào nội mô hoạt tác động lên tế bào trơn theo kiểu cận tiết gây giãn mạch, nhờ oxit nitric (NO) ngược lại gây co mạch nhờ 6 endothelin-1 [14] Nội mạc mạch máu trì cân trạng thái giãn mạch co mạch, đông máu chống đông máu, kết dính chống ngưng kết tiểu cầu, tăng sinh chống tăng sinh, viêm chống viêm, oxy hóa chống oxy hóa Rối loạn chức nội mạc mạch máu xảy nội mạc mạch máu khả trì cân hệ thống đối lập Có nhiều yếu tố gây rối loạn chức nội mô thiếu máu cục bộ, stress oxy hóa, gốc tự do, tăng cholesterol máu, kích hoạt cytokine hệ thống q trình viêm, tăng homocysteine máu, tăng đường huyết kháng insulin, tăng huyết áp, nhiễm độc nội sinh (suy thận, viêm tụy ), nhiễm độc ngoại sinh (hút thuốc, vv….) Kết làm tăng hoạt động chức phân tử kết dính chemokine gây kích hoạt phản ứng viêm, co mạch làm thay đổi số đông máu Một dấu hiệu điểm khác rối loạn chức nội mô giảm hoạt tính NO (oxit nitric) Enzyme NOS type II (iNOS, từ cytokine) NO type III (eNOS NOS3 hình thành từ nội mạc mạch máu) xúc tác cho phản ứng chuyển L-arginine thành NO NO yếu tố giãn mạch nội sinh đóng vai trò quan trọng điều hòa lượng máu lưu thơng huyết áp thai kỳ Ngồi ra, NO ức chế kết dính tiểu cầu, bạch cầu bám dính vào nội mạc mạch máu Người ta thấy nội mạc mạch máu có yếu tố gây giãn mạch EDRF (Endotherium derived relaxing factor) yếu tố gây co mạch EDCF (Endotherium derived contracting factor) Trong thai nghén thường, EDRF EDCF cân tế bào nội mạc bị tổn thương, có cân chúng, EDCF tăng lên làm mạch máu bị co thắt gây tăng huyết áp, kết dính tiểu cầu [4] Trong tiền sản giật khơng có tượng xâm lấn ngun bào ni, tế bào nội mạc bị tổn thương, EDRF giảm dẫn tới co thắt mạch khu trú 7 truyền máu vào bánh rau hơn, có tăng áp Khi nội mạc mạch bị tổn thương gây protein niệu phù toàn thân Một dấu hiệu điểm rối loạn chức nội mô nồng độ homocysteine (Hcy) huyết tương người mẹ Nồng độ Hcy bình thường huyết tương thai phụ 3-5µmol/l Khi nồng độ Hcy>7 µmol/l xảy tiền sản giật nặng [15],[16] Bình thường có khoảng 50% Hcy chuyển hóa theo đường chuyển nhóm sulfur tạo cysteine 50% tái methyl hóa trở thành methionine Chất điều hòa hai đường chuyển hóa Hcy S-Adenosylmethionine (SAM) Khi cân methionine âm, nồng độ SAM thấp, Hcy chuyển hóa trực đường tái methyl hóa để tạo methionine tác dụng enzyme methionine synthetase (MS) có cofactor vitamin B12, chất phản ứng Methyltetrahydrofolate (methylTHF) tạo thành tác dụng xúc tác methyltetrahydrofolate reductase (MTHFR) Enzyme có ảnh hưởng gián tiếp, mạnh mẽ lên q trình tái gắn methyl Hcy Sơ đồ 1.2 Chuyển hóa homocysteine HCY 8 Khi nồng độ SAM cao, Hcy chuyển hóa trực đường tạo cystathionine cysteine hai phản ứng phụ thuộc vitaminB6 Những nghiên cứu chuột cho thấy SAM vừa chất ức chế MTHFR vừa chất kích thích cystathionine beta synthetase (CBS) [1] Nhóm methyl methionine hoạt hóa tích điện dương ngun tử lưu huỳnh, dễ dàng chuyển cho chất nhận khác acid nucleic (DNA RNA), protein, myelin, catecholamine, polysaccarid chất có phân tử lượng nhỏ Giảm khả methyl hóa ảnh hưởng nhiều đến phát triển, biệt hóa chức tế bào Q trình methyl hóa cần cho phát triển bào thai trẻ em [16] Bất kỳ cân q trình chuyển hóa Hcy dẫn đến thay đổi nồng độ Hcy máu Nếu xảy sai sót, thiếu hụt hay cân đối enzym, bao gồm coenzyme chúng vitamin B12, B6, acid folic, q trình chuyển hóa làm suy giảm chu trình methyl hóa làm tăng nồng độ Hcy tế bào xuất vào máu Một số yếu tố liên quan tới lối sống khơng giữ gìn sức khỏe (hút thuốc lá, uống rượu, dùng nhiều cà phê…), tình trạng thiếu dinh dưỡng với lượng acid folic, vitamin-B6, vitamin B12 đưa vào thiếu, hấp thu kém… góp phần quan trọng làm tăng Hcy máu [16],[1],[2] Một vài nghiên cứu gần đề cập đến vấn đề đột biến gen tổng hợp nên enzyme q trình chuyển hóa Hcy gây nên tăng nồng độ Hcy máu Gen MTHFR dễ bị đột biến (C677T polymorphism), đột biến xảy 1/2 hay 1/3 cặp alen tương ứng gây nên biến đổi enzyme MTHFR, làm giảm hoạt độ enzyme, làm tăng Hcy Một đột biến khác CBS17, đột biến đồng hợp tử CBS17 nguyên nhân dẫn đến tăng Hcy máu [3] Đột biến dị hợp tử làm giảm 50% hoạt động 9 enzyme CBS Đột biến gen CBS làm giảm hấp thu chất serine, pyridoxal phosphat [4] Người ta biết tế bào nội mạc mạch máu bị tổn thương thường tiết chất co mạch endothelin chất khác từ tế bào nội mạc Chúng ức chế đông máu hoạt hố chất plasminogen mơ tan huyết khối Khi tế bào nội mạc bị tổn thương, không bị chức bình thường mà sinh chất tiền đông (thay chất chống đông) chất co thắt mạch máu Do vậy, tổn thương nội mạc, nguyên bào nuôi đầu thai kỳ dễ gây rối loạn chức tế bào nội mạc Do đó, giải thích nhiều thay đổi sinh lý học bệnh * Hệ thống renin - angiotensin - aldosteron: Sơ đồ 1.3 Chuyển hóa hệ thống renin-angiotensin-aldosteron Sự thiếu máu thận (do tiểu động mạch tới cầu thận bị co thắt TSG), làm hoạt hóa tổ chức cạnh cầu thận sản xuất renin Renin có vai trò enzym biến angiotensinogen thành angiotensin I Dưới tác dụng enzym chuyển đổi angiotensin (ACE), angiotensin I biến đổi thành angiotensin II, angiotensin II tác động lên trơn thành mạch gây co mạch, tăng huyết áp Angiotensin II tác động lên vỏ thượng thận làm tiết 10 10 aldosteron gây giữ muối nước Nhờ có chế phản hồi âm tính, tăng huyết áp, giữ muối nước tăng lên làm cho thể giảm tiết renin để tự điều chỉnh Trong thai nghén bình thường: Thành phần hệ renin- angiotensinaldosteron tăng Trong nhiễm độc thai nghén: Một số thành phần hệ thống thấp so với thai nghén bình thường angiotensin II mức phạm vi khơng có thai, tức thấp so với mức thai phụ có thai nghén bình thường Bệnh nhân bị nhiễm độc thai nghén có mức angiotensin II thấp, tăng đáp ứng với tăng huyết áp Năm 1973, Gant cộng chứng minh: Truyền angiotensin II vào tĩnh mạch cho thai phụ có tuổi thai từ 28 - 32 tuần Nếu truyền angiotensin II với tốc độ 8ng/Kg/phút gây tăng huyết áp tâm trương lên 20mmHg thai phụ bình thường Ngược lại, truyền angiotensin II cho thai phụ tuổi thai với tốc độ 8ng/Kg/phút gây huyết áp tâm trương lên 20mmHg người xuất nhiễm độc thai nghén tháng cuối thai kỳ Test phát sớm thai phụ có biểu nhiễm độc thai nghén trước khoảng - 12 tuần với giá trị âm tính hay dương tính 90% đối tượng thử [17] Người ta cho đáp ứng chất tăng áp angiotensin II bị giảm thai phụ có huyết áp bình thường khả cảm thụ angiotensin II tế bào trơn mạch giảm (MacKanjee cộng sự, 1991) Sức kháng mạch với angiotensin II qua trung gian yếu tố khác, tăng tiết aldosteron Họ cho angiotensin II tác dụng lên cuộn mạch vỏ thượng thận Nhiều nghiên cứu cho trơn thành tiểu động mạch trơ với angiotensin II có mặt prostaglandin, hay chất giống prostagladin tổng hợp từ nội mạc mạch [18],[19] Sự trơ bị loại, dùng chất ức chế prostagladin indomethacin, aspirin [20] Có số mơ, tăng nhanh tổng hợp angiotensin hay giải phóng prostaglandin hay hai Ở thai KẾ HOẠCH TIẾN HÀNH Nội dung công việc Thu thập tài liệu Chuẩn bị dụng cụ- hóa chất Thu thập số liệu 4.Phân tích số liệu sơ Làm xử lý số liệu Phân tích số liệu viết luận văn Làm Slide tập báo cáo thử Báo cáo luận án thức 09-12 / 01/2016- 7-10 / 11-12 / 1-4 / 5-9 / 2015 06/2017 2017 2017 2017 2018 DỰ TRÙ KINH PHI Đây đề tài thực với hỗ trợ kinh phí từ dự án cấp nhà nước: “ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ GEN TRONG SẢN XUẤT CHIP SINH HỌC PHỤC VỤ CHẨN ĐỐN VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH LÝ TIM MẠCH” cơng ty cổ phần đầu tư Hoàng Nguyên làm chủ nhiệm đề tài PHỤ LỤC QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TỪ MÁU TOÀN PHẦN - Bước 1: Loại bỏ hồng cầu phá vỡ màng tế bào + Cho vào ống eppendorf 1.5 ml: 0.5ml dung dịch phá vỡ hồng cầu (Lysis buffer)+0.5ml máu tồn phần chống đơng EDTA + Trộn đều, ủ đá (10 phút) + Ly tâm 8000v/phút x 10 phút/4ºC + Loại dịch nổi, thu cặn A Lặp lại quy trình 2-3 lần tủa (nhân xác tế bào) từ nâu thành trắng đáy ống - Bước 2: Phá vỡ màng nhân + Ống eppendorf 1.5ml chứa cặn A + 0.5ml dung dịch K (dung dịch hỗ trợ phá màng tế bào cố định nhân) + Trộn đều, để 10 phút nhiệt độ phòng + Ly tâm 8000v/phút x 10 phút/4ºC + Loại dịch nổi, thu cặn B + Cặn B + 0.5ml dung dịch Lysis buffer +0.5µl SDS 10% + 10µl proteinase K + Sau đem ủ 56ºC/2h-3h kèm theo lắc nhẹ để phân hủy protein, hòa tan tủa thu dung dịch C - Bước 3: Tủa DNA + Thêm dung dịch Phenol:Chloroform:Isoamyl • Dung dịch C+0.5ml dung dịch Phenol:Chloroform:Isoamyl (25:24:1) dung dịch tủa protein • Trộn ly tâm 10000v/phút x 10 phút/4ºC • Hỗn hợp phân thành lớp: lớp có chứa DNA, lớp cặn tế bào, lớp dịch chiết • Thu lớp dịch cùng: dung dịch D Chú ý: Lặp lại bước lần để đảm bảo khơng lẫn tạp chất mẫu thu dung dịch D’ + Thêm dung dịch Chloroform: Isoamyl • Dung dịch D’ + 0.5ml Chloroform: Isoamyl (24:1) • Trộn ly tâm 10000v/phút x 10 phút/4ºC • Hỗn hợp phân thành lớp: thu lớp dịch (Dung dịch E) • Lặp lại bước lần thu dung dịch E’ (đã loại bỏ hoàn toàn protein) + Tủa DNA: • Trộn 1V dịch E + 2.5V Ethanol 100% + 0.1V Sodium Acetate 3M • Lắc đều, ủ qua đêm -20°C để kết tủa DNA • Ly tâm 13000v/phút x 20 phút/4ºC thu tủa F • Tủa F rửa 1ml Ethanol 70%, trộn ly tâm 13000v/phút x 10 phút/4ºC thu tủa DNA (lặp lại lần) • Tủa DNA để khơ tự nhiên (56 ºC), sau hòa tan đệm TE nước cất lần + Sản phẩm DNA tách chiết kiểm tra nồng độ độ tinh đo mật độ quang máy Nano Drop bước sóng 260nm 280nm + Sản phẩm đạt yêu cầu tỉ lệ A260/A280 = 1.8-2.0 Chú ý: Sản phẩm DNA tách chiết bảo quản 4ºC thời gian ngắn lưu giữ -20ºC thời gian dài PHỤ LỤC ĐO MẬT ĐỘ QUANG Kiểm tra nồng độ, độ tinh DNA phương pháp đo mật độ quang Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm base purin pyrimidin Giá trị mật độ quang bước sóng 260nm (OD260nm – Optical Density260 nm) mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic mẫu đo Độ tinh phụ thuộc vào tỷ số OD260nm/OD280nm Một acid nucleic gọi tỷ số 1,8 – 2,0 [78] Cách tiến hành: - Tra 2µl nước khủ vơ trùng vào giếng đo máy Nano Drope làm đối chứng -Tra 2µl mẫu vào đo mật độ quang bước sóng 260nm 280nm - Đọc kết hiển thị nồng độ DNA tính ng/µl OD PHỤ LỤC QUY TRÌNH TIẾN HÀNH PCR-RFLP Phản ứng PCR để xác định biến thể alen: Xác định tính đa hình gen MTHFR C677T NOS3 Glu298Asp, 4b/a thực phương pháp PCR sử dụng enzyme giới hạn xác định chiều dài đoạn cắt điện gel agarose (phương pháp RFLP) với cặp mồi sau đây: Stt Gen TRÌNH TỰ MỒI MTHFR C677T S: 5'-GTAAGGAGAAGGTGTCTG CGG CA-3' AS: 5'-ACGACG GTG CGG TGAGAG TG-3' NOS3 Glu298Asp S: 5'-GCC TGG АСС CCA GGA ATC-3' AS: 5'-CTA CCC AGT CAA ТСС CTA CG-3 NOS3 4a/b S: 5'- CGG CCC TAT GGT AGT GCC GT - 3' AS: 5'- ACT CTT AGT GCT GTG GTC CC - 3' Thành phần phản ứng PCR: Stt Thành phần Mồi dNTP PCR- buffer DNA Tổng thể tích Thể tích 6pM 250 µM 10µl 1µl 25 µl Chu trình luân nhiệt: Sau hotstart, bắt đầu biến tính DNA 95°С phút Sau đó: 95°С – 10 giây 65°С – 12 giây 35 chu kỳ 72°С – 12 giây 72°С – phút 12°С – ∞ - Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen (xem quy trình điện di sản phẩm PCR) - Thực cắt sản phẩm PCR với enzym đặc hiệu tương ứng Thành phần phản ứng cắt enzym: Stt Thành phần Sản phẩm PCR Đệm 10x enzym Nước Enzym (10 u/ μl) Thể tích 10 μl 1.5 μl 2.5 μl μl Tổng thể tích 15 μl - Hỗn hợp ủ 37 oC 12-18 (qua đêm) - Sản phẩm cắt điện di gel agarose 2-3% giống quy trình điện di sản phẩm PCR Phản ứng cắt enzym đạt yêu cầu băng điện di rõ nét, khơng có băng phụ PHỤ LỤC ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR CÁCH CHUẨN BỊ GEL AGAROSE 3% - Cân 3g agarose hòa tan 10ml boric acid EDTA (TBE) (sử dụng lò vi sóng) Sau agarose tan hết, để nguội 55- 60°C, đổ vào khuôn gel, tùy thuộc vào số lượng giếng cần cho điện di mà cài lược làm giếng từ 4- 6- 812 - Pha dung dịch TBE 10X : Tris 0,89M; acid boric 0,89M; EDTA 0,02M Tiến hành kỹ thuật điện di Thành phần Dung dịch TLPT chuẩn (Hae III) Ống chuẩn Ống bệnh nhân 10μl Sản phẩm PCR 9μl Dung dịch đệm 10X 1μl Tổng số 10μl 10μl - Đưa gel agarose vào máy điện di, cho TBE đến ngập gel - Dùng pipet đầu côn nhỏ hút dung dịch ống đưa vào giếng (10μl/giếng) - Máy điện di 80-100V (Mupid-Nhật Bản), điện di khoảng 30 phút - Sau điện di, gel ngâm vào Ethidium bromide 20 phút, rửa qua nước cất đưa vào soi đèn UV, chụp ảnh PHỤ LỤC QUY TRÌNH TIẾN HÀNH REALTIME PCR Phản ứng PCR-real time để xác định đột biến gen AGT M235T: Trình tự mồi: Stt Phản ứng AGT M235T realtime PCR AGT-235Up 5'-ATG TTG CTG CTG AGA AGA TTG АСА- 3' AGT-235Dn 5'-ТТТ GCC ТТА ССТ TGG AAG TGG АС- 3' Mồi AGT-235WT 5'-FAM-CCC TGA TGG GAG CCA GTG TGGA RTQ1- 3' AGT-235MUT 5'-JOE-CCC TGA CGG GAG CCA GTG Thành phần PCR Chu trình ln nhiệt TGGA RTQ1- 3' V=25 µl: 10 pM mồi, pM dò, 250 µМ dNTP, Taq-pol U (0,6 µl 5U pol µ, µl PCR-buffer 5X, DNA (50ng/µl) µl, them nước deion đến 25 µl Sau biến tính (95°С, phút) bắt đầu trình nhân gen với 60 chu kỳ, chu kỳ gồm: biến tính (95°С, 15 giây), gắn mồi kéo dài chuỗi (62°С, 60 giây.) Nếu có đột biến 235М allele (tương ứng với kiểu gen đồng hợp tử 235ММ) đường cong đồ thị xuất màu FAM Nếu có 235Т allele (Tương ứng với kiểu gen đồng hợp tử 235ТТ) đường cong đồ thị xuất kênh màu JOE Khi xuất đường cong hai màu FAM/JOE có nghĩa có 235М, 235Т allele tương ứng với kiểu gen 235МТ Phản ứng PCR-real time để xác định đột biến gen ACE I/D: Stt Phản ứng Realtime ACE I/D PCR PCR Mix – 20µl PCR-buffer-10 µl Thành phần PCR Taq-pol-AT (10x(N+1) µl 0,5x(N+1) µl) DNA (50ng/µl) - µl V=35 µl Sau biến tính (94°С, phút) bắt đầu q trình nhân gen với 45 chu kỳ, chu kỳ gồm: biến tính Chu trình ln nhiệt (94°С, giây), gắn mồi kéo dài chuỗi (67°С, giây.) PHỤ LỤC PHIẾU THƠNG TIN BỆNH NHÂN I Thơng tin chung - Họ tên: - Tuổi : Tuổi 45 - Địa : - Điện thoại: - Mã số hồ sơ: II Tiền sử 1.Tiền sản giật: Tiền sử gia đình mắc tiền sản giật: Số lần sinh con:……………Số lần sảy:……… Số lần đẻ non……… Các bệnh lý khác mắc trước đây: Đái tháo đường……….Tăng huyết áp……….Bệnh thận……………… Bệnh tự miễn………….Hội chứng kháng phospholipit………………… Béo phì III Tình trạng bệnh (thời điểm vào nghiên cứu) Thời điểm vào viện: Tuần thai…………… Số lượng thai………… Chiều cao (cm):……………… Cân nặng (kg):……………………… Triệu chứng lâm sàng: Huyết áp: >140/90mmHg…………… ; >160/110mmHg……………… Phù: Chân……………………Toàn thân……………Đa màng………… Triệu chứng năng: Nhức đầu………………………………………… Nhìn mờ………………………………………… Đau thượng vị hạ sườn phải………………… Thiểu niệu