BÀI GIẢNG KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN VÀ TẠO DÒNG TẾ BÀO

KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN VÀ TẠO DÒNG TẾ BÀO MSC MCF7 EPC... THU NHẬN MẪU MÔ CẮT NHỎ chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết NUÔI SƠ CẤP Cấy chuyền Tách tế bào bằng enzym ủ… Trypsin

BÀI 4 KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN VÀ TẠO DÒNG TẾ BÀO

MSC MCF7 EPC

Mục tiêu

thuật có liên quan

sinh học

Nội dung

Nhắc lại

Kỹ thuật cấy chuyền

Tạo dòng tế bào

Các ứng dụng

THU NHẬN MẪU MÔ

CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

NUÔI SƠ CẤP

Cấy chuyền

Tách tế bào bằng enzym (ủ…)

Trypsin lạnh Trypsin ấm

Ly tâm

Collagenase

Tái huyền phù

Thu nhận

cơ quan

Cell line Cấy chuyền

Cấy chuyền

Nuôi mô

Cắt nhỏ Thành

tế bào đơn

Nuôi sơ cấp

+

+ Tách rời tế bào

Tách bằng tác nhân khác (EDTA, cơ học)

Tách bằng enzym

Tách rời tế bào

•  Không đặc hiệu cho

loại protein: Cắt liên

•  Cắt liên kết peptide tạo bởi –COOH acid amin thơm với –NH2

•  Tính đặc hiệu kém hơn

trypsin

•  Bị ức chế bởi DFB

• 

•  Hoạt động tốt: pH7-8,

< 45 0 C

•  Cắt liên kết peptide dạng poly-

L prolin;

gồm 4 loại đặc trưng tắt từng loại mô chuyên biệt# ít làm hư hại

tế bào

•  pH 4,5-8,

5

•  Bị kìm hãm bởi chất oxy hoá

•  Phân huỷ elastin

•  Sử dụng kết hợp với

enzyme khác

Tế bào bám dính Tế bào không bám dính

Sau nuôi sơ cấp, tế

2 Pha loãng mật độ tế bào, chuyển sang các đĩa nuôi mới

3 Tế bào đơn với mật độ thưa

Cụm tế bào nuôi sơ cấp

+ Quy trình cấy chuyền tế bào bám dính

Thu môi trường cũ vào ống falcon vô trùng

Rửa tế bào 3 lần bằng PBS

Bổ sung trypsin/EDTA 0,25%, tráng đều bề mặt đĩa

nuôi

Ủ trong tủ ấm từ 2-5 phút

quan sát dưới kính hiển vi để đảm bảo các tế bào đã

co tròn và tách khỏi bề mặt đĩa nuôi

chuyển Flask và tủ thao tác, dùng pipette huyền phù

đều để đảm bảo tế bào tách thành tế bào đơn

+ Quy trình cấy chuyền tế bào bám dính (tt)

Hút toàn bộ huyền phù tế bào, chuyển vào ống falcon chứa

môi trường cũ

Ly tâm ống ở tốc độ 2500 RPM trong 5 phút

Loại bỏ dịch, thu cụm tế bào ở đáy ống falcon

Bổ sung môi tường mới với lượng gấp 3 lần môi trường cũ

huyền phù đều và chia đều cho 3 flask mới

Lưu ý

bào

tách (FBS, protease inhibitor)

TẠO DÒNG TẾ BÀO

KHÁI NIỆM- ĐẶC TÍNH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CONG TĂNG TRƯỞNG XÂY DỰNG ĐƯỜNG

VÀ ĐO SỰ PHÁT TRIỂN

+

+

Tăng sinh

+

!   Hữu hạn hay liên tục

!   Điều kiện và đặc tính tăng trưởng

+ Mô

Phân tách

Tế bào đơn Nuôi sơ cấp

Pha loãng tới hạn

Vòng nhẫn Tách tế bào tự động Clone phát triển

Douglas C McFarland

+

Nhuộm crystal violet

+

!   Sử dụng đĩa 96 giếng; 100 ul/giếng

!   Mật độ tế bào ban đầu: 200 - 4000 tế bào/

giếng gốc

!   Giảm dần mật độ tế bào trong mỗi giếng

!   Nên cấy chuyền sang đĩa 24 " 12 " 6 giếng (đĩa 35 mm) " flask 25 " flask 75

VÒNG NHẪN (Cloning ring-

cylinder)

+ VÒNG NHẪN (Cloning ring)

Phân lập Clones (Huyền phù)

+

+

Xây dựng đường cong tăng trưởng

-đo sự phát triển của tế bào

Máy đếm tế bào tự động

Buồng đếm hồng cầu

Đường cong tăng trưởng

Xác định số lượng tế bào sau mỗi 24 giờ " vẽ biểu

đồ, xác định thời gian nhân đôi quần thể

Thiết bị: máy đếm tế bào tự động, buồng đếm hồng

cầu

+ Xây dựng đường cong tăng trưởng

-đo sự phát triển của tế bào

+

In vivo

+

!   dòng tế bào bị thoái hóa: Clone ko phát triển mãi, có thể biến

đổi, đặc điểm mong muốn thay đổi

!   1 tế bào khó sống " môi trường đặc biệt, bổ sung GF, đồng

nuôi cấy

lần cấy chuyền sẽ lão suy

!   Đại thực bào và tế bào thần kinh không phân chia in vitro >

có thể dùng như nuôi sơ cấp

+

+

+

+ Cloning from adults

!   Tiến bộ trong hiểu biết về ung thư

!   Tiến bộ trong sinh học tế bào

ghép…

!   Sản xuất tế bào đột biến

+