BÀI GIẢNG KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN VÀ TẠO DÒNG TẾ BÀO

EPC MCF7 MSC BÀI KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN VÀ TẠO DỊNG TẾ BÀO 10/9/17 TS Vũ Bích Ngọc vbngoc@hcmus.edu.vn + Mục tiêu !  Hiểu khái niệm –mục đích cấy chuyền tế bào số kỹ thuật có liên quan !  Nắm số phương pháp tạo dòng tế bào !  Biết số ứng dụng dòng tế bào lĩnh vực y sinh học TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + Nội dung Tạo dòng tế bào Nhắc lại Kỹ thuật cấy chuyền TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn Các ứng dụng 10/9/17 + THU NHẬN MẪU MƠ CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mơ quan tâm, cắt bỏ phần mô chết) Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi) Tách tế bào học (nghiền, ép) Ni mẫu mơ sơ cấp NI SƠ CẤP Thu nhận tế bào Cấy chuyền Thu mảnh DÒNG TẾ mơ thứ cấp BÀO TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn Tách tế bào enzym (ủ…) Trypsin lạnh Tái huyền phù Trypsin ấm Collagenase Ly tâm 10/9/17 + Nuôi sơ cấp Nuôi mô Thu nhận quan Cắt nhỏ Thành tế bào đơn Cấy chuyền Cấy chuyền TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn Nuôi sơ cấp Cell line 10/9/17 + TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 Tách rời tế bào + Tách tác nhân khác (EDTA, học) Trypsin Tách enzym Collagenase Papain Elastas Trypsin ấm Trypsin lạnh TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + Tách rời tế bào TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + Tách enzyme Trypsin: Chymotrypsin Collagenase •  pH6-9, tối ưu 8-9 •  Nồng độ dùng: 0,01%-0,5% •  Ca2+ xem chất bảo vệ Trypsin •  Bị kìm hãm FBS Di-IsopropylFluorophosphat(DF P) •  Khơng đặc hiệu cho loại protein: Cắt liên kết –COOH lysin/arginin – NH2 " gây hư hai cho tế bào •  pH 7-9, thích hợp 8-9 •  Cắt liên kết peptide tạo –COOH acid amin thơm với –NH2 •  Tính đặc hiệu trypsin •  Bị ức chế DFB •  •  Hoạt động •  pH •  Phân tốt: pH7-8, 4,5-8, huỷ < 450C elastin •  Cắt liên kết •  Bị kìm •  Sử dụng peptide hãm kết hợp dạng polybởi với L prolin; chất enzyme gồm loại oxy khác đặc trưng hoá tắt loại mơ chun biệt# làm hư hại tế bào TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn MỘT SỐ ENZYME PHÂN CẮT THƯỜNG DÙNG Papain Elastase 10/9/17 + Tế bào không bám dính Tế bào bám dính Cụm tế bào ni sơ cấp Sau nuôi sơ cấp, tế bào bám vào bề mặt đĩa nuôi Tế bào tách khỏi bề mặt đĩa nuôi, chuyển qua đĩa nuôi khác Huyền phù để tách rời cụm tế bào thành tế bào đơn Sau thời gian, tế bào tăng sinh, bao phủ đầy bề mặt đĩa nuôi Thêm enzym (trypsin, collagenase…) Sau cấy chuyền, tế bào tiếp tục tăng sinh TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn Puck Marcus (1955) Pha loãng mật độ tế bào, chuyển sang đĩa nuôi Tế bào đơn với mật độ thưa đĩa nuôi 10/9/17 + TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 Xây dựng đường cong tăng trưởng + -đo phát triển tế bào Xác định số lượng tế bào sau 24 " vẽ biểu đồ, xác định thời gian nhân đôi quần thể Thiết bị: máy đếm tế bào tự động, buồng đếm hồng cầu Buồng đếm hồng cầu Đường cong tăng trưởng TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn Máy đếm tế bào tự động 10/9/17 (Nucleocouter) Xây dựng đường cong tăng trưởng + -đo phát triển tế bào TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + In vivo Phân tích flowcytometry TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn In vitro: biệt hóa tế bào, nhuộm kiểm tra 10/9/17 + TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + !  dòng tế bào bị thối hóa: Clone ko phát triển mãi, biến đổi, đặc điểm mong muốn thay đổi !  tế bào khó sống " môi trường đặc biệt, bổ sung GF, đồng ni cấy !  Dòng tế bào có vòng đời (thời gian phân chia) giới hạn, sau vài lần cấy chuyền lão suy !  Đại thực bào tế bào thần kinh khơng phân chia in vitro > dùng ni sơ cấp TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + !  TBG thu nhận cấy ghép vào phần mô người, hỗ trợ phát triển quan TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn Cloning from adults 10/9/17 + !  Tiến hiểu biết ung thư !  Tiến sinh học tế bào !  Công nghệ máu cuống rốn, bệnh leukemia, thải loại cấy ghép… !  Công nghệ chuyển nhân tế bào sinh dưỡng (SCNT) !  Sản xuất tế bào đột biến !  Phát thuốc trình biến dưỡng TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17 + !  Cải tiến di truyền: tăng suất tạo sản phẩm sinh học !  Dòng tế bào ung thư: thử nghiệm chất kháng phân bào !  Dòng fibroblast: thử nghiệm tính gây kích thích mỹ phẩm TS Vũ Bích Ngọc - vbngoc@hcmus.edu.vn 10/9/17