Đang tải... (xem toàn văn)
Đề tài “Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và bảo quản hạt nhân tạo in vitro cây lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies)” nhằm xác định các yếu tố về môi trường và ảnh hưởng của giá thể đến sự nảy mầm và chồi của hạt nhân tạo cây lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies). Từ các thực nghiệm trên tiến hành xây dựng quy trình tái sinh chồi từ hạt nhân tạo và và bảo quản hạt nhân tạo cây lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies). Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ thực vật của Viên Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, các vật liệu thí nghiệm:đốt thân và chồi ngọn tách từ cây lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies) được nuôi cấy in vitro để sử dụng làm phôi. Để tạo hạt nhân tạo, tác giả sử dụng sodium alginate với nồng độ 3% phản ứng với dung dịch CaCl2.2H20 100 mM để tạo vỏ hạt, nội nhũ của hạt nhân tạo được làm bởi các thành phần của môi trường MS (Murashige, Skoog, 1962). Dùng hạt nhân tạo cây lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies) thí nghiệm trên các loại môi trường khác nhau (gồm: môi trường lỏng, môi trường có bổ sung BA, môi trường có bổ sung Kinetin) và cho kết quả hạt nhân tạo cây lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies) trong môi trường MS bổng sung 1 mgl BA hoặc 1 mgl Kinetin, 50 gl chuối, 1 gl than hoạt tính, 30 gl sucrose, pH 5,8 là thích hợp nhất đến khả năng nảy mầm và phát triển hạt nhân tạo. Giá thể agar là tốt nhất đến khả năng nảy mầm và phát triển hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo bảo quản trong môi trường nước ở kiện kiện tối, 4 o C trong thời gian 180 ngày khi chuyển sang nuôi cấy ở điều kiện bình thường (thời gian chiếu sáng 10 giờngày, cường độ ánh sáng 34 µmol.m 2 .s 1 , nhiệt độ 25±2 o C và độ ẩm không khí là 75 – 85%) thì có tỉ lệ nảy mầm cao nhất, với tỉ lệ đạt 100%.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG CHẾ VĂN DŨNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI VÀ BẢO QUẢN HẠT NHÂN TẠO IN VITRO CÂY LAN GẤM (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG CHẾ VĂN DŨNG https://sj.ctu.edu.vn/ql/docgia/tacgia-7350/baibao-4979.html NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI VÀ BẢO QUẢN HẠT NHÂN TẠO IN VITRO CÂY LAN GẤM (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie) LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành đào tạo: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 60420201 Quyết định giao đề tài: Quyết định thành lập Hội đồng: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: 1: TS PHAN XUÂN HUYÊN 2: TS PHẠM THI MINH THU Chủ tịch Hội đồng: Khoa sau Đại học: KHÁNH HÒA – 201 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết luận văn: “Nghiên cứu khả tái sinh chồi bảo quản hạt nhân tạo in vitro lan gấm (Anoectochilus lylei Rolfe ex Downies” trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Đà Lạt, ngày 28 tháng 10 năm 2018 Tác giả Chế Văn Dũng LỜI CẢM ƠN Trước hết xin gửi lời trân trọng cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang; Khoa sau Đại học – Trường Đại học Nha Trang; Lãnh đạo Giảng viên Viện Công nghệ sinh học Môi trường – Trường Đại học Nha Trang quan tâm giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu thực nghiệm tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học tự hào học thạc sỹ ngành Công nghệ Sinh học Đại học Nha Trang; Xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Ngun; Phòng Cơng nghệ thực vật – Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên tạo điều kiện cho tơi nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm ni cấy mơ thực vật để hồn thành kết luận văn; đặc biệt cho xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phan Xuân Huyên TS Phạm Thị Minh Thu tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt trình thực đề cương, thực nội dung thực nghiệm để hoàn thành luận văn; Qua đây, xin gửi lời trân trọng cảm ơn đến Ban Chủ nhiệm đề tài cấp tỉnh, với tên đề tài: “Ứng dụng công nghệ sinh học nhân giống Lan gấm (Anoectochilus spp.) địa bàn tỉnh Đắk Lắk” tạo điều kiện kinh phí, hóa chất thiết bị khác liên quan đến trình nghiên cứu thực nghiệm Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Ngun giúp tơi hồn thành luận văn; Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, tất bạn bè, động nghiệp giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Đà Lạt, ngày 28 tháng 10 năm 2018 Tác giả Chế Văn Dũng MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ………………………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN …………………………………………………………………… ii MỤC LỤC ………………………………………………………………………… iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIỆT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ .viii DANH MỤC HÌNH ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .x LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phơi vơ tính .3 1.2 Khái niệm hạt nhân tạo 1.3 Sự nảy mầm hạt nhân tạo 1.4 Ứng dụng hạt nhân tạo .5 1.4.1 Bảo quản nguồn gen thực vật 1.4.2 Vận chuyển trao đổi giống trồng 1.4.3 Nhân giống 1.4.4 Một số ứng dụng khác 1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phát triển hạt nhân tạo 1.5.1 Mầm 1.5.2 Môi trường gieo hạt 1.5.3 Giá thể gieo hạt 10 1.6 Sodium alginate – chức ứng dụng 10 1.7 Các chất điều hòa sinh trưởng .11 1.7.1 Auxin .12 1.7.2 Cytokinin 12 1.8 Giới thiệu Lan gấm 13 1.8.1 Vị trí phân loại 13 1.8.2 Nguồn gốc phân bố 14 1.8.3 Đặc điểm hình thái 14 1.8.4 Đặc điểm sinh thái 15 1.8.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển lan gấm 15 1.8.6 Giá trị y dược, làm cảnh tình hình khai thác 16 1.8.7 Các loài lan gấm Việt Nam .17 1.9 Tình hình nghiên cứu lan gấm giới nước 20 1.9.1 Tình hình nghiên cứu lan gấm giới 20 1.9.2 Tình hình nghiên cứu lan gấm nước 21 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu 23 2.2 Môi trường điều kiện nuôi cấy 23 2.3 Phương pháp 23 2.3.1 Giai đoạn tạo hạt 23 2.3.2 Bố trí thí nghiệm .23 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: nghiên cứu ảnh hưởng môi trường lỏng đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 23 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: nghiên cứu ảnh hưởng BA đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 24 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 25 2.3.2.4 Thí nghiệm 4: nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 26 2.3.2.5 Thí nghiệm 5: nghiên cứu ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối, 40C 27 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Khảo sát ảnh hưởng môi trường lỏng đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 29 3.2 Khảo sát ảnh hưởng BA đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 31 3.3 Khảo sát ảnh hưởng Kinetin đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 33 3.4 Khảo sát ảnh hưởng giá thể đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 35 3.5 Khảo sát ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối, 40C 38 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .41 4.1 Kết luận 41 4.2 Kiến nghị .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Tài liệu tiếng Việt 42 Tài liệu tiếng Anh 43 Hiện nay, cấu trúc gồm 20 trang TQ, trang VLPP, 12 trang KQTL chưa cân đối TQ nhiều, KQTL - Giảm TQ cách nối đoạn ngắn lại với nhau, có nhiều đoạn văn 2-3 dòng khơng hợp lí - Vật KQTL chưa có thảo luận nhiều, cần thêm so sánh với báo cáo tương tự trước DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Acid abscisic BAP/BA : Benzyl adenine purin CCC : Cycocyl IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid ISSP : Inter simple sequence repeat ½ MS : Mơi trường MS có thành phần đa lượng giảm nửa MS : Môi trường Murashige Skoog, 1962 NAA : Acid α-naphtaleneacetic PLB : Protocom like body RADP : Random amplified polymorphic DNA TDZ : Thidiazuron tRNA : Transport RNA (ARN vận chuyển) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hưởng môi trường lỏng đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 24 Bảng 2.2 Ảnh hưởng BA đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 25 Bảng 2.3 Ảnh hưởng Kinetin đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo .25 Bảng 2.4 Ảnh hưởng giá thể đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo .26 Bảng 2.5 Ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối, 40C 27 Bảng 3.1 Ảnh hưởng môi trường lỏng đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt 29 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt .31 Bảng 3.3 Ảnh hưởng Kinetin đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt 34 Bảng 3.4 Ảnh hưởng giá thể đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt 37 Bảng 3.5 Ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối, 40C 39 Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng môi trường lỏng đến nảy mầm hạt nhân tạo 24 Bảng 3.1 Ảnh hưởng môi trường lỏng đến nảy mầm phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt 29 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Thể mối tương quan chiều cao; số chồi/hạt tỷ lệ nảy mầm hạt môi trường H2O; môi trường 1/2MS môi trường MS 30 Biểu đồ Thể mối tương quan chiều cao chồi; số chồi/hạt tỷ lệ nảy mầm môi trường không bổ sung BA có bổ sung BA theo nồng độ khác 32 Biểu đồ Mối tương quan chiều cao chồi; số chồi/hạt tỷ lệ nảy mầm môi trường không bổ sung Kenitin có bổ sung Kenitin với nồng độ khác (01, mg/l; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l) 35 Biểu đồ Thể mối tương quan tỷ lệ nảy mầm, số chồi/hạt chiều cao chồi sau 60 ngày gieo hạt mơi trường (mơi trường bổ sung agar, mơi trường có bơng thấm, mơi trường có giấy thấm, mơi trường bổ sung cát, môi trường bổ sung vụn sơ dừa) 37 Biểu đồ Ảnh hưởng môi trường bảo quản đến khả nảy mầm, tạo chồi tốc độc gia tăng chiều cao chồi hạt nhân tạo lan gấm .39 Hình 3.1 Ảnh hưởng mơi trường lỏng đến nảy mầm phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt 30 10 37 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng môi trường lỏng đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo Khả nảy mầm sinh trưởng phát hạt nhân tạo môi trường lỏng sau 60 ngày gieo hạt thể Bảng 3.1 Hình 3.1 Khi gieo hạt nhân tạo 03 mơi trường thí nghiệm, với thời gian 60 ngày: Môi trường nước (H2O) đạt tỷ lệ hạt nảy mầm 100%, số chồi phát sinh trung bình từ hạt 1,40 (tỷ lệ hạt nảy mầm cho chồi 60% hạt cho hai chồi 40%), chiều cao chồi không thay đổi hạt nhân tạo gieo đạt tốc độ gia tăng trung bình chiều cao 1,41 ± SD cm; Mơi trường ½ MS đạt tỷ lệ nảy mầm 50%, số chồi phát sinh trung bình từ hạt 1,20 (tỷ lệ hạt nảy mầm cho chồi 40% hạt cho hai chồi 10%), tốc độ tăng trưởng trung bình chiều cao 1,18 ± SD cm; Mơi trường MS đạt tỷ lệ nảy mầm 25%, tất số hạt nảy mầm cho chồi nhất, tốc độ tăng trưởng trung bình chiều cao 0,97 ± SD cm; Kết cho thấy, hạt nhân tạo có khả nảy mầm, tái sinh chồi sinh trưởng tăng chiều cao môi trường lỏng, nhiên mơi trường khác có khác Ở môi trường nước cho kết tốt nhất, với tỉ lệ nảy mầm đạt 100%, số chồi hình thành 1,40 chồi/hạt chiều cao chồi đạt 1,41 cm Điều giải thích mơi trường lỏng nồng độ khoáng đa lượng, vi lượng vitamin cao khơng phù hợp đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo Bảng 3.1 Ảnh hưởng môi trường lỏng đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt Môi trường Chiều cao (cm) Số chồi/hạt Tỉ lệ nảy mầm (%) H20 1,41±SD 1,40 100 ½ MS 1,18 1,20 50,0 MS 0,97 1,00 25,0 lỏng 38 Như vậy, môi trường H2O tốt đến nảy mầm sinh trưởng phát triển chồi hạt nhân tạo Lan gấm Môi trường H20 Mơi trường ½ MS Mơi trường MS Hình 3.1 Sự nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt môi trường lỏng khác 3.2 Ảnh hưởng BA đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo Khả nảy mầm sinh trưởng hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt môi trường bổ sung nồng độ BA khác thể Bảng 3.2 Bảng 3.2: Ảnh hưởng BA đến nảy mầm sinh trưởng phát triển chồi hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt Nghiệm thức BA (mg/l) Chiều cao chồi Số chồi/hạt (cm) Tỉ lệ nảy mầm (%) MS1 0,0 0,38 1,00 52,50 MS2 0,1 1,42 2,60 80,00 MS3 0,5 1,86 3,50 90,00 MS4 1,0 2,11 4,80 90,00 MS5 1,5 1,73 3,20 85,00 MS6 2,0 1,25 3,00 70,00 Kết cho thấy, nồng độ BA khác tỉ lệ nảy mầm, số chồi tái sinh hạt sinh trưởng chiều cao chồi khác So sánh nghiệm thức MS1 (không bổ sung BA) với nghiệm thức lại (có bổ sung BA) số nghiệm thức MS1 thấp nhất( tỷ lệ nảy mầm 52,5%, số chồi hạt: 1; chiều cao chồi 0,38 cm) Điều chứng tỏ chất bổ sung BA có vai trò kích thích nảy mầm hạt nhân tạo Anoectochilus lylei gia tăng nồng độ BA (từ 0,1 39 mg/l đến 2,0 mg/l, với nghiệm thức tăng 0,5 mg/l) tỷ lệ nảy mầm, số chồi/hạt, tốc độ gia tăng kích thước chiều cao chồi gia tăng theo Ở Hình 3.2 kết hợp với bảng 3.2 cho thấy nghiệm thức MS3 MS4 cho tỷ lệ nảy mầm tốt 90%, so sánh số chồi hình thành hạt chiều cao chồi nghiệm thức MS4 cho kết cao hẳn (4,8 chồi/hạt 2,11±cm), nghiệm thức MS3 cho kết thấp (3,5 chồi/hạt 1,86±cm) Nhưng tăng nồng độ BA lên nghiệm thức MS5 MS6 tiêu chiều cao chồi, số chồi/hạt tỷ lệ nảy mầm lại thấp so với nghiệm thức MS3 MS4 Điều giải thích chất điều hòa sinh trưởng BA có tác dụng kích thích máy di 0,0 mg/l mg/l BA 0,1 mg/l mg/l BA 0,5 mg/l mg/l BA 1,0 mg/l mg/l BA 1,5 mg/l mg/l BA mg/l mg/l BA Hình 3.2 Ảnh hưởng BA đến nảy mầm sinh trưởng chồi hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt truyền trình tổng hợp chất tế bào, kích thích tổng hợp axit nuclêic, prơtêin, hoạt hóa tRNA q trình phân chia tế bào, nồng độ BA thấp chua đủ để kích thích tốc độ phản ứng hóa sinh xảy q trình phân chia tế bào, sử dụng nồng độ BA cao trở thành chất ức chế ngược phản ứng hóa sinh thực phân chia tế bào làm rối loạn hình thái, quan tạo nhiều cành, chồi tụ họp, hình thành dạng thay đổi (Lâm Ngọc Phương Nguyễn Bảo vệ, 2006) Hình Ảnh hưởng BA đến nảy mầm sinh trưởng hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo Ở biểu đồ cho thấy môi trường MS bổ sung mg/l BA tốt đến nảy mầm sinh trưởng chồi hạt nhân tạo 3.3 Khảo sát ảnh hưởng Kinetin đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo Khả nảy mầm sinh trưởng hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt môi trường bổ sung nồng độ BA khác thể Bảng 3.3 Bảng 3.3: Ảnh hưởng Kinetin đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt 40 Nghiệm thức KT1 KT2 KT3 KT4 KT5 KT6 Kinetin (mg/l) 0,0 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0 Chiều cao chồi (cm) 0,50 1,60 1,82 2,00 1,81 1,29 Số chồi/hạt 1,00 2,40 3,60 4,60 3,50 2,00 Tỉ lệ nảy mầm (%) 50,00 75,00 80,00 85,00 85,00 85,00 Kết cho thấy, nồng độ Kinetin khác tỉ lệ nảy mầm, số chồi tái sinh hạt sinh trưởng chiều cao chồi khác So sánh nghiệm thức KT1 (không bổ sung Kinetin) với nghiệm thức lại (có bổ sung Kinetin) số nghiệm thức KT1 thấp nhất( tỷ lệ nảy mầm 50% số chồi hạt: 1; chiều cao chồi 0,5 cm) So sánh nghiệm thức có bổ sung Kinetin lại nghiệm thức KT4, KT5, KT6 cho tỷ lệ nảy mầm cao 85% Kết hợp so sánh tiêu chiều cao chồi số chồi hạt nghiệm thức KT4 (ứng với nồng dộ 1,0 mg/l Kinetin) cho kết tốt ( 2cm 4,6 chồi/hạt), Kết cho thấy, nghiệm thức KT1 (môi trường khơng có Kinetin) chiều cao chồi sau 60 ngày đạt 0,50 cm thấp nghiệm thức có bổ sung Kinetin lại Từ bảng 3.3 thấy tăng nồng độ Kinetin từ 0,1 đến 1mg/l chiều cao chồi tăng theo từ 1,6 – 2cm ứng với nồng độ khác nhau, cao gấp 3-4 lần nghiệm thức KT1, nghiệm thức KT4 (ứng với nồng độ Kinetin 1mg/l) có chiều cao chồi cao 2,0 cm Khi tiếp tục tăng nồng độ Kenitin lên 1,5 mg/l 2,00mg/l chiều cao chồi đạt 1,81cm 1,29 cm Vậy với nồng độ Kenitin 1,0 mg/l môi trường thí nghiệm chồi đạt chiều cao trung bình 2,0 cm sau 60 ngày gieo đạt tốc độ sinh trưởng cao so với nồng độ lại Xác định tỷ lệ nảy mầm hạt môi trường thực nghiệm, môi trường đối chứng khơng bổ sung Kenitin vào mơi trường tỷ lệ nảy mầm hạt đạt 50,0% tức gieo 20 hạt với thời gian 60 ngày có 10 hạt nảy mầm 10 hạt khơng nảy mầm, so với mơi trường có bổ sung Kenitin với nồng độ 0,1 mg/l sau 60 ngày gieo hạt, tỷ lệ nảy mầm đạt 75,%, ứng với 20 hạt gieo có đến 15 hạt nảy mầm hạt không nảy mầm Tỷ lệ nảy mầm hạt tăng tăng nồng độ Kenitin mơi trường thí nghiệm tiếp tục tăng nồng độ Kenitin lên 0,5 mg/l tỷ lệ nảy mầm tăng lên 80,0%, có nghĩa 20 hạt gieo sau 60 ngày có 41 16 hạt nảy mầm 04 hạt không nảy mầm, tiếp tục tăng nồng độ Kenitin lên 1,0 mg/l tỷ lệ nảy mầm đạt 85,0%, có nghĩa 20 hạt gieo sau 60 ngày có 17 hạt nảy mầm 03 hạt khơng nảy mầm tiếp tục tăng nồng độ Kenitin lên 1,5 mg/l 2,0 mg/l tỷ lệ nảy mầm đạt tỷ lệ 85,0% Vậy chứng tổ Kenitin chất kích thích có ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm hạt qua thí nghiệm thấy rõ môi trường không bổ sung kenitin tỷ lệ nảy mầm hạt 50,0%, bổ sung Kenitin vào mơi trường khoảng thời gian 60 ngày sau gieo hạt, tỷ lệ nảy mầm tăng lên đạt tỷ lệ cao 85,0% nồng độ tăng lên từ 0,50 mg/l lên 1,0 mg/l trì đạt tỷ lệ nảy mầm 85% tăng nồng độ Kenitin từ 1,0 mg/l lên 1,5 mg/l lên 2,0 mg/l Số chồi/hạt số đánh giá ảnh hưởng Kenitin môi trường đến số chồi tạo từ hạt nhân tạo lan gấm, cụ thể: môi trường không bổ sung Kenitin 01 hạt cho 01 chồi, bổ sung vào mơi trường nghiệm 0,1 mg/l, số chồi trung bình tạo từ hạt 2,4 chồi/hạt tăng nồng độ Kenitin từ 0,1 mg/l lên 0,5 mg/l số chồi tạo 3,6 chồi tăng từ 0,5 mg/l lên 1,0 mg/l, số chồi tăng từ 3,6 chồi/hạt lên 4,6 chồi/hạt có ý nghĩa cho việc tạo số lượng lớn lan gấm từ 01 hạt nhân tạo thời gian phát triển hạt nhân tạo Khi tăng nồng độ Kenitin lên cao số chồi trung bình tạo từ hạt nhân tạo lại giảm xuống, cụ thể tăng từ 1,0 mg/l lên 1,5 mg/l số chồi tạo giảm xuống từ trung bình 4,6 chồi/hạt 3,5 chồi/hạt tiếp tục tăng nồng độ lên 2,0 mg/l, số chồi tạo trung bình có 2,0 chồi/hạt Vậy mơi trường bổ sung mg/l Kinetin nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo tốt nhất, với tỉ lệ nảy mầm 85%, số chồi hình thành 4,60 chồi/hạt chiều cao chồi đạt 2,00 cm Kết thí nghiệm cho thấy, nồng độ Kinetin nồng độ thấp (0 – mg/l) kích thích tái sinh chồi tăng trưởng chiều cao chồi, Kinetin nồng độ cao (1,5 – mg/l) ức chế sinh trưởng tăng chiều cao tái sinh chồi Biểu đồ Mối tương quan chiều cao chồi; số chồi/hạt tỷ lệ nảy mầm môi trường không bổ sung Kenitin có bổ sung Kenitin với nồng 42 độ khác (01, mg/l; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l) Như vậy, môi trường MS bổ sung mg/l Kinetin tốt đến nảy mầm sinh trưởng phát triển chồi hạt nhân tạo 0,5 mg/l Kinetin mg/l Kinetin 0,1 mg/l Kinetin mg/l Kinetin 1,5 mg/l Kinetin mg/l Kinetin Hình 3.3: Ảnh hưởng Kinetin đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt 3.4 Khảo sát ảnh hưởng giá thể đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo Từ kết thí nghiệm chọn mơi trường MS bổ sung mg/l BA, 50 g/l chuối, g/l than hoạt tính, 30 g/l sucrose, g/l agar, pH 5,8 để làm mơi trường ni cấy cho thí nghiệm Khả nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo giá thể agar, thấm, giấy thấm, cát vụn xơ dừa Kết cho thấy, hạt nhân tạo nảy mầm, tái sinh chồi tăng trưởng chiều cao, nhiên loại giá thể khác nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo có có khác nhau, theo số liệu phân tích bảng 3.4 thể hiện: môi trường agar, từ gieo hạt đến 60 ngày sau với kết thu thập tỷ lệ nảy mầm 92,50% mơi trường có bơng thấm đạt 80% môi trường giấy thấm đạt tỷ lệ 80%, môi trường cát, tỷ lệ nảy mầm đạt 40% vụn xơ dừa đạt 20% Vậy tỷ lệ nảy mầm môi trường agar đạt tỷ lệ trung bình cao (trong ba lần gieo thực nghiệm, lần thứ gieo 20 hạt có 19 hạt nảy mầm, lần thứ gieo 20 hạt có 18 hạt nảy mầm, lần thứ gieo 20 hạt có 19 hạt nảy mầm Vậy tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo lan gấm môi trường agar tương đối ổn định) Số chồi tạo từ hạt nhân tạo lan gấm sau 60 ngày gieo ra, môi trường agar trung bình có 4,7 chồi/hạt, mơi trường có bơng thấm có chồi; mơi trường có giấy thấm có 2,80 chồi/hạt; mơi trường có cát vụn sơ dừa thấp với số chồi/hạt 1,6 chồi/hạt 1,5 chồi/hạt Chiều cao chồi sau 60 ngày gieo hạt, môi trường: mơi trường có agar đạt chiều cao trung bình 43 chồi 1,96 cm, mơi trường có bơng thấm đạt chiều cao trung bình chồi 1,95 cm, mơi trường có giấy thấm đạt chiều cao trung bình chồi 1,62 cm, mơi trường cát đạt chiều cao trung bình chồi 1,40 cm môi trường vụn sơ dừa đạt chiều cao trung bình chồi 1,35 Vậy kết cho thấy hạt nhân tạo gieo giá thể agar tốt nhất, với tỉ lệ nảy mầm 92,50%, số chồi hình thành 4,70/hạt chiều cao chồi đạt 1,96 cm Bảng 3.4 Ảnh hưởng giá thể đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt Giá thể Chiều cao Số chồi/hạt Tỉ lệ nảy mầm (%) (cm) Agar 1,96 4,70 93,33 Bông thấm 1,95 4,00 80,00 Giấy thấm 1,62 2,80 80,00 Cát 1,40 1,60 40,00 Vụn xơ dừa 1,35 1,50 20,00 Biểu đồ Thể mối tương quan tỷ lệ nảy mầm, số chồi/hạt chiều cao chồi sau 60 ngày gieo hạt môi trường (môi trường bổ sung agar, môi trường có bơng thấm, mơi trường có giấy thấm, mơi trường bổ sung cát, môi trường bổ sung vụn sơ dừa) Như vậy, giá thể agar tốt đến nảy mầm sinh trưởng phát triển chồi hạt nhân tạo 44 Agar Bông thấm Giấy thấm Cát Vụn xơ dừa Hình 3.4 Ảnh hưởng giá thể đến nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo sau 60 ngày gieo hạt 3.5 Khảo sát ảnh hưởng môi trường đến bảo quản hạt nhân tạo điều kiện tối, 4oC Hạt nhân tạo lan gấm sau tạo tiến hành đem bảo quản điều kiện tối, với nhiệt độ 4oC bảo quản thời gian 180 ngày điều kiện môi trường khác nhau, như: môi trường H 2O, môi trường 1/2 MS lòng, mơi trường MS lỏng, mơi trường MS rắn, mơi trường MS + mg/l BA, sau đem tiến hành khảo sát khả nảy mầm, số chồi/hạt chiều cao chồi hạt nhân tạo Hạt nhân tạo sau bảo quản 180 ngày điều kiện tối, oC chuyển sang điều kiện nuôi cấy thông thường thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 34 µmol.m-2.s-1, nhiệt độ 25±2oC độ ẩm khơng khí 75 – 85% Khả nảy mầm hạt nhân tạo sau 60 ngày thể Bảng 3.5 Kết cho thấy, môi trường nước tỉ lệ nảy mầm đạt 100%, số chồi hình thành 2,50 chồi/hạt chiều cao chồi 2,10 cm, mơi trường khác như: ½ MS lỏng, MS lỏng, MS rắn mơi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng hạt khơng nảy mầm chết 100% chứng tỏ, môi trường giàu chất dinh dưỡng ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm hạt nhân tạo lan gấm 45 Bảng 3.5 Khả nảy mầm hạt nhân tạo sau bảo quản 180 ngày điều kiện tối, 4oC Môi trường Tỉ lệ nảy mầm (%) Số chồi/hạt Chiều cao chồi (cm) H20 100 2,50 2,10 ½ MS lỏng 0 MS lỏng 0 MS rắn 0 MS + mg/l BA 0 Biểu đồ Ảnh hưởng môi trường bảo quản đến khả nảy mầm, tạo chồi tốc độc gia tăng chiều cao chồi hạt nhân tạo lan gấm Như vậy, hạt nhân tạo bảo quản 180 ngày điều kiện tối, oC chuyển sang điều kiện ni cấy bình thường mơi trường H20 tốt đến khả nảy mầm hạt H20 ½ MS lỏng MS lỏng MS rắn MS + mg/l BA Hình 3.5 Khả nảy mầm hạt sau bảo quản 180 ngày điều kiện tối, 4oC 46 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua nghiên cứu hạt nhân tạo Lan gấm, em đưa kết luận sau: - Lần giới nước nghiên cứu thành công hạt nhân tạo Lan gấm Anoectochilus lylei - Trong môi trường lỏng mơi trường H 20 thích hợp đến khả nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo - Môi trường MS bổng sung mg/l BA mg/l Kinetin, 50 g/l chuối, g/l than hoạt tính, 30 g/l sucrose, pH 5,8 thích hợp đến khả nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo 47 - Giá thể agar tốt đến khả nảy mầm sinh trưởng phát triển hạt nhân tạo - Hạt nhân tạo bảo quản môi trường nước kiện kiện tối, oC thời gian 180 ngày chuyển sang ni cấy điều kiện bình thường (thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 34 µmol.m-2.s-1, nhiệt độ 25±2oC độ ẩm khơng khí 75 – 85%) có tỉ lệ nảy mầm cao nhất, với tỉ lệ đạt 100% 4.2 Kiến nghị Do thời gian có hạn, nên em có số đề nghị sau: - Tiếp tục đánh giá khả sinh trưởng Lan gấm nảy mầm từ hạt nhân tạo điều kiện vườn ươm - Tiếp tục theo dõi khả bảo quản hạt nhân tạo Lan gấm điều kiện tối, 4oC nghiên cứu chất ức sinh trưởng ABA bảo quản hạt nhân tạo Lan gấm 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO - Xem lại danh mục tài liệu tham khảo, không đầy đủ tác phẩm trích dẫn - TL tiếng Việt xếp ABC theo tên (Hùng Cao Đình Hùng, k phải Cao) - TL tiếng Anh xếp theo họ (Cao Cao Đinh Hung) - Kiểm tra lại format, lỗi tả hết tất TL Tài liệu tiếng Việt Bộ Khoa học Công nghệ (2007) Sách đỏ Việt Nam – Phần thực vật NXB Khoa học Tự nhiên & Cơng nghệ, Hà Nội Chính Phủ Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam (2006) Nghị định số 32/2006/NĐ-CP Cao Đình Hùng, Phan Xuân Huyên, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Nguyễn Trí Minh Đinh Văn Khiêm (2013) Nghiên cứu sản xuất hạt nhân tạo hoa cúc Đóa vàng (Chrysanthenum morifolium Ramat.) Đề tài nghiên cứu khoa học cấp sở, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Dương Tấn Nhựt, Trần Ngọc Thủy Tiên, Mai Thị Ngọc Hương, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Phan Xuân Huyên, Bùi Văn Lệ Ðỗ Năng Vịnh (2004) Một số nghiên cứu hạt nhân tạo hoa Lily (Lilium spp.) Tạp chí cơng nghệ sinh học, (3): 359-370 Lâm Ngọc Phương Nguyễn Bảo vệ (2006), Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA, BA than hoạt tính đến tạo rễ chồi dưa hấu tam bội invitro (Citrullus Vulgaris Schard) Tạp chí khoa học Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, kỳ 2, tháng 01/2006, trang 39-44 Nguyễn Văn Uyển (1984) Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng NXB thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Miện (2012) Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồn nguồn dược liệu quí Tạp chí Khoa học Phát triển 10(4): 579-603 Phạm Hoàng Hộ (2000) Cây cỏ Việt Nam, III, NXB TP Hồ Chí Minh 49 Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành (2010) Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro lồi lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 26: 248-253 10 Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng (2010) Đặc điểm hình thái, phân bố loài lan kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl) Vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 26: 104-109 11 Phan Xuân Huyên, Trần Văn Thịnh, Cao Đình Hùng (2014) Bước đầu nghiên cứu khả tái sinh bảo quản hạt nhân tạo đảng sâm (Codonopsis javanica Blume) Kỷ yếu Hội nghị Khoa học lần thứ – Hội Sinh lý thực vật Việt Nam NXB Đại học Nông nghiệp, trang 286-294 12 Phan Xuân Huyên, Đinh Văn Khiêm, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Hoàng Văn Cương, Nguyễn Thị Phượng Hoàng, Nguyễn Văn Kết, Phan Hoàng Đại, Nguyễn Thị Cúc (2015) Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng ex vitro Lan gấm (Anoectochilus lylei rolfe ex downies) Kỷ yếu Hội thảo khoa học Sinh học – Nông nghiệp lần thứ I, Đại học Đà Lạt, trang 85-96 13 Trương Thị Bích Phượng, Phan Ngọc Khoa (2013) Nhân giống in vitro lan kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl) Tạp chí Khoa học, Đại học Huế 79(1): 41-46 14 Võ Văn Chi (1997) Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y học Tài liệu tiếng Anh 15 Du XM, Irino N, Uto T, Morinaga O, Shoyama Y (2008) Micropropagation of Anoectochilus formosanus Hayata in vitro and pharmacological and chemical investigations Phytochemistry 9: 79-87 16 Ho CK, Chang SH, Chen ZZ (1987) Tissue culture and acclimatization in Anoectochilus formosanus Hayata Bull Taiwan For Res Inst 2: 83-105 17 Ket NV, Hahn EJ, Park SY, Chakrabarty D, Paek KY (2004) Micropropagation of an endangered orchid Anoectochilus formosanus Biologia Plantarum 48 (3): 339-344 50 18 Nguyen Van Ket (2003) Effect of Environmental Conditions on In vitro and Ex vitro Growth of Jewel Orchid (Anoectochilus formosanus Hayata) PhD Thesis of Philosophy in Agriculre, The Gra duate School of Chungbuk National University, Korea 19 Pandey DM, , Yu KW, Wu RZ, Hahn EJ, Paek KY (2006) Effects of different irradiances on the photosynthetic process during ex vitro acclimation of Anoectochilus plantlets Hotosynthetica 44(3): 419-424 20 Shiau YJ, Sagare AP, Chen UC, Yang SR, Tsay HS (2002) Conservation of Anoectochilus formosanus Hayata by artificial cross-pollination and in vitro culture of seeds Bot Bull Acad Sin 43: 123-130 21 Tai KS (1987) In vitro propagation of Anoectochilus formosanus (Hayata) J Agric Asso China 137: 42-54 22 Wu RZ, Baque MA, Paek KY (2010) Establishment of a large-scale micropropagation system for Anoectochilus formosanus in bioreactors Acta Hort 878:167-173 51 ... phân bố Chi Lan gấm (Anoectochilus) có khoảng 51 lồi thuộc họ lan (Orchidaceae) Tất lồi chi Lan gấm có nguồn gốc ngồi tự nhiên Ở châu Á có khoảng 40 lồi Lan gấm phân bố rộng khắp Sri Lanka, Ấn... ni trồng nhân tạo Lan gấm thành công giá thể vụn xơ dừa Theo Nguyễn Hoàng Quân “Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi lan Vanda” kết cho thấy hạt nhân tạo từ phôi lan Vanda có hình dạng... Phalaenopsis cần khoảng 30% ánh sáng Và đa số loài Lan gấm sống với điều kiện ánh sáng, ánh sáng khoảng 10 – 20% thích hợp Độ thơng gió: Lan có nhóm phong lan địa lan, tốc độ gió khoảng 10-15 km/giờ, nghĩa