BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

BÁO CÁO HẾT MÔN PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THUỐC TỪ DƢỢC LIỆU Lớp cao học khóa 2016 - 2018 Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền DỰA VÀO ĐỀ CƢƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY CÀ NA (Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeocarpaceae) Ngƣời hƣớng dẫn: PGS Ts Huỳnh Ngọc Thụy Học viên: Trì Kim Ngọc NỘI DUNG Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Tổng quan tài liệu Phương pháp nghiên cứu Kết dự kiến ĐẶT VẤN ĐỀ o Lĩnh vực sức khỏe nói đến nhiều tác hại chất oxy hố o Gốc tự sinh thể người o Tăng nhiều gốc tự gây viêm nhiễm quan, bệnh lý tim mạch, bệnh thần kinh… o Đặt vấn đề dùng chất chống oxy hóa ngoại sinh với mục đích phòng bệnh, nâng cao sức khỏe, chống lão hóa ĐẶT VẤN ĐỀ (tt) Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeocarpaceae) mọc hoang tỉnh miền Tây, Cà na nguồn nguyên liệu tiềm năng, chưa khai thác, sử dụng mức Đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hƣớng tác dụng chống oxy hóa Cà na (Elaeocarpus hygrophilus Kurz, Elaeocarpaceae)” thực nhằm: làm sáng tỏ thành phần hoạt tính chống oxy hóa từ Cà na, phục vụ cho thử nghiệm sinh học sau MỤC TIÊU ĐỀ TÀI • Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro thử nghiệm dập tắt gốc tự DPPH cao chiết từ Cà na • Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa mạnh qua sàng lọc mơ hình DPPH • Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa chất tinh khiết thu sau phân lập TỔNG QUAN • Thực vật học • Thành phần hóa học • Các phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT Tên gọi: •Tên Việt Nam: Cà na, Cơm háo ẩm •Tên khoa học: Elaeocarpus hygrophilus Kurz •Tên khác: Elaeocarpus glandulosus Wall Ex Merr Elaeocarpus madopetalus Pierre [40] Phân bố: - Thế giới: Thái Lan, Myanma, Campuchia [39] - Trong nước: Đồng Nai, Long An, Tiền Giang, Đồng Tháp [39] Bộ phận dùng: Lá khô Thu hoạch: Quanh năm TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT Đặc điểm: • Cây gỗ lớn (đến 25 m), gỗ màu trắng, nhánh non lơng • Phiến bầu dục, thon ngược, dài 7-9 cm, rộng 2,5-3 cm, chóp tròn hay tà, bìa có cưa thưa, cuống dài 1-2 cm, trước rụng có màu đỏ Hình 1.1 Tồn Cà na TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT • Cụm hoa chùm, búp hoa hình chóp, đài có lơng màu bạc, hoa năm cánh, cánh hoa có 18-20 rìa, 25-27 nhị, bầu nhụy có lơng, bầu • Quả nhân cứng hình bầu dục nhọn, dài cm, hạt [39] Cơng dụng • Rễ, quả, người dân dùng làm thuốc có tác dụng nhiệt, giải độc, sinh tân dịch • Vỏ có tinh dầu tanin dùng tắm ghẻ, chống dị ứng sơn hoá chất bảo vệ da, lọc máu cho phụ nữ sanh • Uống nước sắc rễ có tác dụng lọc máu, bảo vệ gan Quả dùng làm mứt, muối dưa, ô mai [39] SƠ ĐỒ QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT Bột Cà na Chiết với cồn nồng độ thích hợp DC cồn Loại cồn, thêm nƣớc, lắc phân bố n-hexan CHCl3 EtOAc DC lại DC n-hexan DC CHCl3 DC EtOAc Cô Cô Cô Cô Cao nhexan Cao CHCl3 Cao EtOAc Cao nƣớc Khảo sát tác dụng chống oxy hóa NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát tác dụng chống oxy hóa thử nghiệm DPPH Nguyên tắc • DPPH gốc tự có cực đại hấp thu 517 nm • Các chất chống oxy hóa trung hòa gốc tự DPPH cách cho hydrogen • DPPH bị khử chuyển màu từ tím sang vàng giảm độ hấp thu bước sóng 517 nm • Đo giảm độ hấp thu xác định khả chống oxy hóa chất nghiên cứu Ưu điểm: Đơn giản, nhanh, ổn định Được sử dụng rộng rãi để sàng lọc chất chống oxy hóa NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát tác dụng chống oxy hóa thử nghiệm DPPH Tiến hành • Pha dung dịch DPPH: 0,2-1 mM/MeOH • Các cao chiết chất phân lập pha MeOH, cao tan pha DMSO (dimethylsulfoxid) để trợ tan Nồng độ mg/ml • Pha dd đối chiếu acid ascorbic nồng độ: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 µg/ml MeOH để xác định IC50 so sánh kết với mẫu thử • Phản ứng thực chỗ tối, sau 30 phút đến ổn định đo quang bước sóng 517nm NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát tác dụng chống oxy hóa thử nghiệm DPPH Tiến hành (các mẫu thực giếng 96 lỗ) • Pha hỗn hợp phản ứng Ống DD thử (ml) DD MeOH (ml) DD DPPH (ml) Dung môi Chứng 3,5 0,5 Thử 0,5 0,5 • Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO(%) = [(Abschứng - Absthử)/ (Abschứng - Abstrắng)]x100 Abs: độ hấp thu bước sóng 517 nm 26 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát tác dụng chống oxy hóa thử nghiệm DPPH Tiến hành: • Chọn cao và chất phân lập có HTCO mạnh, xác định IC50 so sánh với acid ascorbic • Cách tính giá trị IC50 (IC50: Nồng độ có HTCO 50%) Pha giai mẫu có nồng độ khác Vẽ đồ thị HTCO theo nồng độ Xác định PT hồi qui tuyến tính y =ax + b Thế giá trị y = 50% → x (IC50 tính theo nồng độ cuối mẫu sau pha) 27 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phân lập xác định cấu trúc Phân lập chất cao có HTCO mạnh Dùng kỹ thuật sắc ký: sắc ký cột nhanh, cột cổ điển,… để tách chất Tinh khiết hóa Dùng phương pháp loại tạp thích hợp: than hoạt, lọc rửa, sắc ký cột, kết tinh lại …để làm Xác định cấu trúc chất phân lập đƣợc Dựa vào điểm chảy, phổ UV, IR, MS phổ NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY) 28 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát tác dụng chống oxy hóa chất phân lập đƣợc Mẫu thử Các hợp chất tinh khiết phân lập từ cao phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa sàng lọc Mơ hình thử nghiệm In vitro: Thử nghiệm đánh bắt gốc tự DPPH 29 KẾT QUẢ DỰ KIẾN Dự kiến hoàn tất thu đƣợc kết sau • Cao chiết tồn phần cao phân đoạn phân cực tăng dần Cà na • Cao phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa mạnh • Chất tinh khiết phân lập từ cao phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa mạnh • Hoạt tính chống oxy hóa chất tinh khiết • Dữ liệu phổ xác định cấu trúc chất tinh khiết TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Văn Bảo (2001), "Nghiên cứu hoạt độ số enzym chống oxy hóa hồng cầu trạng thái chống oxy hóa tồn phần huyết tương người bị thâm nhiễm chì" Luận văn thạc sỹ y học, Trường đại học y Hà Nội Bộ y tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV Hà Nội: Nhà xuất Y học Trương Ngọc Dương (2009), "Nghiên cứu nồng độ c-peptid, insulin, tự kháng thể kháng insulin, số số oxy hóa/chống oxy hóa bệnh nhân đái tháo đường typ 1" Luận án tiến sĩ y học, Học viện Quân y, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam NXB trẻ Hồng Tích Huyền (1992), Gốc tự dược lý học độc chất học, Một số chuyên đề hóa sinh tập Nhà xuất Y học TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Liễu, Nguyễn Bá Vượng (2011), Gốc tự hệ thống chống oxy hóa NXB Học viện Quân Y Viện dược liệu (2006), "Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo" Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật: p 279 – 292 Lê Thị Thu (2008), "Nghiên cứu số số đánh giá tình trạng stress oxy hóa tác dụng chống oxy hóa Belaf bệnh nhân đái tháo đường týp 2" Luận án tiến sĩ y học, Học viện Quân y, Hà Nội Nguyễn Bá Vượng (2011), "Nghiên cứu thay đổi hoạt độ số enzym chống oxy hóa công nhân tiếp xúc nghề nghiệp với trinitrotoluen động vật thực nghiệm-Tác dụng Belaf" Luận án tiến sĩ y học, Học viện Quân y, Hà Nội Tiếng Anh 10 Vidya AD, Devasagayam TP (2007), "Current status of Herbal drug in India" An overview J Clin Biochem Nutr Vol 41: p 1-11 11 Michalel Antolovich and et al (2001), "Methods for testing antioxidant activity" the analyst journal 12 Balz Frei and et al (1988), "Antioxidant defences and lipid peroxidation in human blood plasma" Proc Natl Acad Sci 35: p 69-71 13 Benjanarasut, D and e al (2002), "Extraction and separation of alpha hydroxy acids from Thai fruits" Research Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chiang Mai University: p 17 14 Rice.-Evans CA and Diplock AT (1993), "Current status of antioxidant therapy" Free Radic Biol Med Vol 15: p 77-96 15 Chase, M.W (2009), "An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III" Botanical Journal of the Linnean Society: p 105-121 16 Cord, Joe M (1993), "Human disease, free radicals, and the oxidant_antioxidant balance" The Canadian Society of Clinical Chemist 17 Birben E Sahiner U.M and et al (2012), "Oxidative stress and antioxidant defense" WAO Journal Vol 5: p 9-19 18 Cadenas E and Boveris A (2005), "Mitochondrial free radical production, antioxidant defenses and cell signaling" The Handbook of Environmental Chemistry 2: p 219-234 19 Sugawara E., Nakamura K and et al (1991), "Lipid peroxidation and concentration of glutathione in erythrocytes from workers exposed to lead" British Journal of Industrial Medicine Vol 48(4): p 239-242 20 Wang H., Cao G and et al (1996), "Total antioxidant capacity of fruits" Journal of Agricultural and Food Chemistry Vol 44(3): p 701-705 21 Barry H and John M.C G (2001), "Antioxydant defences" Free Radicals in Biology and Medicine, Oxford University press Vol 3: p 225-231 22 Shi HL, Noguchi N and et al (1999), "Comparative study on dynamics of antioxidative action of α- tocopheryl hydroquinone, ubiquinol and α- tocopherol, against lipid peroxidation" Free Radical Biology & Medicine Vol 27(3-4): p 334-346 23 Sastre J., Pallardo F V and et al (2005), "Glutathion" The Handbook of Environmantal Chemistry Vol 2: p 91-108 24 Brown JE and Rice.-Evan CA (1998), "Luteolin-rich Artichoke extract protects low density lipoprotein from oxidation in vitro" Free Radic Res Vol 29(3): p 247-255 25 Lin JK., Lin CH and et al (1998), "Survey of catechins, gallic acid and methylxantines in green, oolong, puerh and black teas" Agricultural ang food chemistry Vol 46: p 3635-3642 26 Bokara K.K, Blaylock I and et al (2009), "Influence of lead acetate on glutathione and its related enzyms in different regions of rat brain" Journal of Applied Toxicology Vol 29(5): p 452-458 27 Jomova K., Valko M (2011), "Advances in metal- induced oxidative stress and human disease" Toxicology Vol 283(2-3): p 65-87 28 K., S., Powers and et al (2008), "Exercise-induced oxidative stress: cellular mechanisms and impact on muscle force production" Physiological Reviews Vol 88(4): p 1243-1276 29 Kubola, J., S Siriamornpun, et al (2011), "Phytochemicals, vitamin C and sugar content of Thai wild fruits" Food Chemistry Vol 126(3): p 976977 30 Kuposak, S and M Manomaiwajee (2016), "Oxidative stability of salad dressing with spanish plum leaf extract" journal of food mesurement and characterization Vol 10(2): p 201-209 31 Lobo, V., A Patil and et al (2010), "Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact on human health" Pharmacognosy Reviews 32 Levine M., Ramsey SC and et al (1999), "Criteria and recommendation for Vitamin C intake" JAMA Vol 281(15): p 1415-1423 33 M., Samano J.M and et al (2012), "Effect of acute extremely low frequency electromagnetic field exposure on the antioxidant status and lipid levels in rat brain" Archives of Medical Research Vol 43(3): p 183189 34 Krinsky NI (1992), "Mechanism of action of biological antioxidants" Experimental Biology and Medicine 200(2): p 248-254 35 Acharya U.R., Rathore R M and et al (2003), "Role of vitamin C on lead acetate induced spermatogensis in swiss mice" Environmental Toxicology and Pharmacology 13: p 9-14 36 Griffiths HR (2004), "Chemical modifications of biomolecules by oxidants" The Handbook of Environmental Chemistry 20: p 33-62 37 Furuta S., Nishiba Y and et al (1997), "Fluorometric assay for screening antioxidative activities of vegetables" Journal of Food Science Vol 62(3): p 526-528 38 Kasperczyk S., Birkner E and et al (2004), "Activity of superoxide dismutase and catalase in people protractedly exposed to lead compounds" Ann Agric Environ Med Vol 11(2): p 291-296 Trang Web 39 Trung tâm liệu thực vật Việt Nam, Elaeocarpus hygrophilus 2016 [ngày truy cập 2016 13/04] [http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Elaeocarpus%20hygr ophilus&list=species] 40 Bản danh sách thực vật năm 2013 [ngày truy cập 2016 13/04] [http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2785630] ... thử nghiệm ban đầu NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU • Ngun liệu – hóa chất – trang thiết bị • Phương pháp nghiên cứu NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ Nguyên liệu Lá Cà na (Elaeocarpus... (Quả) CÁC PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA • Phương pháp thử nghiệm độ ổn định dầu béo • Phương pháp xác định giá trị Peroxid • Phương pháp theo dõi liên hợp dien • Phương pháp peroxy...NỘI DUNG Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Tổng quan tài liệu Phương pháp nghiên cứu Kết dự kiến ĐẶT VẤN ĐỀ o Lĩnh vực sức khỏe nói đến nhiều tác hại chất