Nghiên cứu bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac

Phân tích ảnh hưởng của các thành phần công thức đến khả năng giải phóng dược chất in vitro của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 40... Vì vậy, Bộ môn Bào chế đã tiến hành nghiên cứu b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỒNG VÂN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾVÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG

NHŨ TƯƠNG NANO NHỎ MẮTDICLOFENAC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỒNG VÂN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾVÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG

NHŨ TƯƠNG NANO NHỎ MẮT DICLOFENAC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHIỆP DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ

MÃ SỐ: 607301

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trần Linh

HÀ NỘI 2012

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và anh chị kĩ thuật viên trong bộ môn Bào chế, cùng các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình chỉ dạy và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới bà, cha mẹ, em trai, người thân, bạn

bè của tôi, những người đã luôn động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, 27/9/2012 Học viên

Nguyễn Hồng Vân

1.2.2 Cấu tạo của mắt và các yếu tố cản trở sự hấp thu dược chất 4

1.2.3 Những giải pháp cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhãn khoa 5

1.4 Một số nghiên cứu về nhũ tương nano dùng cho nhãn khoa 14

2.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ 19

2.3.3 Phương pháp xác định tỉ lệ dược chất được nhũ hóa 20

2.3.4 Phương pháp đánh giá giải phóng thuốc in vitro 20

2.4 Phương pháp thiết kế thí nghiệm, đánh giá ảnh hưởng của thành

phần công thức, thông số máy, lựa chọn công thức bào chế, thông số thích hợp

22

3.2 Xác định công thức và quy trình bào chế cơ bản 25

3.4 Đánh giá ảnh hưởng của các thành phần công thức đến một số đặc

tính vật lý của nhũ tương nano

29

3.4.2 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến các thông số vật lí của hệ 31

3.5 Đánh giá ảnh hưởng của các thành phần trong công thức đến khả

năng giải phóng in vitro của NTN nhỏ mắt

3.5.4 Phân tích ảnh hưởng của các thành phần công thức đến khả năng

giải phóng dược chất in vitro của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac

40

3.6 Đánh giá một số đặc tính khác của NTN nhỏ mắt diclofenac 46

3.7 Đánh giá độ ổn định của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 47

3.7.1 Độ ổn định vật lí cúa nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 47

3.7.2 Độ ổn định về hàm lượng của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 50

3.7.3 Độ ổn định về tỉ lệ dược chất trong pha dầu của nhũ tương nano

4.1 Về dạng bào chế nhũ tương có kích thước nano dùng cho mắt 55

4.2 Về thành phần nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 56

4.3 Về quy trình bào chế nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 57

4.4 Về một số đặc tính vật lí của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 58

4.5 Về tỉ lệ dược chất trong pha dầu của nhũ tương nano nhỏ mắt

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt

Danh mục các bảng, biểu

Bảng 1.1 Một số chế phẩm nano trên thị trường 13

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid diclofenac 24

Bảng 3.2 Các thành phần trong công thức bào chế nhũ tương diclofenac 26

Bảng 3.4 Các biến phụ thuộc thông số vật lí 28

Bảng 3.5 Các biến phụ thuộckhả năng giải phóng in vitro 28

Bảng 3.6 Thiết kế thí nghiệm cho NTN nhỏ mắt acid diclofenac 29

Bảng 3.7 Các thông số vật lí của nhũ tương nhỏ mắt nano diclofenac 30

Bảng 3.8.Ảnh hưởng của các biến độc lập đến các thông số vật lí của nhũ

tương

31

Bảng 3.9 Kết quả luyện mạng neutron nhân tạo 32

Bảng 3.10: % DC GP của 3 công thức NTN qua màng thẩm tích và màng 80 nm

38

Bảng 3.11 % DC GP tại các thời điểmcủa NTN nhỏ mắt diclofenac 39

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình giải phóng in vitro 40

Bảng 3.13 Kết quả luyện mạng neutron nhân tạo 41

Bảng 3.14 Tỉ lệ dược chất trong pha dầu của một số mẫu NTN 47

Bảng 3.15 KTTP trung bình, PDI của các mẫu nhũ tương ở thời điểm 6

diclofenac sau 6 tháng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.2 Ba thế hệ nhũ tương nano 7

Hình 1.3 Quy trình bào chế NTN (phương pháp mới) 9

Hình3.1 Đường chuẩn biểu diễnmối tương quan giữa nồng độ acid

diclofenac và diện tich pic

Hình 3.3 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ CDH và thời gian đến

KTTP NTN (loại CDH thân nước 1, Span 80 0,03%, Transcutol 0,015%, PG 7,5%, loại pha dầu 1, tốc độ 13000 vòng/phút)

Hình 3.5 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ PG và số loại CDH đến độ

đồng đều KTTP của NTN (tỉ lệ CDH thân nước 1,5%, Span 80 0,03%,

Transcutol 0,015%, loại pha dầu 1, tốc độ 13000 vòng/phút, thời gian 7,5

phút)

35

Hình 3.6 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ CDH thân nước và tỉ lệ

Transcutol HP đến thế zeta của NTN (loại CDH thân nước 1, Span 80

0,03%, PG 7,5%, loại pha dầu 1, tốc độ 13000 vòng/phút, thời gian 7,5 phút

Hình 3.8 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của loại CDH thân nước và tỉ lệ

Span đến phần % DC GP ở thời điểm 1 giờ (tỉ lệ CDH thân nước 1,5%,

42

Transcutol 0,015%, PG 7,5%, loại pha dầu 1, tốc độ 13000 vòng/phút, thời

gian 7,5 phút)

Hình 3.9 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ PG và loại pha dầu đến

% DC GP ở thời điểm 2 giờ (loại CDH thân nước 1, tỉ lệ CDH thân nước

1,5%, Span 80 0,03%, Transcutol 0,015%, tốc độ 13000 vòng/phút, thời gian 7,5 phút)

43

Hình 3.10 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của thời gian và tốc độ phân cắt

đến phần trăm DC giải phóng sau 2 giờ 30 phút (loại CDH thân nước 1, tỉ lệ

CDH thân nước 1,5%, Span 80 0,03%, Transcutol 0,015%, PG 7,5%, loại

pha dầu 1)

44

Hình 3.11 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tốc độ phân cắt và tỉ lệ

Transcutol HP đến % DC GP ở thời điểm 3 giờ (loại CDH thân nước 1, tỉ lệ CDH thân nước 1,5%, Span 80 0,03%, PG 7,5%, loại pha dầu 1, thời gian

7,5 phút)

45

Hình 3.12 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ Transcutol HP và tỉ lệ

CDH thân nước đến % DC GP ở thời điểm 4giờ (loại CDH thân nước 1,

Span 80 0,03%, PG 7,5%, loại pha dầu 1, tốc độ 13000 vòng/phút, thời gian 7,5 phút)

46

Hình 3.13 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tốc độ phân cắt và loại pha dầu

đến % tăng KTTP sau 6 tháng (loại CDH thân nước 1, tỉ lệ CDH thân nước

1,5%, Span 80 0,03%, Transcutol 0,015%, PG 7,5%, thời gian 7,5 phút)

49

Hình 3.14 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của pha dầu và tỉ lệ PG đến % tăng KTTP của NTN nhỏ mắt diclofenac bảo quản ở điều kiện phòng sau 6 tháng (loại CDH thân nước 1, tỉ lệ CDH thân nước 1,5%, Span 80 0,03%,

Transcutol 0,015%, tốc độ 13000 vòng/phút, thời gian 7,5 phút)

50

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong 2 thập kỉ gần đây, các thuốc chống viêm không steroid điều trị chống viêm tại mắt, được sử dụng ngày càng rộng rãi, bên cạnh các thuốc chống viêm steroid Diclofenac là dẫn chất acid phenyl acetic thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid, có ưu điểm chính không gây ra các tác dụng phụ như thuốc chống viêm steroid như giảm đáp ứng miễn dịch, gây ra bệnh đục thủy tinh thể, tăng nhãn

áp và ức chế sự tái tạo của lớp biểu mô giác mạc[29]

Các dạng thuốc nhỏ mắt luôn có sinh khả dụng thấp do sự bài tiết dịch nước mắt và sự tháo rút theo ống mũi-lệ nên cần được sử dụng thường xuyên để đạt được hiệu quả điều trị Một số dạng bào chế đã được áp dụng như hỗn dịch, thuốc mỡ, miếng đặt, gel thân nước… với mục đích tăng thời gian lưu thuốc, tránh dùng thuốc nhiều lần nhưng lại làm mờ mắt, hoặc gây bất tiện khi sử dụng

Hiện trên thị trường chỉ có dạng thuốc nhỏ mắt natri diclofenac 0,1% Vì vậy, Bộ môn Bào chế đã tiến hành nghiên cứu bào chế nhũ tương nanonhỏ mắt diclofenac nhằm làm tăng tính thấm dược chất, kiểm soát giải phóng thuốc và đưa thuốc tới đích tác dụng, phù hợp với yêu cầu tác dụng nhanh, duy trì kéo dài, hiệu quả và thuận tiện cho người sử dụng Nhũ tương nano diclofenac đã được nghiên cứu bào chế theo phương pháp siêu âm, và đánh giá một số đặc tính[5]

Tiếp theo những nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac”

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Thông tin về dược chất diclofenac

- Hệ số phân bố dầu nước (octanol/nước):

Acid diclofenac log P = 1,69[35], pKa = 3,8 Natri diclofenac log P = 13,4, pKa = 4 [13]

- Hấp thụ UV:

Acid diclofenac: λmax (methanol) 285 nm, λmax (acetonitril) 278nm [43]

Tên khoa học: Acid 2-[(2,6-diclorophenyl)amino]benzeneacetic

Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2

Khối lượng phân tử: 296,15

Tên khoa học: Natri 2-[(2,6-diclorophenyl)amino]benzeneacetat

Công thức phân tử: C14H10Cl2NNaO2

Khối lượng phân tử: 318,14[2], [48]

Natri diclofenac λmax (methanol) 285nm, λmax (đệm phosphat pH 7,2) 276 nm [48]

- Tính chất hóa học: Là một dẫn chất của anilin, diclofenac có thể bị oxi hóa:

+ Dung dịch trong methanol, thêm acid nitric đặc sẽ có màu đỏ nâu

+ Dung dịch chế phẩm trong ethanol cho phản ứng với các dung dịch kalifericyanid, sắt (III) clorid, và acid hydrocloric sẽ cho màu xanh và có tủa Natri diclofenac có thêm phản ứng của ion natri

- Định tính: ngoài các phản ứng hóa học trên còn có đo phổ tử ngoại và sắc kí lớp mỏng

và sự kết tụ tiểu cầu [3]

- Chỉ định: Dung dịch nhỏ mắt 0,1% natri diclofenac giảm đau các tổn thương biểu

mô do chấn thương, phẫu thuật, điều trị viêm sau phẫu thuật, các bệnh viêm mạn tính không lây nhiễm, ngăn ngừa thu hẹp đồng tử trong phẫu thuật đục thủy tinh thể, giảm các triệu chứng do viêm màng kết mạc [51]

- Tác dụng phụ: nhìn mờ, điểm tối thị giác, đau nhức mắt, nhìn đôi

- Thận trọng: diclofenac nhỏ mắt có thể làm chậm liền sẹo

1.2 Thuốc nhỏ mắt

1.2.2 Định nghĩa

Thuốc nhỏ mắt là dung dịch nước, dung dịch dầu, nhũ tương hoặc hỗn dịch vô khuẩn của một hay nhiều hoạt chất, dùng để nhỏ vào mắt Chế phẩm cũng có thể được bào chế dưới dạng khô (bột, bột đông khô, viên nén) vô khuẩn, được hòa tan

hoặc phân tán vào một chất lỏng vô khuẩn thích hợp khi dùng [4]

1.2.2 Cấu tạo của mắt và các yếu tố cản trở sự hấp thu dược chất

- Hàng rào sinh lí của hệ thống nước mắt: khi nhỏ thuốc nhỏ mắt vào vùng trước giác mạc, phần thể tích thừa ra ngoài sức chứa của mắt sẽ bị trào ra má, phần còn lại tháo rút rất nhanh theo ống lệ - mũi để lập lại thể tích sinh lí bình thường của màng nước mắt Hơn nữa, hoạt động tiết nước mắt (tăng khi mắt bị viêm), chớp mắt sẽ tiếp tục pha loãng và rửa trôi lượng thuốc còn lại làm giảm nồng độ dược chất ở vùng trước giác mạc, làm giảm nồng độ dược chất, giảm tốc độ và mức độ khuếch tán dược chất qua giác mạc Khi công thức thuốc chứa thành phần gây kích ứng mắt

sẽ tăng nhanh hoạt động chớp mắt và tiết nước mắt để bảo vệ mắt, làm giảm mạnh

thời gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc

Sự hấp thu thuốc ở vùng trước giác mạc còn phụ thuộc vào lớp màng nước mắt, có thể tích 7,4µl, gồm 3 lớp: lớp lipid ngoài, lớp nước giữa, và trong cùng là lớp dịch nhầy bao phủ bề mặt lớp biểu mô giác mạc và kết mạc Màng nước mắt là dung dịch đệm pH 7,4, chứa ion, lipid, protein (lyzozym, albumin, glycoprotein).Tương tác với protein trong lớp nước của màng nước mắt làm giảm nồng độ thuốc tự do có khả năng khuếch tán qua hàng rào mô Với mắt không viêm, yếu tố này không ảnh hưởng nhiều, vì protein chỉ chiếm 0,7% trong dịch nước mắt,

tuy nhiên tỉ lệ này tăng lên khi mắt bị viêm[42]

- Giác mạc: gồm 3 lớp mô song song, lớp biểu mô, lớp đệm, và lớp nội mô Lớp biểu mô giác mạc là lớp quyết định kiểm soát sự hấp thu vận chuyển dược chất qua giác mạc, còn lớp đệm và nội mô chỉ kiểm soát sự hấp thu của các hợp chất thân dầu nhỏ [28] Với cấu trúc thân lipid-nước-lipid của các lớp mô của giác mạc, sự thấm qua giác mạc của các phân tử dược chất còn lưu lại được ở màng nước mắt

phụ thuộc rất lớn vào hệ số phân bố dầu-nước của dược chất.Các dược chất có hệ số phân bố dầu-nước trong khoảng từ 10-100 sẽ dễ dàng thấm qua niêm mạc

- Kết mạc: Phần lớn các dược chất hấp thu qua kết mạc chủ yếu đi vào vòng tuần hoàn máu, trước khi có thể đi vào các mô bên trong mắt, vì vậy hấp thu qua kết mạc

là 1 yếu tố làm giảm sinh khả dụng thuốc nhãn khoa, trừ trường hợp đích tác dụng

của thuốc chính là kết mạc [1], [32]

1.2.3 Những giải pháp cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhãn khoa

Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt qui ước thường rất thấp, chỉ khoảng 1% - 3% lượng dược chất có trong liều thuốc đã đưa vào mắt là thấm qua được giác mạc

và phân bố tới nơi tác dụng tại các khoang trong mắt Nguyên nhân là do cơ chế bảo

vệ sinh lý cũng như cấu tạo giải phẫu của mắt

Một số biện pháp làm tăng sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt qui ước:

- Tăng thời gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc: hạn chế gây kích ứng mắt, chất làm tăng độ nhớt, chất kết dính sinh học, bào chế hỗn dịch, thuốc mỡ, gel, hệ cài đặt

ở mắt…

- Tăng tính thấm của giác mạc với dược chất: sử dụng các chất làm tăng tính thấm của biểu mô giác mạc với dược chất: chất tạo phức chelat với ion calci (natri edetat), CDH (Tween 80, Brij…), thay đổi tính thấm của dược chất với biểu mô giác mạc (tiền thuốc)

- Hiện nay các hệ tiểu phân như: vi cầu, vi nang, hỗn dịch, nhũ tương, liposom, niosom, dendrime, tiểu phân chứa trong kính tiếp xúc,… có kích thước nm đến µm

sử dụng cho nhãn khoa đang được tập trung nghiên cứu nhiều, trong đó NTN với đặc điểm riêng về cấu trúc, tính chất đã được chứng minh là có khả năng kéo dài thời gian tác dụng của thuốc, thấm sâu hơn vào các tổ chức bên trong mắt, tăng sinh khả dụng và hiệu lực điều trị, giảm số lần sử dụng thuốc cho người bệnh

NTN (còn được gọi là nhũ tương siêu mịn, nhũ tương dưới micro), thường có KTTP từ 20-200 nm, và có chỉ số đa phân tán thấp[31],[41]

NTN là hệ phân tán gồm pha nước và pha dầu, với sự có mặt của chất diện hoạt và đồng diện hoạt để ổn định vùng bề mặt phân cách [32]

Phụ thuộc vào KTTP, nhũ tương có thể trong suốt hay trong mờ hoặc thường đục như sữa [31],[16]

1.3.2 Thành phần nhũ tương nano

- CDH: được sử dụng với tỉ lệ 0,1-10% [16], các CDH ion thường không được sử dụng do độc tính đối với mắt, CDH không ion hóa thường được sử dụng hơn Các CDH này thường dễ dàng hòa tan trong nước do có nhóm ether: polyxamer, polysorbat, polyethylen glycol và tyloxapol Các CDH lưỡng tính như leucithin cũng được sử dụng do độc tính thấp

KÍNH TIẾP XÚC

- CĐDH:

CĐDH có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt, điều chỉnh độ cong của mặt phân cách nhờ các nhóm không phân cực, làm tăng sự trượt của của màng phân cách

CĐDH thường là các phân tử nhỏ, như các alcol có trọng lượng phân tử thấp, glycol có 2-10 C, amin mạch ngắn

- Pha dầu: thường sử dụng các chất lỏng không phân cực: dầu dừa, dầu lạc, dầu đậu tương, triglycerid với các acid béo có 8-10C, isopropyl myristat (IPM), caprylic/capric triglycerid (Miglyol), acid béo (oleic acid, este của saccarose: mono-, di-, tri-palmitat saccarose…),tỉ lệ sử dụng với mắt từ 0,1-10%

- Pha nước: nước, các chất tăng độ nhớt (glycerol, PEG 200…), đệm, chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu, chất bảo quản…[50]

1.3.3 Các thế hệ nhũ tương dầu trong nước có kích thước nano

NTN

Thế hệ thứ nhất (nhũ tương dựa trên phospholipid)

Thế hệ thứ hai (nhũ tương có các chất PEG hóa trên bề mặt giọt nhũ tương)

Thế hệ thứ ba (nhũ tương có các chất PEG hóa và điện tích dương trên bề mặt giọt nhũ tương)

Hình 1.2 Ba thế hệ nhũ tương nano

- Thế hệ đầu tiên: nhũ tương chứa triglycerid, được bao bọc bởi màng phospholipid Các sản phẩm của thế hệ 1 thường là thuốc truyền tĩnh mạch cung cấp dinh dưỡng,

có kích thước từ 160-400nm, điện thế bề mặt nhũ tương thường có giá trị âm

- Thế hệ thứ hai: có kích thước trong khoảng 100-300nm, sử dụng thêm các CDH

có cấu trúc polyoxyethylen(POE) như Tween 80, Span 80, Brij, and poloxame 188, với ưu điểm làm giảm năng lượng tự do bề mặt với nước, dễ tan trong nước, tính linh động cao Các dẫn chất phosphatidylethanlamin với polyethylen glycol (PEG-PG) cũng được sử dụng rộng rãi như CĐDH làm tăng thời gian bán thải (với các sản phẩm đường tiêm, uống), tạo ra tính tác dụng tại đích

- Thế hệ thứ ba: nhũ tương gồm nhiều CDH, trong đó có CDH cation, ví dụ phospholipid-POE-CDH cation (thường là amin hay các polyme) Để tăng độ ổn định nhũ tương, các lipid mang điện tích dương (stearyl, oleyl amin) hoặc polysaccarid tạo ra điện tích dương như chitosan sẽ được thêm vào nhũ tương Ngoài ra, các CĐDH như 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- trimethylammonium-propan (DOTAP), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) và 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[poly (ethylenglycol)2000] (PEG2000PE) cần được thêm vào để nhũ tương vừa có thế zeta dương, vừa ổn định

về mặt vật lí Nhũ tương thế hệ ba có ưu điểm vượt trội, tăng hấp thu vào tế bào,

làm tăng sinh khả dụng và tăng thời gian lưu dược chất trong máu, mắt, phổi…[45] 1.3.4 Phương pháp bào chế

NTN có thể được bào chế bằng một trong các phương pháp sau:

- Phương pháp nhũ hóa hay phân tán sử dụng năng lượng cao dùng năng lượng cao

để phá vỡ pha nội, chia nhỏ để phân tán thành tiểu phân nhỏ, đồng nhất:

+ Khuấy trộn, phân cắt mạnh

+ Đồng nhất hóa dưới áp suất cao: với áp lực khoảng 40 đến 120 MPa

+ Siêu âm: thường chỉ được áp dụng cho các mẻ nhỏ [41]

Hình 1.3 Quy trình bào chế NTN (phương pháp mới)

- Phương pháp nhũ hóa sử dụng năng lượng thấp hay tự nhũ hóa: NTN được hình thành do sự chuyển pha diễn ra trong quá trình nhũ hóa:

+ Phương pháp điểm đảo pha: ở nhiệt độ hằng định, thay đổi tỷ lệ dầu – nước Khi tăng tỉ lệ phân bố của nước dẫn đến sự tự biến đổi độ cong của lớpCDH

sẽ làm nhũ tương chuyển từ loại nước/dầu sang dầu/nước ở điểm đảo pha Các CDH có mạch ngắn, tạo thành các lớp linh động nằm ở bề mặt phân cách dầu-nước, dẫn đến sự biến đổi hình thái (bicontinuous) nhũ tương + Phương pháp nhiệt độ đảo pha: giữ nguyên các thành phần, thay đổi nhiệt độ Phương pháp dựa trên sự thay đổi độ tan của CDH không ion hóa loại polyoxyethylen với nhiệt độ, CDH loại này trở nên thân dầu khi nhiệt độ tăng do sự loại nước của chuỗi polyoxyethylen [15]

Tạo nhũ tương thô Máy phân cắt, 16000 vòng/phút, 5 phút, 800C

Đồng nhất hóa (Gaulin,

áp suất 9000 psi, 5 phút

Làm lạnh nhanh xuống 200C, điều chỉnh pH 7,4 bằng HCl, NaOH 0,1N

Tiệt khuẩn bằng nồi hấp, 1210C, 15 phút

Đóng gói dưới điều kiện khí nitrogen

1.3.5 Độ ổn định

Các hạt nhũ tương có kích thước nano có thể đạt trạng thái ổn định, chống lại quá trình sa lắng, kết tụ là do chuyển động Brown, tốc độ khuếch tán cao hơn so với tốc độ sa lắng do lực hút trọng trường [41] Ngoài ra, tỉ lệ độ dày giữa lớp CDH và bán kính tiểu phân cao hơn so với nhũ tương có kích thước thông thường cũng là tăng tính ổn định của NTN[52].Các CDH làm ổn định nhũ tương, thường có các đuôi thân nước dài 2-10 nm

Vì vậy, một trong những nguyên nhân chính ảnh hưởng đến sự ổn định của NTN là hiện tượng kết tụ Ostwald Quá trình kết tụ Ostwald hay sự khuếch tán phân tử được coi là cơ chế chính gây nên sự mất ổn định của NTN:

- Quá trình kết tụ Ostwald xảy ra do sự khác nhau về kích thước, trọng lượng, và độ hòa tan trong môi trường phân tán giữa các tiểu phân Các tiểu phân có kích thước nhỏ sẽ có tỉ lệ diện tích bề mặt so với thể tích lớn hơn các tiểu phân có kích thước lớn, làm cho các phân tử trên bề mặt các tiểu phân tự động khuếch tán qua môi trường phân tán sang các tiểu phân lớn có trạng thái năng lượng thấp hơn Do vậy, các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn co nhỏ lại, trong khi các tiểu phân có kích thước lớn hơn tăng lên (để làm giảm tổng diện tích bề mặt) làm tăng KTTP của hệ, dẫn đến tách pha

- Tốc độ kết tụ phụ thuộc vào độ hòa tan của phân tử pha phân tán trong môi trường phân tán

Để giảm quá trình kết tụ Ostwald, có thể:

- Thêm vào hệ một lượng nhỏ pha phân tán thứ hai không tan hoặc ít tan hơn trong môi trường phân tán (ví dụ như squalen)[41] Khi đó, sự phân bố thành phần pha ngoại sẽ khác nhau giữa các giọt nhũ tương, thành phần có độ tan thấp hơn có thể tập trung quanh các giọt nhũ tương có kích thước nhỏ hơn Trong quá trình kết tụ Ostwald, trạng thái cân bằng sẽ được thiết lập do sự khác nhau về trạng thái năng lượng tự do giữa các giọt nhũ tương có kích thước khác nhau sẽ được cân bằng bởi trạng thái năng lượng tự do khác nhau từ sự có mặt của 2 thành phần trong pha phân tán Tuy nhiên, phương pháp này ít được áp dụng do pha phân tán thứ hai là phải

thỏa mãn điều kiện là loại dầu rất ít tan trong nước, có thể bị trộn lẫn vào pha dầu [44]

- Điều chỉnh màng phân cách: sử dụng các CDH hấp thụ mạnh trên bề mặt phân cách pha, không làm các chất giải phóng khỏi bề mặt trong quá trình kết tụ, từ đó làm giảm tốc độ quá trình kết tụ [44], kết hợp nhiều CDH, sử dụng các CĐDH

1.3.6 Một số phương pháp đánh giá hệ nhũ tương nano

1.3.6.1 Đặc tính lý hóa

- Kích thước và phân bố KTTP: phương pháp tán xạ ánh sáng hay quang phổ photon ánh sáng

- Hình thái và cấu trúc tiểu phân: kính hiển vi điện tử truyền qua

- Điện tích bề mặt (đo thế zeta): dựa vào sự điện di của NTN trong điện trường

- Khả năng thấm ướt (sức căng bề mặt)

- Ngoài ra, đối với NTN nhỏ mắt thì độ nhớt, chỉ số khúc xạ, pH, áp suất thẩm thấu cũng là các đặc tính cần phải được đánh giá

- Ổn định dài hạn: bảo quản NTN ở nhiệt độ từ 40C đến 500C trong thời gian nhất định (1 tháng, 3 tháng, 6 tháng, 1 năm)

Sau đó, quan sát sự tách pha, kết tụ, sa lắng,…, xác định thay đổi về phân bố KTTP, thế zeta, độ nhớt,… để xác định độ bền của NTN

1.3.6.3 Định lượng dược chất trong mỗi pha

- Phương pháp siêu lọc: Sử dụng ống có gắn màng lọc với giới hạn khối lượng phân

tử nhỏ (thường 10 – 12 kDa tùy vào KTTP), ví dụ ống Vivaspin– Sartorius (Đức) Mẫu NTN đựng ở phần phía trên màng lọc, ly tâm với tốc độ và thời gian thích hợp

(4000 vòng/phút trong 30 phút hoặc 3000 vòng/phút trong 1 giờ) [40] Sau đó, lấy phần dịch lọc ở phần phía dưới màng lọc đi định lượng dược chất có trong pha ngoại, từ đó có thể xác định được lượng dược chất trong pha nội

- Phương pháp siêu ly tâm: NTN được siêu ly tâm ở tốc độ lớn (từ 50000 vòng/phút), trong khoảng thời gian nhất định tùy thuộc vào độ bền của NTN NTN tách thành hai pha riêng biệt, pha nước sẽ được thu hồi để định lượng dược chất [39],[24]

1.3.6.4 Khả năng giải phóng dược chất in vitro

- Màng giải phóng: thường sử dụng màng thẩm tích, với giới hạn khối lượng phân

tử thích hợp (thường là 12kDa); đôi khi sử dụng màng lọc cellulose acetat với kích thước lỗ lọc thường là 0,2µm hoặc nhỏ hơn Các màng này thường được xử lý bằng môi trường khuếch tán trước khi tiến hành thí nghiệm

- Môi trường khuếch tán: thường là đệm phosphat pH 7,4, được điều nhiệt để duy trì nhiệt độ bằng với nhiệt độ ở mắt, được khuấy trộn với tốc độ nhất định

- Nhiệt độ: 34±0,5oC (nhiệt độ tại bề mặt mắt)

- Thiết bị đánh giá giải phóng thuốc

Bình Franz: mẫu NTN được chứa ở ngăn cho phía trên (donor), môi trường khuếch tán ở ngăn nhận phía dưới (receptor), màng thử giải phóng (có thể là màng thẩm tích hoặc màng lọc, màng sinh học) được đặt giữa hai phần Sau thời gian nhất định, lấy mẫu từ môi trường khuếch tán để định lượng, và bổ sung lại một thể tích môi trường khuếch tán mới tương ứng

Thiết bị thử hòa tan: chế phẩm được đặt trong túi thẩm tích, 2 đầu được kẹp chặt, hoặc trong một ống thủy tinh có đường kính 2,5cm, chiều dài 10cm, một đầu được bao bởi màng thử giải phóng, một đầu nối với thiết bị quay (thay thế cho giỏ quay hay cánh khuấy) Tại thời điểm ban đầu, và ở những thời điểm nhất định, lấy mẫu từ môi trường khuếch tán, và định lượng dược chất, hoặc cho chế phẩm trực tiếp vào môi trường, định lượng dược chất khuếch tán vào trong túi thẩm tích đặt trong môi trường khuếch tán [8], [10]

1.3.7 Một số chế phẩm nhũ tương nano trên thị trường

Bảng 1.1.Một số chế phẩm nano trên thị trường

Tên

biệt dược Hoạt chất

Đường dùng Hàm lượng Nhà sản xuất

Limethason Dexamethason Tiêm 4 mg/ml Mitsubishi (Nhật) Ropion Flurbiprofen axetil Tiêm 50 mg/ 5 ml Kaken (Nhật) Vitalipid Vitamin A, D, E, K Tiêm 10 ml Fresenius Kabi Retasis Cyclosporin Nhỏ mắt 0,05%, 0,4 ml Allergan (Mĩ)

1.3.8 Ưu điểm của nhũ tương nano nhỏ mắt

- Sử dụng đơn giản và tiện lợi như dung dịch nhỏ mắt, tránh cảm giác cộm mắt khi

sử dụng hệ tiểu phân rắn, hệ cài đặt, tránh mờ mắt của dạng thuốc mỡ…

- Tăng độ ổn định của hoạt chất [21], cải thiện độ tan của các dược chất có độ tan kém như dexamethason, budenosid, gancyclovir… Các dược chất gây kích ứng mắt khi tồn tại dưới dạng dung dịch sẽ hạn chế kích ứng khi hòa tan trong pha nội

- Nhũ tương dầu/nước hay được sử dụng, do có thành phần và cấu trúc gần giống như nước mắt tự nhiên, có thể tham gia vào hình thành màng nước mắt sinh lí, nên dung nạp hơn với môi trường sinh lí của mắt, các CDH và đồng diện hoạt làm tăng tính thấm của thuốc vào giác mạc, thủy dịch, tăng lượng thuốc được hấp thu, đồng thời các CDH, đồng diện hoạt còn tác động làm thay đổi cấu trúc của lớp biểu mô giác mạc, tăng tính thấm của dược chất qua giác mạc, đưa dược chất vào sâu bên trong mắt[18] Ngoài ra, NTN còn được hấp thu vào tế bào biểu mô giác mạc theo

cơ chế ẩm bào, thực bào [53]

- NTN bao gồm các hạt có kích thước nhỏ, mỗi tiểu phân như một kho chứa thuốc, khuếch tán từ từ, giúp kiểm soát và duy trì giải phóng, thích hợp với các bệnh mạn tính, cải thiện sinh khả dụng của các thuốc có thời gian bán thải ngắn, thuốc được giải phóng kéo dài, giảm số lần dùng thuốc trong ngày so với dạng thuốc nhỏ mắt,

hạn chế tác dụng phụ và tổn thương tế bào biểu mô mắt (do lượng thuốc được đưa vào mắt dưới dạng NTN ít hơn so với thuốc nhỏ mắt) [16]

-Các tiểu phân có sức căng bề mặt nhỏ làm tăng khả năng thấm ướt, giúp hệ phân tán rộng trên bề mặt giác mạc, trộn lẫn nhanh vào màng trước võng mạc, tăng thời gian tiếp xúc của thuốc với giác mạc, góp phần cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt [32]

1.4 Một số nghiên cứu về nhũ tương nano dùng cho nhãn khoa

Vũ Ngọc Mai đã nghiên cứu bào chế NTN diclofenac với CDH Tween 80,

Cremophor EL, Span 80 và CĐDH Transcutol HP, pha dầu gồm isopropyl myristat, Labrafac PG, Miglyol bằng phương pháp siêu âm Nghiên cứu đã lựa chọn được công thức tối ưu cho cả 2 dạng dược chất: acid diclofenac và natri diclofenac NTN diclofenac đã được đánh giá ảnh hưởng của các thành phần bào chế đến độ ổn định

vật lí và khả năng giải phóng dược chất in vitro.Nồng độ CDH thân nước,

Transcutol HP thấp, tỉ lệ pha dầu cao hay sử dụng loại dầu có thể tích phân tử càng lớn (Miglyol>isopropyl myristat>Labrafac PG) thì hệ càng bền Khả năng giải phóng dược chất của đối với NTN chứa natri diclofenac cao nhất khi nồng độ CDH thân nước nhỏ nhất và sử dụng isopropyl myristat làm dung môi pha dầu, còn đối với NTN chứa diclofenac thì khi giảm nồng độ Span 80 và Transcutol HP, khả năng giải phóng dược chất tăng [5]

Zhidong Liu, Jiawei Li, Shufang Nie, Hong Guo và Weisan Pan đã

nghiên cứu ảnh hưởng của Transcutol P lên tính thấm của thuốc trên giác mạc, và khả năng kích ứng trên mắt thỏ Ảnh hưởng của Trans đối với tính thấm của thuốc được nghiên cứu in vitro trên giác mạc thỏ Với sự có mặt của Trans, ở nồng độ 0,005-0,03%, hệ số thấm (Ppp) tăng lớn nhất là 1,5; 1,5; 3,0; 3,3 lần với ribavirin, gatifloxacin, levofloxacin hydroclorid và enoxacin Tuy nhiên, hệ số thấm của oxaprizon giảm đi khi có thêm Trans Tính thấm giảm mạnh nhất là 2,8 lần khi Trans ở nồng độ 0,03% Kết quả nghiên cứu tính kích ứng mắt cho thấy Trans không gây kích ứng với nồng độ đã được nghiên cứu (0,005-0,03%), nhưng có gây kích ứng nhẹ ở nồng độ 0,05% Trans không gây ra tổn thương đến khả năng nhìn

của mắt, hay gây ra các dấu hiệu lâm sàng không bình thường trên giác mạc và các

mô tại tất cả các nồng độ Các nhà nghiên cứu đã kết luận Trans có khả năng tăng hiệu quả điều trị lâm sàng trên mắt đối với các hợp chất thân nước [25]

Alia A Badawi, Hanan M El-Laithy, Riad K El Qidra, Hala El Mofty

và Mohamed El dally đã nghiên cứu bào chế hệ đưa thuốc nhãn khoa nano

chitosan, với dược chất indomethacin Hai hệ đưa thuốc nano chứa chitosan (CS) là

vi nang nano và NTN đã được phát triển để kéo dài thời gian lưu của indomethacin (IM), và làm tăng sinh khả dụng tại mắt Vi nang CS được bào chế bằng cách điều chỉnh quá trình tạo gel giữa CS và tripolyphosphat trong khi NTN được bào chế bằng phương pháo tự nhũ hóa Kính điện tử cho thấy hình dạng các tiểu phân được tạo ra là hình cầu Vi nang nano có kích thước 280nm, thế zeta + 17mV, hệ số đưa thuốc 84,8% trong khi kích thước của các hạt NTN từ 220-690nm Trong nghiên

cứu giải phóng in vitro, trong điều kiện chuẩn, vi nang và NTN đều có bước giải

phóng nhanh ngay từ đầu, sau đó giải phóng chậm với tỉ lệ 74% và 86% tại thời điểm 24 giờ Nghiên cứu in vivo chỉ ra NTN có khả năng làm liền sẹo nhanh hơn và

ức chế tương đối sự xâm nhập của bạch cầu đa hình so với dạng vi nang Hơn nữa, kết quả khi thử nhũ tương trên mắt thỏ cho thấy nhũ tương cho tác dụng điều trị mong muốn, nồng độ IM khá cao ở trong cấu trúc mắt, và thủy dịch, và cao hơn rõ rệt so với dạng dung dịch nhỏ mắt Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã kết luận hệ đưa thuốc nano có khả năng liên kết chặt chẽ với giác mạc làm tăng thời gian lưu thuốc, thuốc được giải phóng kéo dài do đó làm tăng lượng thuốc được hấp thu trong và ngoài mô mắt [10]

Jinqiu Shen, Li Gana, Chunliu Zhua, Xinxin Zhanga, Yang Donga, Min Jianga, Jiabi Zhub và Yong Gana đã sử dụng phương pháp đồng nhất hóa dưới áp

suất cao để bào chế NTN chứa flurbiprofen axetil (FBA) tiền chất của flubirofen (FB) với pha dầu là dầu thầu dầu, và chất nhũ hóa là Tween 80 Các nhà nghiên cứu bào chế được công thức F2 gồm: FBA 0,1%; Tween 80 0,4%; dầu thầu dầu 0,5%; glycerin 2,2%; Carbopol 974 0,125% NTN FBA-F2 này có KTTP trung bình 143,6

± 1,89nm, ổn định ở nhiệt độ 40C, 250C, 400C, 500C; có AUC0-10giờ gấp 6,7 lần so

với dung dịch FB trong dầu thầu dầu (định lượng dược chất trong thủy dịch của mắt thỏ); với khoảng 98% dược chất được nhũ hóa (sử dụng thiết bị siêu lọc Vivaspin

500, Sartorius, giới hạn khối lượng phân tử 10 kDa) vì thế có khả năng dung hợp và hiệu quả chống viêm tại mắt tốt hơn mặc dù thời gian lưu và sinh khả dụng tương đương với dung dịch FBA 0,03% trong nước NTN F2 có tác dụng chống viêm khá tốt Vì vậy, nhũ tương F2 với nồng độ 0,1% có thể ứng dụng làm NTN nhỏ mắt với hoạt chất thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid ít kích ứng và cải thiện tác dụng chống viêm [39]

Cùng với sự phát triển vũ bão của khoa học kĩ thuật, hiệu quả điều trị lâm sàng ngày càng vượt trội đồng thời giảm nguy cơ tác dụng phụ của thuốc Công nghệ nano đã được ứng dụng trong bào chế dược phẩm, các hệ đưa thuốc có kích thước nano ra đời, được áp dụng với nhiều hoạt chất và đường đưa thuốc, vị trí tác dụng Hiện nay, thuốc nhỏ mắt diclofenac và NTN với dược chất cyclosporin

đã được đưa vào sử dụng Tiếp thu các thành tựu nghiên cứu trong và ngoài nước,nhũ tương nhỏ mắt nano diclofenac đang được nghiên cứu bào chế tại bộ môn Bào chế trường đại học Dược, Hà Nội nhằm làm tăng tính thấm dược chất, kiểm soát giải phóng thuốc và đưa thuốc tới đích tác dụng, phù hợp với yêu cầu tác dụng nhanh, duy trì kéo dài, hiệu quả và thuận tiện cho người sử dụng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Bảng 2.1 Nguyên liệu

8 Natri dihydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết phân tích

9 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc Tinh khiết phân tích

11 Acid hydrocloric Trung Quốc Tinh khiết phân tích

12 Natri hydroxyd Trung Quốc Tinh khiết phân tích

18 Benzalkonium clorid Nhật Bản Nhà sản xuất

2.1.2 Thiết bị

- Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research

- Thiết bị lọc Sartorius; màng lọc cellulose acetat, kích thước lỗ lọc 0,1 µm, 0,2 µm; 0,45µm

- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Thermo – Finnigan (Mỹ)

- Bể siêu âm Ultrasonic LC_60H

- Máy đồng nhất hóa phân cắt Unidriver X1000

- Máy đồng nhất hóa dưới áp suất cao EmulsiFlex – C5

- Kính hiển vi điện tử truyền qua EMLab – NIHE (Nhật)

- Máy đo phân bố KTTP Zetasizer Nano ZS90 – Malvern (Anh)

- Máy đo thế zetaZetasizer Nano ZS90 – Malvern (Anh)

- Khúc xạ kế A Krüss Optronic GmbH DR6100 (Đức)

- Nhớt kế Brookfield SA® (Mỹ)

- Cân phân tích, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh khác…

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Bào chế NTN với dược chất acid diclofenac trên máy đồng nhất hóa phân cắt tốc

độ cao

- Sử dụng phần mềm MODDE 8.0, INForm v3.2, FormRules v2.0 để thiết kế thí nghiệm, phân tích ảnh hưởng của của các thông số qui trình, và thành phần công

thức tới các đặc tính và khả năng giải phóng dược chất in vitro của NTN

- Đánh giá độ ổn định của một số mẫu NTN nhỏ mắt diclofenac

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế NTN

NTN được bào chế theo các bước sau:

- Bước 1: Hòa tan hoàn toàn dược chất vào pha dầu (dung môi pha dầu, CDH thân dầu, CĐDH - Transcutol HP), đun nóng 60 - 650C

- Bước 2: Hòa tan, đun nóng pha nước (dung môi – nước cất, CDH thân nước, CĐDH thân nước - PG, hệ đệm) lên 65 - 700C

- Bước 3: Tiến hành đồng nhất hóa nhũ tương sử dụng máy phân cắt: tốc độ 10000vòng/phút – 16000vòng/phút, thời gian 5-10 phút

- Bước 4: Điều chỉnh thể tích và pH

- Bước 5: Tiệt khuẩn: lọc qua màng cellulose acetat 0,2µm

- Bước 6: Đóng gói, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm

2.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ

2.3.2.1 Phương pháp xác định phân bố kích thước tiểu phân

Kích thước hạt được xác định bằng phương pháp tán xạ laser Nguyên lý của phương pháp là khi chiếu chùm tia laser vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau Dựa vào độ tán xạ của chùm tia sau khi va chạm vào hạt ta có thể tính được kích thước hạt theo thuyết Mie Phương pháp tán

xạ laser đưa ra kết quả tỷ lệ phần trăm thể tích của các hạt theo đường kính hạt

Sử dụng máy quang phổ photon ánh sáng Zetasizer Nano ZS90, đo kích thước hạt trong khoảng 0,01 – 10000 nm Ánh sáng tán xạ đo ở góc 900, nhiệt độ đo

25oC

Để tránh hiện tượng đa tán xạ, tiến hành pha loãng nhũ tương 100 lần trước khi đo

2.3.2.2 Phương pháp đo thế zeta

Sử dụng thiết bị đo thế zeta: Zetasizer Nano ZS90.Mẫu NTN được pha loãng

100 lần trước khi đo

2.3.2.3 Phương pháp đo chỉ số khúc xạ pha nước và pha dầu

Sử dụng khúc xạ kế A Krüss, ở nhiệt độ 25 ± 20C.Kiểm tra giá trị chỉ số khúc

xạ của nước cất (1.333) Hiệu chỉnh máy nếu cần thiết trước khi đo của mẫu NTN

2.3.2.4 Phương pháp đo độ nhớt

Sử dụng nhớt kế Brookfield

- Đầu đo S1

- Tốc độ quay trong khoảng 400 vòng/phút

Nhiệt độ đo 25±20C Đo ba lần và lấy kết quả trung bình

2.3.2.5 Phương pháp đánh giá độ ổn định vật lý của hệ

- Phương pháp cấp tốc:

Ly tâm 17000 vòng/phút trong 30 phút

Khi quan sát không thấy có hiện tượng tách lớp, tiếp tục tiến hành thử chu kì nóng lạnh: thực hiện 6 chu kỳ4 – 400C, bảo quản ở mỗi nhiệt độ không dưới 48 giờ, rồi đánh giá các chỉ tiêu chất lượng như trên

- Phương pháp dài hạn: bảo quản các mẫu trong lọ thủy tinh, có nắp cao su, thể tích

10 ml/lọ, ở điều kiện nhiệt độ 40C, điều kiện thường và 400C trong 6 tháng và quan sát các hiện tượng kết váng, kết tụ, thay đổi màu sắc, đồng thời kiểm tra chất lượng nhũ tương: KTTP, pH, độ nhớt, độ khúc xạ…

2.3.3 Phương pháp xác định tỉ lệ dược chất được nhũ hóa

Thêm natri clorid đến bão hòa vào NTN, rồi tiến hành li tâm với tốc độ 12000vòng/phút ở nhiệt độ 400C, trong 30 phút tách riêng 2 pha dầu và nước, tiến hành định lượng dược chất trong pha nước, từ đó thu được tỉ lệ dược chất trong pha dầu

2.3.4 Phương pháp đánh giá giải phóng thuốcin vitro

Khảo sát khả năng giải phóng in vitro với các thiết bị và điều kiện khác nhau: Điều kiện:

- Màng giải phóng: khảo sát dùng các loại màng: cellulose acetat 0,2 µm, màng cellulose acetat 80nm, màng thẩm tích 12000 Dalton

- Môi trường khuếch tán: dung dịch đệm phosphat pH 7,4

- Nhiệt độ môi trường: 34±0,50C

Thiết bị

Bình Franz: lượng mẫu đem thử: 1 ml NTN (0,093 mg acid diclofenac),

diện tích bề mặt màng khuếch tán: 1,76 cm2, thể tích môi trường khuếch tán: 7 ml, tốc độ khuấy 400vòng/phút

Lấy mẫu: Lấy mẫu trong 4 giờ, lấy mẫu tại các thời điểm 15 phút, 30 phút, sau đó cách 30 phút lấy mẫu 1 lần, mỗi lần lấy 1 ml rồi bổ sung 1 ml môi trường khuếch tán mới Lượng dược chất giải phóng được xác định bằng phương pháp

HPLC

Cách tính % dược chất giải phóng tại các thời điểm

Nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t được tính theo CT: Trong đó:

Ct: Nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t (µg/ml)

c c

t

S S

C =

Cc: Nồng độ mẫu chuẩn (µg/ml)

St: Diện tích pic của mẫu thử (mAU.giây)

Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây)

Tổng lượng dược chất đã giải phóng từ NTN tại thời điểm t được tính theo CT:

Q t = VC t + v∑=−

=

1 1

n i

i

Ci

Trong đó:

Qt: tổng lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm t (µg)

V: thể tích môi trường khuếch tán (ml)

v: thể tích mỗi lần lấy mẫu thử (ml)

Ct: nồng độ dược chất trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t (µg/ml)

% DC GP đã giải phóng từ nhũ tương tại thời điểm t tính theo CT:

100

t t

Xt: % DC GP tại thời điểm t (%)

Qt: lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm t (mg)

M: khối lượng dược chất có trong mẫu thử (mg)

2.3.5 Phương pháp định lượng

Dược chất giải phóng từ NTN và dược chất có trong NTN được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC

Điều kiện

Pha tĩnh: Cột C8 kích thước 150 mm × 4,6 mm (Octyl silica gel, 5 µm)

Pha động: hỗn hợp methanol và dung dịch đệm phosphat pH 2,5 với tỷ lệ 75/25, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm, rồi siêu âm 15 phút

Tốc độ dòng pha động: 1 ml/phút

Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

Detector UV bước sóng: 276 nm[48]

Mẫu chuẩn

Cân chính xác một lượng dược chất khoảng 25 mg, hòa tan hoàn toàn bằng dung môi thích hợp (là methanol đối với acid diclofenac) trong bình định mức 25

ml, bổ sung vừa đủ thể tích, thu được dung dịch gốc nồng độ 1 mg/ml

Tiếp tục pha loãng dung dịch gốc 20 lần với dung môi thích hợp để thu được mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 50 µg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm

Ct: Nồng độ dược chất trong mẫu thử (mg/ml)

mc: Khối lượng dược chất cân ban đầu (mg)

St: Diện tích pic của mẫu thử (mAU.giây)

Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây)

% DC GP từ NTN được tính toán như trình bày ở mục 2.3.4

Phần trăm dược chất chứa trong mẫu NTN được tính theo CT:

H = Ct / C0 100 Trong đó:

Ct: Nồng độ dược chất trong mẫu thử (%)

C0: Nồng độ dược chất trong NTN bào chế (%).C0 = 0,093% đối với nhũ tương chứa acid diclofenac

Các phép đo đều được thực hiện với số mẫu n=3

2.4 Phương pháp thiết kế thí nghiệm, đánh giá ảnh hưởng của thành phần công thức, thông số máy, lựa chọn công thức bào chế, thông số thích hợp

Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 (Umetrics Inc., USA) để thiết kế thí nghiệm cổ điển một cách ngẫu nhiên dựa trên nguyên tắc hợp tử tại tâm

Xác định các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn công thức bào chế thích hợp bằng phần mềm FormRules v2.0 và INForm v3.2 (Intelligensys Ltd., UK), dựa trên mô hình mạng neuron nhân tạo

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Xây dựng đường chuẩn

Pha dãy các dung dịch acid diclofenac chuẩn với nồng độ 10 µg/ml, 30 µg/ml,

50 µg/ml, 70 µg/ml, 100 µg/ml, 120 µg/ml trong dung môi methanol, định lượng bằng phương pháp HPLC

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid diclofenac

STT Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.giây)

Nhận xét: Vì hệ số tương quan lớn hơn 0,99 nên trong khoảng nồng độ từ

1µg/ml đến 120µg/ml diện tích pic có sự tương quan tuyến tính với nồng độ acid

diclofenac

3.2 Xác định công thức và quy trình bào chế cơ bản

3.2.1 Xác định công thức bào chế cơ bản

3.2.1.2 Pha dầu

- Miglyol: triglycerid mạch trung bình

- Isopropyl myristat: este của acid béo mạch dài, có khả năng tăng tính thấm, không

bị ảnh hưởng của oxy hóa và thủy phân

Pha dầu gồm 2 chất trên, với tỉ lệ kết hợp khác nhau Tỉ lệpha dầu trong công thức bào chế được cố định là 1%, phù hợp với môi trường giải phóng ở mắt

Sử dụng kết hợp các CDH để tạo được nhũ tương dầu/nước (HLB>10), tăng

độ ổn định của hệ.3 CDH trên là CDH không ion hóa, không gây kích ứng, dung hợp tốt với mắt

Tỉ lệ CDH từ 1-2%, tương ứng với các tỉ lệ CDH/ tỉ lệ pha dầu là 1:1, 1,5:1

và 2:1, đảm bảo khả năng nhũ hóa, độ ổn định của nhũ tương và an toàn với mắt

3.2.1.4 Chất đồng diện hoạt

Nghiên cứu sử dụng kết hợp CDH thân nước và không thân nước:

- CDH thân dầu: Transcutol HP, HLB 4,2 [11] cải thiện tính thấm dược chất qua giác mạc, có khả năng hòa tan nhiều chất, tuy nhiên có thể gây kích ứng mắt, nên được sử dụng với tỉ lệ 0-0,03% [25] Cơ chế tăng tính thấm của Transcutol có thể liên quan đến sự thay đổi cấu trúc biểu mô giác mạc do Transcutol tạo ra các micelle trong màng lipid biểu mô Các micell này loại bỏ lớp phospholid của màng

tế bào biểu mô, do đó làm tăng lượng thuốc được vận chuyển qua giác mạc[22]

- CDH thân nước: PG, có thể dùng đến tỉ lệ 50% vẫn không gây kích ứng mắt [8]

PG được sử dụng với tỉ lệ 5-10% trong nghiên cứu này

3.2.1.5 Các thành phần khác

- Hệ đệm phosphat pH 7,4

- Chất làm tăng độ nhớt: PG

- Chất đẳng trương, chống oxy hóa, sát khuẩn…

Bảng 3.2 Các thành phần trong công thức bào chế nhũ tương diclofenac

Dung môi pha dầu Isopropyl myristat (IPM), Miglyol 1%

3.2.2 Xác định quy trình bào chế cơ bản

NTN được bào chế bằng máy phân cắt tốc độ cao đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới, với tốc độ phân cắt nằm trong khoảng 8000 vòng/phút đến 16000 vòng/phút [10], [24],[46], [17] thời gian dao động trong khoảng lớn từ 3 phút đến 2

tiếng [9], [37] để đạt được kích thước mong muốn, độ đồng đều kích thước và sự

ổn định cho nhũ tương

Tốc độ phân cắt được khảo sát từ 10000 vòng/phút đến 16000 vòng/phút

Thời gian phân cắt từ 5-10 phút

3.3 Bảng thiết kế thí nghiệm

Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệmmột cách ngẫu nhiên theo nguyên tắc hợp tử tại tâm

3.3.1 Các biến độc lập

Dựa trên công thức cơ bản của NTN đã xây dựng, cố định các thành phần:

- Dược chất: 0,093% acid diclofenac

Loại CDH thân nước X 1 Tween Tween:Cremophor1:1 Tween:Cremophor 2:1 Loại pha dầu X 2 Miglyol Isopropyl myristat Miglyol:IPM 1:1

3.3.2 Các biến phụ thuộc

Các thông số vật lí:

Bảng 3.4 Các biến phụ thuộc thông số vật lí

Chỉ số đa phân tán (PDI) Z2

Khả năng dược chất giải phóng in vitro

Để khảo sát ảnh hưởng của các biến độc lập đến khả năng giải phóng dược

chất in vitro, nghiên cứu lựa chọn phần trăm giải phóng dược chất trong các thời

điểm khác nhau làm biến phụ thuộc

Bảng 3.5 Các biến phụ thuộckhả năng giải phóng in vitro

3.3.3 Bố trí thí nghiệm

Các công thức thực nghiệm được trình bày ở bảng 3.6 Với mỗi công thức,

100 ml được bào chế theo phương pháp đã mô tả Các công thức sau khi được bào chế đều cho công thức màu trắng đục đến trắng xanh, không bị tách lớp ở điều kiện thường cho tới thời điểm kết thúc nghiên cứu

Bảng 3.6.Thiết kế thí nghiệm cho NTN nhỏ mắt acid diclofenac

STT

LoạiCDH

thân nước

Tỉ lệ CDH (%)

Trans (%)

PG (%)

Loại pha dầu

Tốc độ (vòng/phút)

Thời gian (phút)

Span (%)

3.4 Đánh giá ảnh hưởng của các thành phần công thức đến một số đặc tínhvật

lý của nhũ tương nano

3.4.1 Các thông số vật lí của hệ

Sau khi khảo sát các điều kiện đo mẫu, các thông số vật lí dưới đây được đo sau khi pha loãng nhũ tương 100 lần

Bảng 3.7.Các thông số vật lí của nhũ tương nhỏ mắt nano diclofenac