Nghiên cứu ảnh hưởng của khí oxy và khí carbonic trong dung môi đến độ ổn đinh của thuốc tiêm chứa vitamin c 10%

Một đặc điểm của vitamin c là dễ bị oxy hóa, độ ổn định của dược chất trong các dạng bào chế còn thấp, đặc biệt khi ở dạng dung dịch.. Không khí là một yếu tố phổ biển đặc biệt là oxy, c

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO • • • BỘ Y T ế •

TRƯ Ờ NG Đ ẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • • • •

L Ờ I C Ả M Ơ N

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn TS

Nguyễn Thanh Hải dã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn ThS Nguyễn Văn Hân cùng toàn thể

các thầy cô, cắc kỹ thuật viên trong bộ môn Công nghiệp dược, bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội và toàn thế cán bộ nhân viên khoa môi trường thuộc viện Khoa Học Công Nghệ Quốc Gia Việt Nam đã giúp

đỡ, tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu và thực hiện luận vấn.

Vô cùng biết ơn sự quan tâm, khích lệ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi của cơ quan, gia đình và người thản trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 30 thảng 12 năm 2009

Học viên

Nguyên Thị Hậu

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

ĐẶT VẤN đ ề 1

CHƯƠNG 1: Tổ NG QUAN 2

1.1 Vitamin c 2

1.1.1 Công thức và Tính chất lý - hoá của Vitamin c 2

1.1.2 Tác dụng dược lý, công dụng, liều dùng, dạng bào c h ế 4

1.1.3 Các phương pháp định lượng vitamin c 5

1.2 Các khí hoà tan trong dung môi 7

1.2.1 Khí Oxy 8

1.2.2 Khí Carbonic (C 0 2) 11

1.3 Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc của dung dịch vitamin c 12

1.3.1 Sự hấp thụ ánh sáng 12

1.3.2 Màu sắc của dung dịch 13

1.4 Tổng quan một số công trình nghiên cứu 14

1.4.1 Khí oxy và glutathione 14

1.4.2 Khí carbonic và ascorbic acid 14

1.4.3 Ascorbic acid và độ ổn định của vitamin c trong dung dịch 14

CHƯƠNG 2: Đố I TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 17

2.1 Nguyên liệu - thiết bị 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp phân tích 18

2.2.2 Phương pháp loại khí oxy hoà tan trong nước 20

2.2.3 Phương pháp pha chế dung dịch thuốc tiêm vitamin c 10% 20

2.2.4 Phương pháp đánh giá độ ổn định 21

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 21

CHƯƠNG 3 Kế T QUẢ 23

3.1 Phương pháp định lượng vitamin c 233.2 Nghiên cứu xây dựng phương pháp đo quang để đánh giá màu sắc

3.3.1 Xác định nồng độ oxy hoà tan trong nước (DO) dưới tác động

3.3.2 Nghiên cửu ảnh hưởng của các biện pháp giảm nồng độ oxy hoà

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tác nhân kiềm hoá tới độ ổn định của

4.4 Nghiên cứu cải tiến, bào chế thuốc tiêm vitamin c 10% có độ ổn

Kế T LUẬN VÀ KIế N NGHỊ 52 Tài liệu tham khảo

Phụ Lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viêt tăt

STT Tên bảng Trang

1

Bảng 3.7: Nông độ và độ hâp thụ của mâu 2 tại các thời

Bảng 3.10: Độ hâp thụ của mâu 4 (lân 3) tại các thời

điểm lão hoá

31

13

Bảng 3.11: Độ hâp thụ của mâu 4 (lân 4) tại các thời

điểm lão hoá

31

14 Bảng 3.12: Nông độ oxy hoà tan trong các mâu 3315

Bảng 3.13: Nồng độ Vitamin c trong các mẫu sử dụng

dung môi đã loại khí oxy hoà tan

35

16

Bảng 3.14: Độ hâp thụ của các mâu vitamin c sử dụng

dung môi đã loại oxy hoà tan

36

17

Bảng 3.15: Kêt quả nghiên cứu các mâu dưới ảnh hưởng

18

Bảng 3.16: Kêt quả theo dõi độ ôn định của các CT pha

19 Bảng 3.17: Kêt quả theo dõi độ ôn định của vitamin c

20

Bảng 3.18: Kêt quả so sánh cảm quan vê màu săc của

mẫu thử với các mẫu thuốc trên thị trường sau khi để

trong điều kiện khắc nghiệt

44

Danh muc các hình vẽ, đô thi

Hình 3.2: Biêu đô so sánh giữa sự chênh lệch nông độ và

hoá

28

4

Hình 3.3: Biêu đô so sánh độ hâp thụ tại các điêm lão

hoá giữa các mẫu sử dụng dung môi đã loại khí oxy hoà

tan

37

5 Hình 3.4: Biêu đô so sánh độ hâp thụ của các mâu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vitamin c (acid ascorbic) cần thiết cho con người, thiếu vitamin c gây ra rất nhiều bệnh trong đó có bệnh Scorbus Vitamin c được sử dụng làm thuốc dưới nhiều dạng bào chế khác nhau như viên nén, viên sủi, viên ngậm, viên nang và dạng thuốc tiêm Một đặc điểm của vitamin c là dễ bị oxy hóa, độ ổn định của dược chất trong các dạng bào chế còn thấp, đặc biệt khi ở dạng dung dịch Trong quá trình bảo quản, vitamin c dễ bị oxy hoá do tác động của nhiều yếu tố khác nhau như: ánh sáng, vết kim loại nặng, oxy trong không khí, độ ẩm

Không khí là một yếu tố phổ biển (đặc biệt là oxy, carbonic, nitơ), có mặt trong dung dịch và trong ống tiêm, có khả năng ảnh hưởng đến độ ổn định của vitamin c trong dung dịch thuốc Oxy là nguyên tố hoá học hoạt động mạnh, tham gia vào tất

cả các quá trình oxy hoá - khử các chất Oxy có thể hoà tan trong nước khi bảo quản

ở điều kiện thường, và trở thành một loại tạp chất của nước cất, ảnh hưởng đến độ

ổn định các chất, đặc biệt là các chất dễ bị oxy hóa trong dung dịch Đã có nhiều công trình nghiên cửu trong và ngoài nước về độ ổn định của thuốc tiêm vitamin c [15, 23,43], các yếu tố được đánh giá như: chất chống oxy hoá; chất hiệp đồng chống oxy hoá; pH và chất điều chỉnh pH , nhưng chưa có các nghiên cứu về ảnh hưởng của các khí hoà tan trong dung môi Do vậy, để góp phần cải thiện độ ổn

định của vitamin c trong dung dịch, chúng tôi tiến hành đề tài:“Nghiên cứu ảnh

hưởng của khí oxy và khí carbonic trong dung môi đến độ ổn định của thuốc tiêm vitamin c 10% ”

Với các mục tiêu:

1 Đánh giá ảnh hưởng của khí oxy và khí carbonic trong dung môi đến độ ổn

2 Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng oxy hoà tan trong nước

3 Bào chế mẫu thuốc tiêm dung dịch vitamin c 10% có độ ổn định cao

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN

1.1 Vitamin c (Ascorbic acid)

1.1.1.1 Công thức

+ Công thức hoá học:

<j:H2ƠH HO— (TH

mùi Khi tiếp xúc với ánh sáng bị vàng dần Ở trạng thái khô, khá bền vững trong không khí; dạng dung dịch thì nhanh chóng phân huỷ khi có không khí, đặc biệt trong môi trường kiềm Dễ tan trong nước và ethanol; không tan trong cloroform, ether, benzen [2], [36],

hai dạng Ceton (II) và (III) [31]

endiol Nhóm này gây ra tính acid và tính khử của acid ascorbic

- Tính acid:

+ Dễ tan trong các dung dịch kiềm cũng như carbonat kim loại kiềm

+ Tác dụng với muối kim loại cho muối mới [2],

- Tính khử:

không khí thì acid ascorbic dễ dàng bị oxy hoá Các tác nhân xúc tác sự oxy hoá là

Việc oxy hoá xảy ra ở nhiều giai đoạn:

+ Giai đoạn đầu là sự oxy hoá thuận nghịch acid ascorbic thành acid dehydroascorbic, với sự tách hydro tạo ra các gốc ascocbyl trung gian [2], [34], [37]

Ị3H20H HO— CH

, 0

pH20H HO— CH

[37] Phương trình như sau:

nhau: phép đo iod, phép đo với thuốc thử 2,6 - DICP, phép đo bằng cực phổ sóng

1.1.2 Tác dụng dược lỷ, công dụng, liều dùng, dạng bào chế

1.1.2.2 Công dụng - cách dùng và liều dùng

a Công dụng:

- Phòng và điều trị do thiếu vitamin c

- Phối hợp với desferrioxamin để làm tăng thêm đào thải sắt trong điều trị bệnh thalassemia

- Methemoglobin huyết vô căn khi không có sẵn xanh methylen

- Tăng sức đề kháng cho cơ thể trong các bệnh nhiễm trùng, cảm cúm, sổ mũi, trẻ

em chậm lớn, phụ nữ có thai

phẩm và công nghệ thực phẩm [2], [9],

[34], [37], [42]

b, Cách dùng - Liều dừng-.

Thường uống vitamin c , khi không thể uống được hoặc nghi kém hấp thu, và chỉ trong những trường hợp rất đặc biệt, mới dùng đường tiêm Khi dùng đường tiêm, tốt nhất là nên tiêm bắp mặc dù thuổc có gây đau tại nơi tiêm

+ Dự phòng: 25 - 75 mg mỗi ngày (người lớn và trẻ em)

+ Điều trị: Người lớn: Liều 250 - 500 mg/ngày chia thành nhiều liều nhỏ

Trẻ em: 100 - 300 mg/ngày chia thành nhiều liều nhỏ

+ Phối hợp với desferrioxamin để tăng thêm đào thải sắt (do tăng tác dụng chelat - hoá của desferrioxamin) liều vitamin C: 100 - 200 mg/ngày

+ Methemoglobin - huyết khi không có sẵn xanh methylen: 300 - 600 mg/ngày chia thành liều nhỏ [2], [9]

1.1.2.3 Các dạng thuốc và hàm lượng của vitamin c

Viên nén: 50mg; lOOmg; 250mg; 500mg; lg

Viên nhai: lOOmg; 250 mg; 500mg; lg

Viên giải phóng kéo dài: 500mg;lg; l,5g

Viên sủi bọt: lg

Ống tiêm: 100mg/ml, 250mg/ml, 500mg/ml [2], [9]

1.1.3 Các phương pháp định lượng vitamin c

Có rất nhiều phương pháp định lượng vitamin c trong các chế phẩm thuốc:

1.1.3.1 Phương pháp hoá học

a, Phương pháp định lượng bằng iod [2], [3], [8], [39]

một giọt iod dư sẽ cho màu xanh với chỉ thị hồ tinh bột

b, Phương pháp định lượng bằng 2 ,6 - DCIP [25], [34].

* Nguyên lý: Thuốc thử này có màu xanh trong môi trường kiềm và trung tính, có

màu hồng trong môi trường acid Khi chuẩn độ thuốc thử 2,6 - DCIP dạng oxy hoá

có màu xanh sẽ tác dụng với acid ascorbic thành dạng khử không màu, ở điểm tương đương một giọt thừa thuốc thử 2,6 - DCIP sẽ cho màu hồng trong môi trường acid

a, Phưcmgpháp đo quang:

năng hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại

Vitamin c trong dung dịch HC1 0,0 IN sẽ hấp thụ tại bước sóng Ầmax — 244 nm với

E\% = 560 Vitamin c trong nước thì hấp thụ tại bước sóng Xmax = 265 với

£ £ = 5 8 0 [16], [22], [43]

b, Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

* Nguyên lý: Nhờ vào dung môi pha động được chạy qua cột tĩnh sẽ rửa giải

vitamin c khi bơm mẫu qua cột Dựa vào Detector u v , bước sóng 245nm vitamin

ST

Trong đó: CT là nồng độ của vitamin c trong mẫu thử

Cc là nồng độ của vitamin c trong mẫu chuẩn

Sc là diện tích pic trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn,

n là hệ số pha loãng

1.2 Các khí hoà tan trong nước.

Tất cả các khí trong khí quyển có thể tìm thấy trong nước do quá trình khuếch tán

và đối lưu qua lớp bề mặt nước tiếp xúc với không khí Trong điều kiện thường, độ tan của một chất khí trong một chất lỏng tuân theo định luật Henry:

m= Kp

T r o n g đ ó :

m: Khối lượng khí hoà tan trong một đơn vị thể tích chất lỏng,

p: áp suất riêng phần của khí trong khí quyển

Độ hoà tan của oxy phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất Ở 35°C: DO = 7mg/l Nồng

Bảng 1.2: Nồng độ bão hoà của oxy trong nước theo nhiệt độ [18], [30]

1.2.1.2 Cơ chế phân huỷ chất hữu cơ có sự tham gia của oxy trong các tác nhàn

a, Ảnh hưởng của độ âm:

Một số thuốc viên nén: Vitamin c , vitamin B I bị hỏng rất nhanh khi tiếp xúc với không khí ẩm.

thành, chúng tham gia vào các quá trình oxy hoá các dược chất theo cơ chế phản

b, Anh hưởng của ảnh sáng.

Tia tử ngoại hay ánh sáng nói chung đều là những dạng bức xạ Năng lượng bức xạ càng lớn, thì tác động phân huỷ các chất hữu cơ và nước càng cao

Việc xuất hiện các R , ROO lại khơi mào cho một loạt phản ứng gốc tự do, xảy ra

c, Anh hưởng của tạp chất kim loại chicyển tiếp.

Vai trò của các ion kim loại chuyển tiếp tạo ra gốc tự do của oxy, ở điều kiện thường cũng xảy ra như sau:

C u +1 + O ? — *■ O2 + C u +2

dạng oxy hoạt động khác có thể hình thành và phản ứng gốc tự do lan truyền có thể:

RH + ÒH — *■ H20 + R +° 2 >■ R O Ò - ► ■••• (l)

R + R -► R - R (2)

Khi phản ứng (2) xảy ra, thì quá trình dimer hoá có thể xuất hiện; tạo ra những sản

1.2.1.3 Các phương pháp định lượng oxy hoà tan

Có 2 phương pháp định lượng oxy hoà tan trong nước:

A Phương pháp Winkler (phưong pháp hoá học)

Phương pháp Winkler gồm 2 bước chính:

+ Bước 1: Thêm muối Mn2+ và kiềm + KI vào mẫu nước, oxy đơn chất hoà tan

trong nước được chuyển vào các kết tủa hydroxyd mangan lắng xuống đáy bình, vì vậy bước này gọi là bước cố định oxy hoà tan (tốt nhất là thực hiện bước này ngay tại hiện trường lấy mẫu):

2Mn(OH)2 + 1/2Ơ2 + H20 -> 2Mn(OH)3 >Lu

M n ( O H ) 2 + l / 2 0 2 - » M n O ( O H ) 2 I n â u

+ Bước 2: Xác định lượng oxy đã được cố định:

Dùng acid hoà tan các hydroxyd Mn4+; Mn3+ Trong môi trường acid, Mn4+; Mn3+

MnO(OH)2 + 4HC1 + 2 KI -> MnCl2 + I2 + 3H20 + 2KC1 (3)

tan trong nước [18], phản ứng chuẩn độ:

B Phương pháp điện thế (dùng máy đo oxy hoà tan).

Các điện cực màng nhạy oxy gồm 2 dạng:

* Kiểu pin điện (galvanic)

thấm oxy đóng vai trò catôt, còn điện cực anôt là chì (Pb) Cả 2 đều nằm trong dung

Trên anôt: 2Pb -*■ 2Pb2+ + 4e'Dòng điện sinh ra tỷ lệ thuận với lượng DO chui qua màng thẩm thấu oxy Vì vậy, nếu ta đo dòng điện, có thể biết được lượng DO trong dung dịch Khi đó cần dùng loại ampe kế có điện trở càng nhỏ càng tốt [14], [18], [30]

Tương tự như phương pháp điện pin, một điện cực giữ vai trò catôt vẫn làm từ Platin, vàng, bạc được đặt sát màng bán thấm oxy Điện cực đổi Ag làm anôt dưới dạng dày hoặc tấm, cả hai nằm trong dung dịch KC1 Khi áp điện thế thích hợp vào

Là chất khí không màu, có mùi, vị hơi chua, nặng hơn không khí Khí carbonic dễ

carbonic là một thành phần quan trọng của khí quyển

Sự phân ly của H2CO3 tuỳ thuộc vào pH của nước Nước cất có pH dao động trong

I.2.2.2 Vai trò và sự ảnh hưởng của khí carbonic trong nước.

Hệ carbon dioxid - carbonat là một trong những hệ phức tạp nhất và quan trọng nhất của nước vì:

- Hệ duy trì pH hằng định của nước, liên quan đến nhiều cân bằng khác

- Các ion của hệ đóng vai trò phối tử của phức kim loại

- Liên quan đến vòng sinh học của cơ thể sống dùng carbon để sinh trưởng

tủa một số dược chất Ví dụ các barbiturat, các sulphonamid là các acid yếu rất ít tan trong nước, nên thường dùng ở dạng muối natri hoà tan tốt trong nước, nhưng

xảy ra trong dung dịch do dạng muối bị chuyển thành dạng acid tự do rất ít tan

1.3 Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc của dung dịch

1.3.1 Sự hấp thụ ánh sảng

Theo thuyết lượng tử, mỗi hạt sơ cấp (nguyên tử, ion, phân tử) có một hệ thống duy nhất các trạng thái năng lượng Trạng thái năng lượng thấp nhất gọi là trạng thái cơ bản Ở nhiệt độ phòng, hầu hết các hạt sơ cấp đều ở trạng thái cơ bản Các hạt sơ cấp chỉ có thể hấp thụ những photon ánh sáng mang năng lượng đúng bằng hiệu của mức năng lượng cơ bản và một trạng thái năng lượng cao hơn, khi đó hạt sẽ chuyển sang trạng thái năng lượng cao hơn gọi là trạng thái năng lượng kích thích

M + hv -» M*

Sau thời gian ngắn (10'6 - 10'8s) tiều phân ở trạng thái kích thích sẽ chuyển về trạngthái cơ bản bằng sự phục hồi không bức xạ hoặc phục hồi có bức xạ Đặc tính hấpthụ của chất được mô tả bởi phổ hấp thụ của chất đó [5].

Màu sắc ánh sáng được chia thành 3 vùng:

1.3.2 Màu sắc của dung dịch

Ánh sáng nhìn thấy sở dĩ được gọi là ánh sáng trắng do có sự phụ nhau đôi một của các bước sóng Một vật mang màu nào thì màu phụ của nó đã bị vật hấp thụ Ví dụ: một vật mang màu lam thì hấp thụ mạnh các tia màu vàng và ngược lại một vật mang màu vàng hấp thụ mạnh các tia màu lam Hai màu vàng - lam hình thành một cặp phụ nhau hay cặp bổ sung nhau [5]

1.4 Tổng quan một số công trình nghiên cứu về khí oxy, khí carbonic và vitamin c

1.4.1 K hí oxy và glutathione

với độ ổn định của dung dịch glutathione Tác giả đã nghiên cứu các mẫu pha chế

1.4.2 K hí carbonic và ascorbic acid

định trên thuốc vitamin c nhưng đã nghiên cứu gián tiếp ảnh hưởng đến hàm lượng ascorbic acid và dehydroascorbic acid trong thời gian bảo quản của hoa quả [32] Tác giả cho thấy, khi bảo quản trong không khí có kiểm soát thì hàm lượng vitamin

vitamin c và hỗn hợp giảm nhanh

1.4.3 Ascorbic acid và độ ổn định của vitamin c trong dung dịch

Trong nước:

dụng phối hợp các chất chống oxy hóa, pH và chất điều chỉnh pH [15], [23]

s Vũ Thị Yến (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng và điều chỉnh tỉ lệ chất chổng

0,05%) và chất điều chỉnh pH (NaOH: 1,27%) để làm tăng độ ổn định của

s Nguyễn Thị Thu Hường (2009) đã sử dụng hai chất (tá dược A và tá dược B)

theo tỉ lệ nhất định, đồng thời dùng dung môi đồng tan với nước (propylen glycol) và chất chổng oxy hoá (Rongalit) để làm tăng độ ổn định của thuốc tiêm vitamin c

quan giữa độ ổn định và sự thay đổi màu sắc của acid ascorbic [17]

Nước ngoài:

c 25% Tác giả đã khảo sát tổc độ phân hủy hóa học và biển màu của dd vitamin c 25% ở nhiệt độ từ 60° đến 90°c và pH thay đổi tò 0,4 đến 12,7 đồng thời so sánh sự

NaOH, trong thành phần dd có dùng L-cystein hydroclorid Kết quả nghiên cứu cho

nhanh hơn dd thuốc tiêm dùng NaOH Tác giả kết luận độ ổn định của dd vitamin c 25% được cải thiện đáng kể nếu dùng NaOH điều chỉnh pH; dd thuốc tiêm pH 8,0

ổn định hơn pH 6,4; nước cất cần được đun sôi để đuổi khí hòa tan trước khi pha chế; sục khí nitơ trong quá trình đóng ống thay vì dùng khí cacbonic; các ống sau khi đóng được tiệt khuẩn ở nhiệt độ 110 c trong 15 phút [44]

tripeptid trong phân tử có nhóm sulfhydryl) đến độ ổn định của acid ascorbic Khảo sát các mẫu có chứa cùng nồng độ acid ascorbic nhưng nồng độ glutathion khác nhau, tác giả nhận thấy: khi nồng độ glutathion tăng lên, tỷ lệ phân hủy acid ascorbic giảm [29]

đến độ ổn định về độ trong và màu sắc của dung dịch vitamin c [24] Kết quả cho thấy khi có mặt của các chất tạo ngọt: Sucrose; sorbitol; mannitol độ ổn định về

độ trong và màu sắc của dung dịch vitamin c được tăng lên nhưng khi , đồng thời tác giả còn cho thấy khi có mặt thêm chất peroxide thì tốc độ phân huỷ về màu sắc tăng nhanh do tạo ra một chuỗi các phản ứng gốc tự do:

HO + H20 2 — > H 20 + H 0 2

H 0 2 + H 20 2 - * H 2G + 0 2 + OH

2HQ2 - > H ,0 2 + 0 2

AH 2 + H 0 2 -* A ”

với các màu thực phẩm: E 123 (Amaranth); E 142 (Green S); E 104 (Quinoline

tác giả cũng chứng minh về tác dụng của manitol khi cho thêm vào công thức pha

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Nguyên liệu - thiết bị

2.1.1 Nguyên phụ liệu

2.1.2 Trang thiết bị - máy móc

1 Cân phân tích TE 214S: Đức

2 Máy đo quang ư - 1900 ƯV- Vis: Nhật

3 Máy đo oxy hoà tan YSI - model 52: Mỹ

4 Máy đo pH: Thụy sĩ

5 Máy HPLC Shimadzu: Nhật

7 Máy cất nước 1 lần: Việt Nam.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân tích

2.2.1.1 Phương pháp định lượng để xác định nồng độ vitamin c trong mẫu

Có rất nhiều phương pháp xác định nồng độ vitamin c trong mẫu (mục 1.1.3), trong

đó phương pháp đo iod được sử dụng trong DĐ Anh, DĐVN III và phương pháp HPLC có độ chính xác cao đã được sử dụng trong USP 30, [43]

+ Dung dịch chuẩn độ kali iodat 0,1N: Cân chính xác 3,5670 chất chuẩn gổc kali iodat

* Chuẩn bị mẫu thử: Hút chính xác 2ml (tương đương với khoảng 200mg vitamin C) dung dịch vitamin c 10% cần định lượng cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm tiếp vào bình nón lần lượt 0,25ml dung dịch formaldehyd 1% (TT), 4 ml dung dịch HC1 2% (TT ), 0,5 ml dung dịch KI 10%(TT) và 2ml chỉ thị hồ tinh bột, lắc đều Chuẩn độ bằng dung dịch kali iodat 0,1N đến màu xanh lam nhạt bền vững thu được thể tích V[ 1 ml dung dịch kali iodat 0,1 N (CĐ) tương đương với 8,806 mg CóHgOó

x% = Fl'8,8Q6,/?.100%

200

trong một thể tích nước cất, thêm nước cất vừa đủ 2000ml, đo pH và điều chỉnh

bằng acid phosphoric nếu cần thiết về pH 2,5 ± 0,05; Cột CỈ 8: 150 X 46 X 5; Thể

tích bơm: 20 ịil; Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút; Detecter u v tại bước sóng 245 nm

* Chuẩn bị mẫu thử: Hút 2ml dung dịch vitamin c 10% vào bình định mức 100 ml, điều chỉnh bằng pha động vừa đủ thể tích (ddTl) Hút 5ml ddTl vào bình định mức 100ml, điều chỉnh bằng pha động vừa đủ thể tích (ddT2) Lọc ddT2 qua giấy lọc 0,45|im, rồi đem tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký HPLC

2.2.1.2 Phương pháp đo quang để xác định sự thay đổi màu sắc của dung dịch vitamin c

+ Phương pháp 1 (ppl): Mầu thuốc tiêm vitamin C10% được lọc, rồi đem đo độ hấp thụ tại bước sóng 420 nm

+ Phương pháp 2 (pp2): Pha loãng một thể tích chế phẩm ( lấy chính xác) với nước

để thu được dung dịch có nồng độ 50 mg acid ascorbic/ ml Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 420 nm (DĐVN III)

2.2.1.3 Phương pháp xác định oxy hoà tan trong nước

Dùng máy đo YSI Model 52 với đầu dò YSI là một sensor phân tích DO dựa trên phương pháp màng Một màng mỏng được bao quanh một điện cực phân cánh điện

Dòng điện này sẽ được thiết bị thu nhận và chuyển thành số liệu DO (mg/1) dựa trên phần mềm cài đặt trong máy

2.2.2 Phương pháp loại khí oxy hoà tan trong nước

2.2.2.1 Phương pháp sục khí vào nước cất pha tiêm.

lượt vào các bình với tốc độ sao cho nước không trào ra ngoài (tương ứng với ápsuất từ 0,2 - 0,3 kg/cm3) Đậy nắp bình rồi đem đo

2.2.2.2 Phương pháp nhiệt

Cho khoảng 500 ml nước cất pha tiêm vào các bình nút mài 500 ml cấp nhiệt để nước trong bình sôi trong khoảng 15 phút Đậy nắp bình, để nguội đến nhiệt độ phòng, đem đo

2.2.3 Phương pháp pha chế dung dịch thuốc tiêm vitamin c 10%.

Hình 2.1 Sơ đồ pha chế dung dịch thuốc tiêm Vitamin c 10%

2.2.4 Phương pháp đánh giá độ ổn định

* Các mẫu thuốc tiêm sau khi pha chế được bảo quản ở các điều kiện:

- Điều kiện phòng thí nghiệm: Định kỳ 92 ngày đánh giá độ ổn định của mẫu

- Điều kiện tủ vi khí hậu: nhiệt độ 40 c ± 2, độ ẩm tương đối 75% ± 5, tránh ánh sáng (2) Định kỳ sau 46 ngày đánh giá độ ổn định của các mẫu

- Điều kiện khắc nghiệt (luộc mẫu hoặc đặt mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ cao trong các khoảng thời gian nhất định)

* Đánh giá chất lượng các mẫu dựa trên các chỉ tiêu sau:

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu thống kê

xếp các dữ liệu theo thứ tự tăng dần hoặc giảm dần Đánh số thứ tự các dữ liệu từ 1

đ ể n n : X 1,X 2,X 3, , x n V ớ i X i l à t r ị s ố n g h i n g ờ ( l ớ n n h ấ t h o ặ c n h ỏ n h ấ t ) , x 2 l à t r ị

số liền kề Để xác định xem có cần loại bỏ giá trị Xi không, dùng tiêu chuẩn Q:

So sánh trị số Qtn (Q thực nghiệm) với trị số Q tới hạn (tra bảng) với độ tin cậy đã

N

— -\ N - ỉ

So sánh hai giả trị trung bình (Test í).

+ Trước hết ta so sánh độ chính xác của hai phương pháp (Test F)

2

So sánh Ftn với giá trị F (bảng) ứng với độ tin cậy p = 95% và các bậc tự do ki=N pl

* Nếu Fto < F: hai phương pháp có độ chính xác khác nhau không có ý nghĩa thống kê

Sd được tính theo công thức:

< 8 thì hai kết quả trung bình khác nhau không có ý nghĩa thống kê

JCj —x2 > e thì hai kết quả trung bình khác nhau có ý nghĩa thống kê

* Nếu F ta> F : hai phương pháp có độ chính xác khác nhau có ý nghĩa thống kê Trong trường hợp này hãy tính:

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ3.1 Phương pháp định lượng vitamin c

3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC

L9 nên chúng tôi thay cột L9 bằng cột C18 và thẩm định lại phương pháp qua độ tuyến tính; độ lặp lại và độ thu hồi Cụ thể như sau:

- Mầu chuẩn: Lấy ổng chuẩn tại viện kiểm nghiệm với SKS: 0100031; Hàm lượng 99,62%; khối lượng 200 mg/ống

Pha ống chuẩn vào bình định mức 100ml, điều chỉnh bằng pha động vừa đủ thể tích (ddC) Từ ddC, pha một dãy vitamin c chuẩn với các nồng độ 40; 80; 100; 120; 140; 200 |ig/ml

a, Độ lặp lại: Xác định độ chính xác bằng cách thực hiện trên 6 lần đo dung dịch chuẩn Vitamin c ở nồng độ 100|ig/ml Kết quả thể hiện trong bảng 3.1

nồng độ 4 0 - 140 |!g/ml Kết quả được thể hiện qua bảng 3.2 và hình 3.1

c, Độ thu hồi: Khảo sát độ đúng trên mẫu thử 100 fig/ml, mẫu chuẩn cho vào với tỉ

lệ 80%; 100%; 120% so với lượng mẫu thử Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3: Kết quả thẩm định độ đúng phương pháp HPLC

Lần đo Chuẩn cho

thêm (%)

Diện tích pic mẫu thử

Diện tích pic mẫu chuẩn

Diện tích pic sau khi thêm chuẩn

Tỷ lệ thu hồi (%) 1

Nhận xét: Kết quả cho thấy phương pháp định lượng vitamin c bằng HPLC với

HPLC bàng cột C18

3.1.2 So sánh phương pháp HPLC và phương pháp đo iod

* Công thức pha chế: (công thức trong D Đ V N I - CT1):

Mẩu 1 được pha theo CT1, qui trình pha chế theo hình 2.1, mẫu được đóng vào lọ

bảng 3.4 và bảng 3.5

Bảng 3.4: Nồng độ thuốc tiêm vitamin c 10% theo phương pháp đo iod.

Thòi gian lão hoá t = 0 giờ t = 2 giờ t = 4 giờ t = 6 giờ