CHẾ tạo CHỨNG nội CÙNG mồi với DNA ĐÍCH TRONG PCR

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA Khoa học ứng dụng KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CHẾ TẠO CHỨNG NỘI CÙNG MỒI VỚI DNA ĐÍCH TRONG PCR PHÁT HIỆN HBV-DNA Người hướng dẫn: TS PHẠM TRƯỜNG SƠN Người thực hiện: LƯU CẨM ĐƯỜNG Lớp : 14060302 Khố : 18 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018 - 2019 TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA Khoa học ứng dụng KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHẾ TẠO CHỨNG NỘI CÙNG MỒI VỚI DNA ĐÍCH TRONG PCR PHÁT HIỆN HBV-DNA Người hướng dẫn: TS PHẠM TRƯỜNG SƠN Người thực hiện: LƯU CẨM ĐƯỜNG Lớp : 14060302 Khoá : 18 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018 - 2019 Lời cảm ơn Trong chuyến thực Khóa luận lần này, lần khai sáng kiến thức vơ bổ ích mẻ giúp em có thêm nhiều phấn đấu để tìm hiểu ngành Cơng nghệ sinh học Để hoàn thành nhiệm vụ giao, nỗ lực học hỏi thân có hướng dẫn tận tình thầy cơ, chú, anh chị làm việc Công ty TNHH Dịch Vụ Và Thương Mại Nam Khoa Em chân thành cảm ơn TS PHẠM TRƯỜNG SƠN, người hướng dẫn cho em suốt thời gian thực khóa luận Thầy xếp thời gian em cách làm, định hướng cho em, để em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Một lần em chân thành cảm ơn thầy chúc thầy dồi sức khoẻ Tuy nhiên kiến thức chun mơn hạn chế thân thiếu nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung báo cáo khơng tránh khỏi thiếu xót, em mong nhận góp ý, bảo thêm q thầy tồn thể cán bộ, cơng nhân viên cơng ty để báo cáo hồn thiện Một lần xin gửi đến thầy cô, bạn bè cô chú, anh chị doanh nghiệp lời cảm ơn chân thành tốt đẹp nhất! CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học TS PHẠM TRƯỜNG SƠN Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngồi ra, luận văn sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Trường đại học Tơn Đức Thắng khơng liên quan đến vi phạm tác quyền, quyền tơi gây q trình thực (nếu có) TP Hồ Chí Minh, ngày 13 tháng 02 năm 2019 Tác giả Tóm tắt Sinh viên LƯU CẨM ĐƯỜNG, Đại học Tôn Đức Thắng Tên đề tài: “Chế tạo chứng nội mồi với DNA đích PCR phát HBV-DNA” Đề tài tiến hành phòng thí nghiệm sinh học phân tử đạt chuẩn Cơng ty TNHH Dịch Vụ Và Thương Mại Nam Khoa Địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn, P Tân Hưng, Q 7, TP HCM, Việt Nam GVHD: TS PHẠM TRƯỜNG SƠN Ly trích đoạn DNA từ đối tượng tơm post mang bệnh còi MBV, chèn đoạn mồi overhang có trình tự giống với mồi DNA đích virus HBV Từ khuếch đại đoạn gen này, tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR thơng qua q trình điện di, tạo dòng sản phẩm PCR theo phương pháp TOPO cloning với enzyme topoisomerase vừa có khả cắt vừa có khả nối DNA tái tổ hợp, ly trích sản phẩm DNA tái tổ hợp, Real-time PCR để xem sản phẩm có mong muốn ban đầu, qua thử nghiệm với mẫu bệnh phẩm có thêm vào chứng nội vừa chế tạo qua kỹ thuật Real-time PCR với nồng độ pha lỗng khác để tìm chứng nội cho kết tốt độ tin cậy cao Trong trình thiết kế thử nghiệm, ứng với chứng nội có nồng độ pha lỗng IC lưu trữ áp dụng làm chứng nội cho thí nghiệm trình xét nghiệm sau Mục lục Danh mục • Danh mục hình Chương Lời mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Bệnh viêm gan siêu vi B virus HBV (Hepatitis B virus) bệnh truyền nhiễm phổ biến nguy hiểm Hằng năm theo thống kê tổ chức y tế giới (WHO), số người mắc bệnh biến chứng viêm gan siêu vi B khơng có dấu hiệu thun giảm Việc phát định lượng virus HBV đóng vai trò quan trọng chuẩn đốn phác đồ điều trị cho bệnh nhân Vì vậy, kỹ thuật PCR với real-time PCR đời để phát định lượng HBV-DNA xác hơn, nhanh hơn, hiệu suất cao áp dụng nhiều nơi Đề tài “Chế tạo chứng nội mồi với DNA đích PCR phát HBVDNA” để kiểm sốt q trình xét nghiệm loại bệnh phẩm có tên HBV khơng giúp kết đạt độ tin cậy cao mà kiểm sốt q trình thao tác kết Trải qua nhiều công đoạn từ việc ly trích DNA lồi tơm post, phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen q trình thử nghiệm nhằm tạo loại chứng nội phù hợp thách thức cho người chế tạo Lý công đoạn phương pháp kỹ thuật khác nhau, cách sử dụng loại hóa chất thiết bị khơng giống nhau, thí nghiệm phải lặp lại nhiều lần để đảm bảo giá trị kết không chênh lệch độ chuẩn xác cao 1.2 Ý nghĩa Việc xét nghiệm cho kết khơng chuẩn xác gây nhiều hệ luỵ cho người gửi mẫu xét nghiệm Chính vậy, q trình xét nghiệm, việc cho vào mẫu loại chứng nội phù hợp giải tình trạng kết xét nghiệm chưa chuẩn xác Bệnh nhân gửi mẫu đến trung tâm xét nghiệm có kết xác, trường hợp kết dương tính với bệnh việc phát bệnh sớm đưa phác đồ điều trị thích hợp nhằm giảm thiểu trường hợp đáng tiếc xảy Chương Tổng quan 2.1 Giới thiệu chung 2.1.1 Đặc điểm hình thái Virus viêm gan siêu vi B (Hepatitis B virus, HBV), thuộc chi Orthohepadnavirus, thuộc họ virus Hepadnaviridae, Unassigned [18] Virus gây nên bệnh viêm gan siêu vi B Đây virus viêm gan có acid nhân DNA (các virus khác RNA) HBV quan sát kính hiển vi điện tử quang học có loại tiểu thể khác nhau: tiểu thể với đường kính 22 nm có hình cầu, tiểu thể hình ống (hoặc hình que) có đường kính 20-22 nm, dài từ 40-400 nm tiểu thể hình cầu lớn (Dane) với đường kính 42-45nm, virus hồn chỉnh HBV thuộc loại siêu vi trùng (hay virus), bền vững với nhiệt độ: 100 o C có khả sống 30 phút, -20o C sống tới 20 năm, HBV kháng ester , bất hoạt formalin [15] 2.1.2 Cấu tạo HBV mang DNA vòng có cấu trúc hai sợi kép khơng khép kín có trọng lượng phân tử 2x106, cấu tạo 3200 nucleotide [18] Vỏ capsid có hình khối đối xứng, kích thước khoảng 27nm, vỏ dày khoảng nm cấu tạo protein cấu trúc: protein lớn, protein trung bình protein nhỏ, vỏ bao tạo cho virus có hình cầu đường kính 42 nm (Hạt Dane) Hạt ngồi khơng chứa vật liệu di truyền nên khơng có khả lây nhiễm, bao gồm lipid protein tạo thành phần bề mặt virion, gọi kháng nguyên bề mặt HBsAg tạo liên tục suốt vòng đời virus 2.1.3 Phân loại kiểu gen HBV 2.1.3.1 Kiểu huyết (Serotype) Có phân nhóm huyết HBV xác định dựa yếu tố định kháng nguyên HBsAg định kiểu gen riêng biệt 10 virus HBV Những đặc tính bao gồm kháng nguyên phổ biến gọi a hai cặp chất phụ, d/y w/r Các thành viên cặp chất phụ loại trừ lẫn nhau, dẫn đến nhóm HBsAg: adw, adr, ayw ayr [15] 2.1.3.2 Kiểu gen (Genotype) HBV có kiểu gen phát theo ký hiệu bảng chữ từ A-H Cho đến gần đây, biến thể HBV phát Việt Nam, kiểu gen HBV mở rộng từ A-I [18] Việc phân loại kiểu gen theo thứ tự dựa khác 8% chuỗi nucleotide hoàn chỉnh HBV từ vượn chia thành phân nhánh bao gồm Chimpanzee, Gorilla, Orangutan Gibbon Hình 2.1 Cây phát sinh gen dựa gen S HBV đại diện cho mối quan hệ họ HBV người vượn 40 − Chuyển dung dịch ly giải vào cột Spin − Ly tâm tốc độ tối đa phút nhiệt độ phòng Loại bỏ dung dịch gắn lại cột vào ống thu • Rửa − Bổ sung 750 dung dịch rửa (ethanol) Ly tâm tốc độ tối đa phút Loại bỏ dung dịch gắn lại cột vào ống thu − Tiếp tục rửa với 250 dung dịch rửa − Ly tâm tốc độ tối đa phút nhiệt độ phòng • Rửa giải − Chuyển cột Spin sang tube 1.5ml vô trùng, lưu ý không để dung dịch rửa dính với cột Spin Nếu cột Spin có dính dung dịch rửa, tiến hành ly tâm lại phút với tốc độ tối đa, sau chuyển cột Spin sang tube 1.5ml − Thêm 100µl nước khơng chứa Dnase Rnase vào cột Spin Máy ly tâm tốc độ tối đa phút nhiệt độ phòng − Tháo cột bảo quản DNA nhiệt độ -20° C trở xuống 3.4.2.6 Real-time PCR kiểm tra DNA tái tổ hợp Tiến hành Real-time PCR sản phẩm DNA tái tổ hợp thiết lập sẵn chu trình luân nhiệt máy Khởi động lên 95 o C 10 phút để hoạt hóa enzyme, bắt đầu cho chu kỳ với 95o C 15 giây, 60o C phút, 72o C phút 30 giây, thực 40 chu kỳ với Kit IVD NK qPCR-VBquant Đọc tín hiệu qua kênh FAM Mục đích: kiểm tra sản phẩm tái tổ hợp có mong muốn ban đầu hay khơng 3.4.2.7 Tối ưu hóa chứng nội mồi mẫu bệnh phẩm HBV • Kiểm tra DNA tái tổ hợp ổn định dãy pha lỗng nồng độ IC khơng qua q trình ly trích DNA Pha lỗng chứng nội thành dãy nồng độ khác khơng qua q trình ly trích để kiểm tra xem mức độ ổn định, sai lệch, độ xác vector tái tổ hợp • Tối ưu hóa dãy pha lỗng nồng độ IC chứng dương đông khô thử nghiệm IC mẫu bệnh phẩm qua ly trích − Thực với chứng dương đông khô biết trước nồng độ 41 Mục đích để kiểm tra chứng nội ứng với nồng độ có ổn định khơng, chứng dương có bị ảnh hưởng khơng, có cạnh tranh hay không, nồng độ chứng nội phù hợp trình xét nghiệm − Thực với mẫu bệnh phẩm Mục đích để kiểm tra xem chứng nội vừa chọn bước có đạt ổn định không ảnh hưởng đến mẫu bệnh phẩm hay không 42 Chương Kết bàn luận 4.1 Kết Pha dãy nồng độ chứng nội để tối ưu hóa chọn nồng độ phù hợp nhất, ổn định để ứng dụng kỹ thuật xét nghiệm Cách tiến hành: • Pha dung dịch bảo quản: chuẩn bị ống Falcon có sẵn 100ml dung dịch TE 1X, sau hút 1ml dung dịch Sodium acid 100X hòa với TE 1X trên, đảo • Pha dãy nồng độ sau: Chứng nội nồng độ IC Dung dịch bảo quản Thu Bảng 4.1: Pha nội dãy 3nồng độ chứng 1ml IC3 1ml IC4 1ml IC5 1ml IC6 1ml IC7 1ml IC8 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml IC4 IC5 IC6 IC7 IC8 IC9 4.1.1 Kiểm tra DNA tái tổ hợp ổn định dãy pha loãng nồng độ IC khơng qua q trình ly trích DNA Hút 10µl IC với độ pha lỗng khác vào tube SFGC đánh số Mỗi tube cho vào 15µl từ Kit IVD NK qPCR-VBquant, tiến hành chạy mẫu đọc kết kênh HEX 43 Kiểm tra mức độ thành công DNA tái tổ hợp Đồ thị 4.1: Kết tín hiệu khuếch đại chứng nội nồng độ IC4 ghi nhận máy Real-time PCR CFX 96 Biorad Từ đồ thị trên, nồng độ IC4, kết chứng nội có chu kỳ vượt ngưỡng (Ct) 16.83  Điều chứng tỏ thiết kế DNA tái tổ hợp cặp mồi sử dụng phù hợp Kiểm tra độ ổn định dãy pha loãng nồng độ IC 4.1.1.1 Kiểm ổn định dãy pha loãng nồng độ IC IC4 IC5 IC6 IC7 IC8 IC9 Đồ thị 4.2: Kết tín hiệu khuếch đại chứng nội nồng độ IC4, IC5, IC6, IC7, IC8, IC9 ghi nhận máy Real-time PCR CFX 96 Biorad 44 Bảng 4.2: Giá trị chu kỳ ngưỡng ứng với nồng độ Nồng độ IC4 IC5 IC6 IC7 IC8 IC9 Chu kỳ ngưỡng (Ct) 16.83 16.90 23.40 27.20 30.44 33.57 Giữa hai ống phản ứng có số lượng DNA đích ban đầu cách hệ số pha loãng A (với A=10), hai đường biểu diễn khuếch đại có độ giãn cách n chu kỳ, cường độ huỳnh quang hai ống cách hệ số pha loãng A=2n  10 = 2n  n = 3.32 • • • • • Độ giãn cách IC4 IC5: n1= 19.90 – 16.83 = 3.07 Độ giãn cách IC5 IC6: n2= 23.40 – 19.90 = 3.5 Độ giãn cách IC6 IC7: n3= 27.20 – 23.40 = 3.8 Độ giãn cách IC7 IC8: n4=30.44 – 27.20 = 3.24 Độ giãn cách IC8 IC9: n5=33.57 – 30.44 = 3.13 Độ giãn cách trung bình: = = 3.348 Độ lệch chuẩn S: S= Suy ra, S = 0.302 Từ giá trị S = 0.302, suy độ giãn cách trung bình nồng độ chứng nội có giá trị khơng q chênh lệch so với n = 3.32, suy nồng độ đạt 4.1.2 Tối ưu hóa dãy pha lỗng nồng độ IC chứng dương đông khô kiểm tra IC mẫu bệnh phẩm qua ly trích 4.1.2.1 Tối ưu hóa dãy pha lỗng nồng độ IC chứng dương đơng khơ Hồn ngun chứng dương đơng khơ cách bổ sung vào 300µl dung dịch TE 1X để chuyển sang trạng thái dung dịch Tiến hành ly trích DNA máy KingFisher Flex, ta cần chuẩn bị bảng plate Deep well 96: 45 • Plate 1: cho vào 700 lysis buffer + 30 NKMagbead + 20 proteinase K + 200 • • • • chứng dương + 10 IC (với nồng độ khác nhau) có sẵn tip comb Plate 2: cho vào 1000Wash Plate 3: cho vào 1000Wash Plate 4: cho vào 1000Wash Plate 5: cho vào 100 Elution Khởi động máy Kingfisher Flex tiến hành đặt plate vào theo thứ tự plate 1, plate 2, plate 3, plate 4, plate Cần phải đặt góc A1 máy tương ứng với vị trí A1 plate Bắt đầu chạy chương trình thiết lập sẵn Thu mẫu plate (Elution) tiến hành Real-time PCR, khởi động trì nhiệt độ 95o C 15 phút, thực 40 chu kỳ với chu kỳ gồm 95 o C 15 giây, 60o C phút, sử dụng Kit IVD NK qPCR-VBquant, đọc kết qua kênh FAM (đối với chứng dương) kênh HEX (đối với chứng nội) 46 ND8 ND7 ND6 ND5 ND4 Đồ thị 4.3: Kết tín hiệu khuếch đại chứng dương nồng độ 4, 5, 6, 7, qua kênh FAM ghi nhận máy Real-time PCR CFX 96 Biorad Bảng 4.3: Giá trị chu kỳ ngưỡng chứng dương chứng nội Nồng độ Chu kỳ ngưỡng (Ct) chứng dương 19.75 20.02 19.06 20.61 20.63 Chu kỳ ngưỡng (Ct) chứng nội 18.81 22.21 25.50 26.75 N/A Từ đồ thị bảng giá trị trên, ta tính giá trị trung bình Ct chứng dương chứng nội Giá trị trung bình chứng dương = = 20.05 Độ lệch chuẩn S: S= Suy ra, S = 0.656 Với = 20.05 S = 0.656, nên giá trị Ct phải nằm khoảng giá trị 20.050.656 47 Chứng tỏ ứng với nồng độ IC4, IC5, IC7, IC8 cho giá trị Ct chứng dương dao động xung quanh Tuy nhiên nồng độ IC8, đường khuếch đại tín hiệu chứng nội không vượt ngưỡng Vậy loại chứng nội IC8, giá trị Ct chứng dương nồng độ 4, 5, không bị cạnh tranh chứng nội mức độ ổn định chứng dương đạt, nên sử dụng IC4, IC5, IC7 Đồ thị 4.4: Kết tín hiệu khuếch đại chứng dương chứng nội nồng độ tương ứng IC7 qua kênh FAM HEX ghi nhận máy Real-time PCR CFX 96 Biorad Từ giá trị tính tốn đồ thị 4.4, chọn nồng độ IC7 để thử nghiệm mẫu bệnh phẩm nồng độ thấp mà lại đạt ổn định, khơng có cạnh tranh, đảm bảo mục đích kiểm sốt q trình ly trích phản ứng khuếch đại 48 4.1.2.2 Kiểm tra chứng nội nồng độ IC7 mẫu bệnh phẩm HBV Thực ly trích DNA 92 mẫu bệnh phẩm chạy Real-time PCR với 200mẫu 10 chứng nội Đọc kết qua kênh FAM (đối với mẫu bệnh) kênh HEX (đối với chứng nội) Đồ thị 4.5: Kết tín hiệu khuếch đại 92 mẫu bệnh phẩm chứng nội nồng độ IC7 qua kênh FAM HEX ghi nhận máy Real-time PCR CFX 96 Biorad 49 Bảng 4.4: Kết chạy mẫu bệnh phẩm với chứng nội IC7 92 mẫu máy Real-time PCR CFX 96 Biorad Mẫu Mẫu 47 48 49 50 51 52 53 54 10 55 11 56 12 57 13 58 14 59 15 60 16 61 17 62 18 63 19 64 20 65 21 66 22 67 23 68 FAM 21.38 FAM 36.78 36.94 N/A N/A 33.62 34.18 17.04 31.11 34.35 36.16 18.19 N/A 35.03 31.17 31.01 32.36 37.87 29.14 28.49 35.47 N/A N/A N/A 20.15 N/A 22.51 N/A N/A N/A 30.92 32.31 33.21 N/A 14.55 15.45 26.98 N/A 36.85 14.31 11.64 37.11 27.45 N/A N/A HEX N/A HEX 32.93 32.37 34.54 31.52 33.48 31.34 N/A 31.39 33.28 31.6 N/A 31.25 34.39 31.19 32.61 31.46 33.64 31.32 31.62 31.08 30.97 32.5 32.2 37.93 32.37 35.22 32.46 31.72 32.96 31.23 33.26 32.92 34.38 N/A N/A 32.07 32.76 31.45 N/A N/A 31.73 31.17 31.44 N/A Kết Mẫu 24 Mẫu 25 70 26 71 27 72 28 73 29 74 30 75 31 76 32 77 33 78 34 79 35 80 36 81 37 82 38 83 39 84 40 85 41 86 42 87 43 88 44 89 45 90 46 91 FAM N/A FAM N/A 36.35 N/A N/A N/A N/A 26.28 N/A 31.25 N/A 14.91 N/A 31.75 N/A N/A N/A 38.3 33.68 39.32 27.88 38.49 N/A 32.57 N/A 31.6 N/A N/A N/A 16.58 30.14 N/A 32.78 N/A 33.74 36.41 N/A 25.19 32.95 37.47 32.3 35.22 37.47 37.33 31.56 HEX Kết 33.11 Kết âmquả Kết HEX dương 31.36 âm dương 33.33 dương âm 31.56 âm âm 32.83 âm dương 31.61 âm dương 33.59 âm 31.35 dương dương 32.91 âm dương 32.61 dương dương 33.94 âm N/A âm 33.2 âm dương 31.13 dương dương 32.8 âm dương 31.47 âm dương 31.54 âm dương 31.07 dương dương 31.63 dương dương 31.03 dương dương 31.31 dương âm 31.1 dương âm N/A âm 32.32 dương dương 33.63 âm âm 32 dương dương 33.01 âm âm 31.65 âm âm 33.01 âm âm N/A dương 33.68 dương dương 31.75 âm dương 33.26 dương âm 31.9 âm 32.74 dương 30.89 dương dương 33.75 âm âm 31.08 dương dương 34.52 dương 32.27 dương 33.8 dương dương 31.65 dương dương 32.65 dương âm 33.3 dương 32.05 dương 69 N/A 33.03 âm 92 27.65 30.55 dương Trong 92 mẫu bệnh xét nghiệm, có 48 trường hợp dương tính, 33 trường hợp âm tính, lại 11 trường hợp chưa xác định chứng nội khơng có giá trị Ct • Giá trị chứng nội mẫu dương tính 32.5064 • Giá trị chứng nội mẫu âm tính 32.3333 • Trong 92 mẫu bệnh xét nghiệm, có 11 trường hợp chứng nội không lên giá trị Ct 50 Ta thấy bảng giá trị, mẫu dương tính âm tính, giá trị Ct chứng nội dao động gần khoảng , nên chứng nội IC7 ổn định sử dụng để kiểm sốt q trình chạy mẫu, xét nghiệm 4.2 Bàn luận Kiểm tra với dãy pha loãng nồng độ IC cho kết tốt, tất nồng độ đạt nên trình tạo DNA tái tổ hợp thành công cặp mồi overhang sử dụng phù hợp Thực với chứng dương đông khô biết trước nồng độ, cho kết chứng nội IC4, IC5, IC7 phù hợp Trong trình xét nghiệm với mẫu bệnh phẩm HBV, chứng nội nồng độ IC7 chọn có nồng độ thấp, cho kết ổn định, vậy, số trường hợp chứng nội khơng có giá trị Ct dẫn đến kết chưa kể khẳng định âm tính hay dương tính Tình trạng cần khắc phục cách thực trình xử lý mẫu thao tác chạy mẫu cẩn thận tập trung để tránh thời gian chi phí để chạy lại mẫu 51 Chương Kết luận kiến nghị 5.1 Kết luận Qua việc thực trình thiết kế chứng nội mồi với DNA đích qua thử nghiệm với chứng dương đơng khơ 92 mẫu bệnh phẩm HBV phòng xét nghiệm Nam Khoa BioTek rút số kết luận sau: • Có ba nồng độ IC4, IC5, IC7 sử dụng để làm chứng nội Tuy nhiên, nồng độ IC7 thấp nên sử dụng để thử nghiệm với chứng dương đông khô mẫu bệnh phẩm HBV • IC7 đáp ứng điều kiện ổn định không cạnh tranh với chứng dương mẫu bệnh phẩm, dùng IC7 làm chứng nội cho xét nghiệm HBV 5.2 Kiến nghị • Bởi thời gian thực đề tài có giới hạn nên khơng thể tránh khỏi sai xót phương diện khác thao tác, pha hóa chất, kỹ thuật sử dụng máy móc, thiết bị, bơm mẫu vào giếng, tube, …nên cần cẩn thận tập trung cao độ trình thực thí nghiệm • Cần phải kiểm tra hai nồng độ IC4 IC5 đối chiếu kết với IC7 để xem xét nồng độ thích hợp tốt • Cần thử nghiệm chứng nội vừa thiết kế thời gian dài để xem độ ổn định mức độ hoạt động đồng mẫu khác • Xem xét điều kiện bảo quản thích hợp để chứng nội giữ hoạt độ không bị ảnh hưởng thời gian lưu trữ dài 52 Tài liệu tham khảo • Tài liệu tiếng Việt Đặng Thị Hồng Anh (2008), Nguyên lý Kỹ thuật chuẩn đoán bệnh thủy sản, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, 95 trang, Nguyễn Đức Cường, Lê Minh Tiến, Đỗ Quốc Tiệp (2016), “Tình trạng nhiễm kiến thức phòng chống nhiễm vi rút viêm gan B người”, Tạp chí Y học dự phòng, (Tập XXVI, số 15), tr 188 Trần Thị Mỹ Duyên, Bùi thị Bích Hằng, Lê Thanh Nhã (2012), “phát monodon baculovirus nhiễm tơm Đồng Tháp”, Tạp chí Khoa học, (22), tr 213-219 Trần Thị Kim Loan (2011), Viêm gan B mạn tính chế độ dinh dưỡng cho người bệnh, Khóa luận tốt nghiệp điều dưỡng đa khoa, Đại học Thăng Long, Hà Nội Phạm Song (2009), Viêm gan Virus B, D, C, A, E, GB Cơ bản, đại cập nhật, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 292 trang Trung tâm gan Á Châu (2016), Cẩm nang cho cán y tế viêm gan B, Đại học Stanford Phạm Hùng Vân (2009) ,PCR Real-time PCR vấn đề thường gặp, Nhà xuất Y học, Hà Nội Phan Thị Vân (2011), “Ứng dụng công nghệ sinh học chuẩn đốn phòng bệnh thủy sản”, Tạp chí Khoa Học Công Nghệ, (83), tr 25-32 Võ Thị Hải Yến (2011), Quy trình chuẩn đốn bệnh viêm gan siêu vi B phương pháp Real-time PCR, Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học, Đại học Kỹ thuật công nghệ TPHCM, TPHCM • Tài liệu tiếng Anh 53 10 Abe K (1994), Detection of Hepatitis virus genome in paraffn-embedded tissues by Nested reverse transcription polymerase chain reaction, Int Hepatol Commun, 2, pp 352 11 Abe K (1998), In situ detection of Hepatitis B, C and G virus nucleic acids in human hepatocellular carcinoma tissues from different geographic regions, Hepatology, 2, pp 568 12 Bianchi L, and Gudat F (2006), Sanded nucleic in Hepatitis B Eosinophilic inclusions in liver cell nuclei due to excess in Hepatitis B core antigen formation, Lab Invest, 1, pp 35-37 13 Colson P, Roquelaure B, and Tamalet C (2009), Detection of a newly identifed Hepatitis B virus genotype in southeastern France, J Clin Virol, 4, pp 165 14 Ding X (2003), Geographic characterization of Hepatitis virus infections, genotyping of Hepatitis B virus, and p53 mutation in hepatocellular carcinoma analyzed by in situ detection of viral genomes from carcinoma tissues: Comparison among six different countries, Jpn J Infect Dis, 5, pp 12-20 15 Dongyou Liu (2011), “Hepatitis B Virus”, Molecular Detection of Human Virus Pathogens, CRC Press Taylor & Francis, 6000 Broken Sound Parkway NW, Suite 300 Boca Raton, USA, pp 845 16 Hammond (2014), Comparison of immunogenicity of two yeast-derived recombinant Hepatitis B vaccine, 3, pp 90-97 17 Hui, et al (2006), Kinetics and risk of de novo Hepatitis B infection in HBsAg negative patients undergoing cytotoxic chemotherapy, Gastroenterology, pp 111120 18 Huy, and Abe (2004), Molecular epidemiology of Hepatitis B and C virus infections in Asia, Pediatr Int, pp 223 19 Mason (2005), Hepadnaviridae, in Virus Taxonomy Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Elsevier, Amsterdam (Chi , họ, bộ) 54 20 Olinger (2008), Possible new Hepatitis B virus genotype, Southeast Asia, Emerg Infect Dis 14, pp 1777 21 Payungporn (2004), Simultaneous quantitation and genotyping of hepatitis B virus by real-time PCR and melting curve analysis, J Virol Methods, pp 120-131 22 Promega, Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System, 09/2012, https://www.promega.com/-/media/files/resources/protcards/wizard-plus-svminipreps-dna-purification-system-quick-protocol.pdf?la=en.1 23 Simmonds, and Midgley (2005), Recombination in the genesis and evolution of Hepatitis B virus genotypes, J Virol, 2, pp 5467 24 Zhang (2007), Analysis of the complete Hepatitis B virus genome in patients with genotype C chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma, Cancer Sci, pp 98-100 ... với DNA đích dùng mồi khác biệt DNA đích DNA chứng nội có nguồn gốc khác biệt hồn tồn DNA đích Cho vào PCR cặp mồi đặc hiệu với DNA chứng nội mồi phải có nhiệt độ bắt cặp tương tự nhiệt độ mồi. .. độ mồi dành cho DNA đích Phải cần plasmid mà có chứa DNA khác với DNA đích cần thiết kế primer • Chứng nội DNA tổng hợp có nguồn gốc khác DNA đích sử dụng mồi với DNA đích Là DNA tổng hợp cách... ức chế có diễn hay khơng Do đó, chứng nội khơng có khả kiểm sốt hệ thống khuếch đại DNA đích dùng mồi khác biệt • Chứng nội hệ thống mồi DNA khác biệt với DNA đích Là DNA khuếch đại song song với