Nghiên cứu loài stephania dielsina y c wu thu hái ở hà tây

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI N G U Y ỄN Q U Ố C HUY NGHIÊN CỨU LOÀI STEPHANIẠ DIELSIANA Y.C.WU THU HÁI ỏ HÀ TÂY chuyẽn ngành: Dược liệu • DƯỢC học cổ truyền M ã sõ : 03.02.03 LtlỘN VĂN TH C Sĩ DƯỢC HỌC KHQỔ (1999 - 2001) G iáo viên hư ng dẫn : GS.TS Phạm Thanh Kỳ PGS.TS Bùi Kim Liên N i thự• c h iện • ' ^ : BỘ• MƠN DƯỢC • LIỆU TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ NỘI HÀ NỘI -2 0 Ẩ !ế& e ih ti d ể t Trong trình nghiên cứu đề tài nhận quan tâm hướng dẫn tận tình thầy - Để bày tỏ lòng biết ơn tơi xin chân thành cảm ơn GS TS Phạm Thanh Kỳ PGS TS Bùi Kim Liên Là người thầy hết lòng giúp đỡ hướng dẫn tơi hồn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn: GS Vũ Văn Chuyên, cử nhân Nguyễn Chiều, TS Nguyễn Tiến Vững việc xác định tên khoa học nghiên cứu PGS.TSKH Trần Công Khánh, Th.s Trần Văn n giúp đỡ nhiều phần phân loại thực vật phần nhân giống TS Nguyễn Viết Thân giúp chụp ảnh màu vi phẫu Th.s Thái Nguyễn Hùng Thu giúp phần ứng dụng máy vi tính vào định ỉượng L - tetrahydropalmatin TS Đỗ Ngọc Thanh giúp đo độ ẩm dược liệu PGS.TS Chu Đình Kính, Th.s Đỗ Qun giúp tơi việc đo phổ xác định cấu trúc Tôi xin chân thành cảm ơn: PGS TS Phạm Quang Tùng Phòng Sau Đại học Các thầy mơn Dược liệu, mơn Thực vật, cán Phòng Đào tạo sau Đại học mơn Phòng ban khác trường Đại học Dược Hà Nội Phòng Dược lý, Viện Kiểm nghiệm; Phòng Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu Đã dành điều kiện để hoàn thành đề tài Xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Quốc H uy MỤC LỤC ĐẶT VẤN Đ Ể Phần TỔNG Q U A N 1.1 Đặc điểm thực vật phân bố chi Stephania Lour .2 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Stephania Lour 1.1.2 Phân bố chi Stephania Lour 1.1.3 Số lượng loài thuộc chi Stephania L our 1.1.4 Các nghiên cứu loài Stephania dielsiana Y.C.Wu Việt n a m 1.2 Thành phần hoá h ọc 1.2.1 Thành phần hoá học loài thuộc chi Stephania nghiên cứu giới 1.2.2 Thành phần hố học số lồi thuộc chi Stephania nghiên cứu Việt n am 1.3 Tác dụng sinh học, công dụng dạng d ù n g 10 1.3.1 Tác dụng công dụng alcaloiđ chiết xuất từ loài thuộc chi Stephania Lour .10 1.3.1.1 L-tetrahydropalmatin 11 1.3.1.2 Cepharanthin 13 1.3.1.3 Palmatin 14 1.3.1.4 Roemerin 15 1.3.2 Tác dụng công dụng dược liệu Bình v i 15 1.4 Thăm dò khả nhân giốn g 16 1.4.1 Nhân giống phương pháp giâm hom 16 1.4.2 Nhân giống phương pháp gieo h t 16 Phần NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG NGHIÊN c ú u 17 17 2.1 Nguyên liệu nghiên u 2.2 Phương tiện nghiên u .17 2.2.1 Động vật thí nghiệm 17 2.2.2 Máy, thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 Phần THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Kết nghiên cứu thực vật 20 3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật 20 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 22 3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu th â n 22 3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu cuống 22 3.1.2.3 Đặc điểm vi phẫu l 23 3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 26 3.2 Kết nghiên cứu thành phần hoá h ọ c 27 3.2.1 Định tính nhóm chất phản ứng hoá học 27 3.2.1.1 Định tính alcaloid 27 3.2.1.2 Đmh tính flavonoid 27 3.2.1.3 Định tính coumarin 28 3.2.1.4 Định tính antranoid 28 3.2.1.5 Định tính glycosid tim 29 3.2.1.6 Định tính saponin 29 3.2.1.7 Định tính tanin 30 3.2.1.8 Định tính tinh bột 30 3.2.1.9 Định tính đường khử tự d o 30 3.2.2 Định tính alcaloid sắc ký lớp m ỏng .32 3.2.3 Định lượng alcaloiđ toàn phần trongdược liệu .33 3.2.4 Định lượng L-tetrahydropalmatin dược liệu 34 3.2.5 Chiết xuất phân lập alcaloid dược liệu 37 3.2.5.1 Chiết xuất alcaloiđ toàn phần 37 3.2.5.2 Phân lập alcaloiđ .38 3.2.5.3 Kiểm tra độ tinh khiết SKLM 38 3.2.6 Nhận dạng alcaloid V V 38 3.2.6.1 Nhận dạng alcaloid V ị 39 3.2.6.2 Nhận dạng alcaloid V 40 3.3 Kết thử độc tính sô tác dụng sinh h ọc 44 3.3.1 Thử độc tính cấp 44 3.3.2 Thử độc tính bán c ấ p 45 3.3.3 Nghiên cứu tác dụng giảm đaucủa dịch chiết dược liệu 48 3.3.4 Thử tác dụng an thần dược liệu .49 3.3.4.1 Theo dõi hoạt động tự nhiên chuột nhắt sau dùng dịch chiết dược liệu 49 3.3.4.2 Thử tác dụng tăng cường thời gian ngủ dịch chiết dược liệ u 51 3.4 Kết khảo sát khả nhân giống 52 3.4.1 Nhân giống phương pháp giâm hom 52 3.4.2 Nhân giống phương pháp gieo h t 53 Phần BÀN LUẬN VỂ KÊT QUẢ.7 .5 4.1 Về mặt thực vật 56 4.2 Về mặt hoá h ọ c 56 4.3 Về mặt tác dụng sinh h ọ c 57 4.4 Khảo sát nhân giống phương pháp giâm hom gieo hạt 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ .! 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHU LUC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU a : acid 13c - NMR : Carbon (13) Nuclear magnetic resonance DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer dd : Dung dịch dl :Dược liệu *H - NMR : Proton nuclear magnetic resonance IR : Infrared KHTN : Khoa học tự nhiên NMR : Nuclear magnetic resonance MS : Mass Spectrum ppm : Parts per million SKLM : Sắc ký lớp mỏng TT : Thuốc thử uv : Ultraviolet ĐẶT VẤN ĐỂ Việt nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới đa dạng địa hình tài nguyên thuốc phong phú Trong thuốc Việt nam lồi thuộc chi Stephania Lour, phong phú Chi Stephania chi lớn phức tạp nghiên cứu nhiều giới Việt nam Tuy nhiên nhiều lồi chưa nghiên cứu kỹ đầy đủ Hơn nữa, có khuyến cáo việc sử dụng nhóm thuốc diazepam có tác dụng gây nghiện số tác dụng không mong muốn, nên việc nghiên cứu dược liệu có tác dụng an thần trở nên có ý nghĩa Trong luận án Tiến sĩ Nguyễn Tiến Vững trình bày kết nghiên cứu lồi Stephania glabra (Roxb.) Miers thu hái Ninh bình, Stephania kuinanensis H.S.Lo et M.Yang thu hái Lạng sơn, loài Stephania sp, thu hái Quảng ninh Gần chúng tơi thu hái lồi thuộc chi Stephania Lour, Ba - Hà tây Qua tham khảo chưa thấy có tài liệu Việt nam cơng bố thành phần hố học, luận văn chúng tơi tiến hành nghiên cứu lồi Stephania dielsiana Y.C.Wu thu hái Hà tây nhằm tạo sở khoa học cho việc khai thác sử dụng có hiệu với nội dung sau : *về thực vật: -Mô tả đặc điểm thực vật, kiểm định tên khoa học nghiên cứu -Xác định đặc điểm vi phẫu đặc điểm bột dược liệu *v ề thành phần hố học: -Định tính nhóm chất dược liệu -Định lượng alcaloid toàn phần L-tetrahydropalmatin -Chiết xuất phân lập alcaloid -Nhận dạng alcaloid phân lập * Vê tác dụng sinh học: -Thử độc tính cấp bán cấp -Thử tác dụng an thần giảm đau Ngồi sơ thăm dò khả nhân giống dược liệu nghiên cứu Phần TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THựC VẬT VÀ PHÂN B ố CỦA CHI STEPHANIA LOUR 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Stephania Lour Các thuộc chi Stephania Lour, hầu hết dây leo mảnh khảnh, thân gỗ hay thân cỏ, rễ thành củ, với cuống thường gấp khúc gốc, phiến hình lọng thường hình trứng hay gần hình tròn, - 13 gân hình chân vịt Cụm hoa kẽ hay mọc thân già không lá, thường cấu tạo xim dạng tán có cuống, đcm độc hay xếp theo kiểu chùm, nhánh tán cấp , nhánh cuối không đều, xim tụ họp thành đầu hình đĩa Hoa đực - đài rời nhau, xếp thành vòng hay khơng nhau, có - đài lồi s.capitata, đài nhiều hình trái xoan ngược, cánh hoa rời nhau, hay 4, hình trứng ngược, mép bên nhiều gập vào Nhị hợp thành trụ, bao phấn - ô nứt ngang Hoa đối xứng, - đài, - cánh hoa, nỗn vòi ngắn khơng có, núm nhuỵ chia thuỳ ngắn rách, chồi Quả hạch hình trứng ngược với vết sẹo núm gần gốc, nhẵn; vỏ phía lưng mang dải hình móng ngựa gồm dãy dọc bướu hay gờ ngang Hạt hình móng ngựa Giá nỗn có lỗ thủng khơng Cây mầm có mầm nhiều rễ mầm, bao quanh nội nhũ [2], [37], [42], [43] 1.1.2 Phân bô chi Stephania Lour * Trên giới Chi Stephania Lour, phân bố vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới Châu Úc, Châu Á: Indonesia, Myanma, Malaysia, Thailan, Lào, Campuchia, Việt nam, Philippin, Ân Độ, Bangladesh, Srilanca, Trung Quốc, Đài Loan, Papua New Guinea, Nhật Bản, Australia Châu Phi: Nigeria, Ethiopia [36], [35] *ở Việt nam Các loài thường mọc hoang số vùng núi đá vôi, núi đất, núi đất lẫn đá, đồng bằng, ven biển, có lồi mọc bãi cát gò cát hoang vùng ven biển [16] Phân bố địa phương riước : + Miền Bắc : Lao cai, n bái, Hà tây, Hồ bình, Quảng ninh, Cao bằng, Lạng sơn, Hà giang, Ninh bình, Hải phòng, Tuyên quang, Thái nguyên, Phú thọ, Hà nội, Nam định + Miền trung : Thanh hoá, Nghệ an, Lâm đồng, Đắc lắc, Ninh thuận, Quảng nam, Đà nẵng, Thừa thiên Huế, Bình định, Phú yên + Miền nam : An giang, Đồng nai, Sông bé, Bà rịa - Vũng tàu 1.1.3 Số lượng loài thuộc chi Stephania Lour * v ề số lượng loài thuộc chi Stephania Lour giới tài liệu nêu có khác nhau: - Theo Flora o f Malesiana nêu có khoảng 35 lồi [37] - Theo A Dictionary of the Flowering Plant and Ferns nêu có khoảng 40 lồi [36], [43] - Theo Flora of Thailand nêu có khoảng 45 lồi [38] - Nguyễn Tiến Vững tổng kết có 107 tên lồi tác giả giới nhắc đến [35] *Danh mục loài thuộc chi Stephania Lour, công bố Đông Dương -Theo Gagnepain mô tả lồi [40] -Theo Humbert cơng bố năm 1938 Đơng Dương có 10 lồi [39] -Theo Nguyễn Tiến Bân có lồi [3] - Theo Võ Văn Chi có lồi [9] -Theo Nguyễn Chiều có 11 lồi [11] -Theo Phạm Hồng Hộ có lồi [14] -Theo Trần Cơng Khánh có lồi [19] -Theo Sách đỏ Việt nam nêu loài [25] Theo Nguyễn Chiều, Ngơ Văn Trại mơ tả 11 lồi Stephania có Việt nam [10], [11]: STT Loài Tên Viêt nam S brachyandra Diels Bình vơi s cambodica Gagnep Bình vơi s cepharantha Hay Bình vơi S dielsiana Y.C.Wu Củ dòm S excentrica H.S.L s hainanensis H.S.Lo Bình vơi s.hemandifolia (Willd.) Walp Dây mối S kwangsiensis H.S.Lo Bình vơi Quảng tây S longa Lour Dây lõi tiền dễ dài S pierrei Diels Bình vơi trắng 11 S sinica Diels Bình vơi tán ngắn Theo Nguyễn Tiến Vững công bố thêm lồi có Việt nam [30], [31]: - Stephania glabra (Roxb.) Miers (mọc Ninh bình) - Stephania kuinanensis (mọc Lạng sơn) 1.1.4 Các nghiên cứu loài Stephania dielsiana Y.C.Wu Việt nam - Theo Nguyễn Chiều mơ tả lồi sau [11]: Tên Việt nam : Củ dòm Rễ củ to, cụm hoa có màu tím, cụm hoa đực xim tán kép, cụm hoa dạng đầu Hoa đực đài, cánh hoa Hoa đài, cánh hoa - Theo Võ Văn Chi mơ tả [9] : Cây thảo leo, có củ thn dài củ Bình vơi, mọc nổi, ngang mặt đất, hình giống tư gà mái ấp trứng, củ cắt ngang có màu vàng rõ hơn, xơ hơn, có vị đắng tê so với củ Bình vơi Phiến hình khiên, nửa cuống phía dính vào phiến gân mặt sau có màu tím hay tím hồng Bộ phận dùng : Củ (Radix Stephaniae dielsianae) Nơi sống thu h i: Củ dòm sống vùng núi đá lẫn rừng núi đất, nơi có nhiều đá lộ đầu, thuộc tỉnh Lào cai, Yên bái, Hà tây, Hà bắc, Quảng ninh Còn phân bố Trung quốc -Ở Sách đỏ Việt nam mô tả loài Stephania dielsiana Y.C.Wu sau [25]: Cây thảo, sống nhiều năm, rễ củ to, nói chung dạng cầu, kích thước thay đổi nhiều Thân nhỏ, mọc leo, dài khoảng 3m Thân già màu nâu bạc, thân non màu tím nhạt Thân, lá, cụm hoa không lông Lá đơn nguyên mọc cách cuống dài 4,5 - 8,5 cm, cuống đính hình khiên; phiến hình tam giác tròn, dài - 13,2 cm, rộng - 13,5 cm, mép gợn sóng có tù, thưa phía lá, chóp nhọn, gốc lõm; gân xếp dạng chân vịt, xuất phát từ nhỗ đính cuống Ngọn non, cuống non cụm hoa chứa dịch màu tím hồng Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực - xim tán hợp thành xim tán kép; hoa nhỏ, cuống ngắn; có đài xếp vòng màu tím; cánh hoa hình quạt tròn, màu hồng cam, cong vào phía trong; cột nhị ngắn; bao phấn dính thành đĩa Cụm hoa gồm - đầu nhỏ, cuống cực ngắn xếp dày thành dạng đầu; hoa nhỏ, cuống ngắn; hoa có đài màu tím, cánh hoa màu hồng cam, hình quạt tròn cong, có chấm vân tím; đầu nhuỵ - thuỳ dạng giùi Quả hình trứng đảo, dẹt bên dài 0,8 - 0,9cm rộng 0,7 - 0,75 cm Hạt hình trứng ngược, cụt đầu, có lỗ thủng Trên lưng có hàng gai cong, nhọn 1.2 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC Thành phần hoá học chi Stephania Lour, nghiên cứu nhiều chi đa dạng loài, gồm có : Alcaloid, tinh bột, đường khử, acid malic, men oxydaza Trong alcaloid thành phần quan tâm nghiên cứu nhiều PHỤ LỤC Alcaloid Vj Phổ u v Phổ IR PHỔ TỬNG O ẠI ALCALOID Vj n ni 380 290 28 27 260 25 240 fib: TITLE; ụ ì s c HN s p E E ' , tì HHDp Rs5 ỉ 0 n m HŨ _ 28 ỹ •n / í / ' H s £ » MED IuM n mM ĩI n PERK n i3 Mb o ri L riiB ,3982 f ib s ,8 Ị? ,0 >ỹ - p a r a m e t e r s o f s p e c t r u m — 2001/12/14 14:51:24 — MEASURING MODE XT RESOLUTION 4.0 cm-1 ACCUMULATION 12 AMP GAIN AUTO DETECTOR DETECTOR i (2.8 mm/sec) APODIZATION HAPP-'iENZEL REMARKS VI ANALYST hu0 n g PHỔ HỐNG NGOẠI ALCALOID V! PHỤ■ LỤC ■ Alcaloid V Phổ v Phổ MS Phổ ‘H-NMR Phổ 13 C-NMR Phổ DEPT90, 135 PHỔ TỬNG O ẠI ALCALOID V Tlễ: Uĩ HUV DH DUŨC ỉ 27 NO , ,8 ? l RESpũN:•} sri spEED ỉ 12 tì , ỹ nra(HI n ■ N0 p3sSí 0 n PEAK _ n nM ũ ỉe =322 ỡ 3 í I) Phong Cau true, vi.cn lloc'j h u e 25 Oct 101 2:03 pm using AcqMeUiođ N-1.VLP ' 5989B MS Mau vt Solvent: CHC13 PHỔ KHỐI ALCALOĨD V, Abundance Scan 241 (9.045 min): N-DIP536.D 700 600 500 400 69 8ÍS5 300 r, I ( '1 I 110 200 99 125 178 137 192 234 247 100 m/z > - T1 60 r I '■> •f • Ỵ -T T 80 100 120 14 160 180 200 : I ; • — r 220 V 240 260 280 300 Scan 241 (9.045 m i n ) : N -D IP 536.D Mau v t abund m/ z m /z abund 151 67 82 254 345 82 95 68 15 102 347 352 85 69 33 70 154 86 05 202 15 187 05 26 74 262 88 05 54 332 05 05 62 05 270 95.25 95 75 02 77 268 04 05 101 96 97 15 05 21 165 241 (9., 045 m in ) : N -D IP D M a u vt m/ z 152 53 05 163 05 164 55 S5 05 90.05 91.05 192.05 03 05 abund 171 139 101 302 151 158 166 128 138 72 106 m /z 05 205.05 05 33 05 34 15 46 05 47 05 15 261.05 05 05 abund 12 241 17 18 20 08 22 06 412 32 118 m /z 98 99 05 100.05 101.15 02 103.05 109.15 110.05 111.15 112.05 113.05 abund 142 175 120 24 14 128 116 247 224 130 125 m/ z 275.15 276.15 277.15 290 05 305.15 306.15 307.15 abund 719 202 165 131 337 792 194 m/ z 115.15 116.05 123.15 124.05 124.95 126 05 137.95 05 150.05 151.05 m/ z abund 139 104 111 134 173 115 159 151 107 147 321 abunđ 8.021 co cn 1.000 1.155 1.090 004 685 68 652 7.558 7.530 7.516 7.351 249 236 138 976 959 6.752 602 CO o cn 054 048 023 (Tì o cn o 058 ưi 462 650 51 u> ị én -I K> Ln ro o cn 5.248 0.868 o cn r ư) s CD w 05 £ ưì w H **3 W ư> *0 'V z rrỊ tr* H C n O Ĩ-* ►►-* "0 cn 0 u> n o o ĩ ^ I N I-Ĩ 0 fl> lõ to H- *M T3 N) a> vo n VD N ) » c * *0 (Ti c o r r (D rĩ to N Ưì 0 H-» U) ro 0 X N II II II II ii II II II Tjnzn O ,,:WOZWH'5't)H^D73 H ^p D j nDx?nJO> H S ww oocjiZKiii M X > C o= c r o w s rr 0521 nzn1 < T D3 H n> (t> I 73 w (/) n sộ=5 I Z ọ o -3 C > õ o X > Z z re r 1-h t—1 u } KD • 1—• 1—* ii 0 X II II a c II II 03 w ã) II II o u> n H- Q| CT, o • C lV> VA> 1 \ xr If) ôV c \ J o ( ) c n CNJ m CNJ CM VO ■^r CO H KD v r VI' l - l CO I-H v r VO CT> o o m r~ CT» r- C u rr e n t EX PN cn cn VO u") V.Ji -=3' ^ J 00 vr o o CO v õ S I' *vi« SJ* cn (NJ PR0CN0 1 r • r[ '1 r1" NAME Date_ Time INSTRUM PR0BHD PULPR0G TD SOLVENT NS DS S WH FIDRES AQ RG DW DE Tt: D1 d ll d l2 Q H u y _ V T 20011026 16 17 av500 mm Multinucl zgpg30 55 CDC13 12 28 30303.031 0.462388 1.0814105 327 36 0 00 30 0 2.00000000 0.03000000 0.00002000 Hz Hz sec u se e usee K se c sec sec LnflNNLJj 11 N UC PI PL1 SF0 CPDPRG2 NUC2 PCPD2 PL2 PL 12 PL13 SF02 = 13C 15 u s ee - 0 dB 7 MH z UHANNUiLi I z - walCzl6 1H 88.00 - 0 16 120.00 500.1320005 us e e dB dB dB MHz F2 - P r o c e s s i n g p a r a m e t e r s 68 SI 7 MHz SF EM WDW SSB 1.00 Hz LB GB 1.40 PC 30 ppm C:/Bruker/XWXN-NMR/data/Kh/nmr/Q.Huy_VT/2/pdata/l/screen D U = C : / B r u k e r / X W I N - N M R , USER=Kh, N A M E = Q H u y _ V T , EXPN0=2, PROCNO=l F I =2 OOOppm, > — OOOppm, MI=0.1 0cm , M A X I = 10000 00cm, PC =1 400 * # ADDRESS 10 11 12 13 14 15 16 17 18 6970.2 975.1 9469.1 12144 12358.1 12883.9 12945.1 13148.2 14801.9 15039.1 15458.7 15530.5 16499.6 16895.1 17423 20770.5 20778.2 19 20 21 22 23 24 25 20805.5 20840.2 23671.2 24562.5 24585 24609.0 24632.2 24655.4 26 27 28 29 L J1 32 24673.7 24701.9 25012.3 27264.8 31239:2 31316.5 31344 : FREQUENCY [Hz] [PPM] 22515 182 179 0361 21535.832 171 6461 20204 93 160 65 17729.727 140 9832 17532.574 139.4154 17046.293 135 54 135.0987 16989.715 16801.850 133 60 15272.600 121 44 15053.243 19 70 14665.180 116 6145 45S8.830 116 08 13702.562 108 9600 13336.837 106 0518 12848.568 102.1692 9752.637 77 5510 9745.879 7 9720.605 77.2963 9638.553 7070.501 6246.202 6224 719 6203.259 6181.7 94 77.0414 56.2232 9.6685 49.4977 49.3270 49.1564 6160.315 6133.787 o i l " 322 5520.293 3747.228