Nghiên cứu loài câu đằng uncaria sesssilifuctus roxb ,rubiaceae thu hái ở cao bằng

BỘ■ GIÁO DỤC ■ VÀ ĐÀO TẠO ■ BỘ Y TÊ TRƯÒNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN XUÂN TIẾN NGHIÊN cứu LOÀI CÂU ĐẰNG UNCARIA SESSILIFRUCTUS ROXB., RUBIACEAE THU HÁI CAO BẰNG CHUYÊN NGÀNH: Dược LIỆU - Dược HỌC c ổ TRUYỀN Mã só: 03.02.03 LUỘN VÃN THGC sỉ Dược MỌC HƯÓNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS PHẠM THANH KỲ HÀ NƠI - 2002 fJcJÍM ƠQl Luận văn thực Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược H Nội Với lòng biết ơn kính trọng, tơi xin chân thành cảm ơn: Gs Ts Phạm Thanh Kỳ - Người thầy trực tiếp hướng dẫn tơi tận tình suốt q trình nghiên cứu khoa học Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: - Pgs Ts Phạm Quang Tùng - Trưởng Phòng Sau đại học, Trường Đại học Dược H Nội - Gs Vũ Ván Chuyên, Trường Đại học Dược Hà Nội -T s N guyễn Thị Sinh - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội - Ths Phạm Thị Giảng - Trưởng phòng Đơng dược, Viện Kiểm nghiệm - Ts Nguyễn Thị Vinh - Trưởng phòng Dược lý, Viện Kiểm nghiệm - Ts Nguyễn Trần Giáng H ưong - Bộ môn Dược Lý, Trường Đại học Y Hà Nội - Pgs Ts Chu Đình Kính - Viện Hoá học, Trung tâm K H TN CNQG Đ ã đóng góp ý kiến kiến q báu cho thực luận văn N hân dịp xin chân trọng cảm ơn: - Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội - Tập th ể Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội - Lãnh đạo Cục Quản lý Dược Việt Nam - Tập thê Phòng Đăng kỷ thuốc & m ỹ phẩm, Cục Quản lý Dược Việt Nam Đ ã tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực luận văn Hà Nội, ngày 19 tháng nám 2002 Ds Nguyễn Xuân Tiến MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỂ Phần 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thục vật phân bơ chi Uncarìa Schreb., họ Cà phê (Rubiaceae) 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Uncaria Schreb I 1.1.2 Số lượng loài thuộc chi Uncaria Schreb 1.1.3 Những loài thuộc chi Uncaria Schreb có Việt Nam 1.1.4 Đặc điểm hình thái thực vật số lồi thuộc chi Uncaria Schreb có Việt Nam 1.1.5 Phân bố chi Uncaria Schreb 1.1.6 Bộ phận dùng Câu đằng 1.2 Thành phần hoá học loài thuộc chi Uncaria Schreb nghiên cứu thê giới 1.3 Tác dụng sinh học cóng dụng Câu đằng 15 1.3.1 Tác dụng sinh học 15 1.3.2 Cơng dụng 16 1.3.3 Một số thuốc có Câu đằng 16 1.4 Những kết nghiên cứu Việt Nam Câu đằng 18 1.4.1 Nghiên cứu thực vật 18 1.4.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 19 1.4.3 Nghiên cứu độc tính 20 1.4.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học 20 Phần NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 22 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 22 2.2 Phương tiện nghiên cứu 22 2.2.1 Động vật thí nghiệm 22 2.2.2 Máy thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 2.2.3 Hoá chất sử dụng nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Nghiên cứu thực vật 23 2.3.2 Nghiên cứu hoá học 23 2.3.3 Nghiên cứu độc tính cấp 2.3.4 Nghiên cứu số tác dụng sinh học 24 Phần THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 26 24 3.1 Kết nghiên cứu thực vật loài Câu đằng thu hái Cao Bằng 26 3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật 26 3.1.2 Đặc điểm vi học 28 3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân 28 3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu 29 3.1.2.3 Đặc điểm bột dược liệu 31 3.2 Kết nghiên cứu vê thành phần hoá học dược liệu Câu 32 đằng u sesilifructus 3.2.1 Định tính nhóm chất hữu có dược liệu Câu đằng u sesilifructus phản 32 ứng hố học 3.2.2 Định tính alcaloid chiết xuất từ dược liệu Câu đằng u 37 sesilifructus sắc kỷ lớp mỏng 3.2.3 Định lượng alcaloid toàn phần có dược liệu Câu đằng Ư 38 sesilifructus 3.2.4 Chiết xuất phản lập alcaloid có dược liệu Câu đằng u sesilifructus 40 3.2.4.1 Chiết xuất alcaloid toàn phần 40 3.2.4.2 Phân lập alcaloid sắc ký cột 3.2.5 Nhận dạng alcaloid phân lập từ dược liệu Câu đằng 41 43 u sesilifructus 3.2.5.1 Nhận dạng alcaloid 43 3.2.5.2 Nhận dạng alcaloiđ V 46 3.2.5.3 Nhận dạng alcaloid V 47 3.2.5.4 Nhận dạng alcaloid V 50 3.3 Kết nghiên cứu độc tính dược liệu Câu đằng u sesilifructus 51 3.4 Kết nghiên cứu sô tác dụng sinh học dược liệu 52 Câu đằng u sesilifructus 3.4.1 Chuẩn bị mẫu thử 3.4.2 T tác dụng an thần dịch chiết alcaloid toàn phần chiết 52 xuất từ dược liệu Câu đằng u sesilifructus 3.4.2.1 Thử tác dụng dịch c h iế t, alcaloid toàn phần hoạt động 53 tự nhiên chuột nhắt 53 3.4.2.2 Thử tác dụng dịch chiết Câu đằng, alcaloid toàn phần tới giấc ngủ chuột nhắt thiopentan 56 3.4.3 T tác dụng hạ huyết áp dịch chiết dược liệu Câu đằng Ư sesilifructus 57 3.4.3.1 Thử tác dụng dịch chiết dược liệu huyết áp chó 57 3.4.3.2 Thử tác dụng dịch chiết dược liệu hậu hạch giao cảm 59 3.4.3.3 Thử tác dụng dịch chiết dược liệu trơn thành mạch 60 tai thỏ Phần BÀN LUẬN 62 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 76 CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU 13c - NMR : Carbon (13) Nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân 13C) ' H- NMR : Proton nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân 'H) DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer IR : Infrared uv : Ultraviolete MS : Mass Spectrum (Phổ khối) KHTN : Khoa học Tự nhiên CNQG : Công nghệ Quốc gia Đ ẶT VÂ N ĐỂ Tăng huyết áp bệnh thường gặp, bệnh gây nhiều tai biến, nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao Do nhịp sống công nghiệp, cường độ làm việc cao, căng thẳng, bệnh tăng huyết áp gia tăng nhanh chóng Ở Việt Nam, theo điều tra nhà khoa học người 15 tuổi năm 1961 số người bị bệnh tăng huyết áp có 1%, năm 1990 có tới 11,79% Như , vòng 30 năm, tỷ lệ tăng huyết áp tăng gấp 12 lần [26] Cho đến có nhiều thuốc để điều trị tăng huyết áp với nhiều chế tác dụng khác nhau, phạm vi điều trị thuốc thường hẹp Việc tìm kiếm thuốc điều trị bệnh tăng huyết áp có nguồn gốc từ thảo dược nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Theo kinh nghiệm dân gian, vị dược liệu Câu Đằng sử dụng thuốc để chữa bệnh cao huyết áp chứng bệnh chóng mặt, hoa mắt, nhức đầu, ngủ, [6 ], [28] Vị dược liệu Câu đằng đoạn thân cành có gai hình móc câu Vị ngọt, tính hàn, vào kinh can tâm bào có cơng năng: nhiệt, bình can, trừ phong, trấn kinh [8] Gần đây, nhiều tác giả Nhật nhà nghiên cứu nước Tây Âu đề cập nhiều đến tác dụng chống co giật, an thần Câu đằng [40] Gần Gs Phạm Thanh Kỳ thu hái mẫu Câu đằng Cao Bằng khác với loài Uncaria ovalifolia Roxb Uncaria homomalla Miq mà Gs Vũ Ngọc Lộ cộng nghiên cứu Do đó, với mục tiêu tìm hiểu vê đặc điểm thực vật, thành phần hố học m ột sơ tác dụng sinh học lồi Càu đằng này, chúng tơi tiến hành nghiên cứu loài Câu đằng thu hái Cao Bằng với nội dung sau: Về thực vật: - Nghiên cứu đặc điểm thực vật, xác định tên khoa học - Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột dược liệu Về thành phần hố học: - Định tính nhóm chất hữu dược liệu - Định lượng nhóm chất dược liệu - Chiết xuất phân lập alcaloid dược liệu - Nhận dạng chất phân lập Về độc tính: - Thử độc tính cấp Về tác dụng sinh học: - Thử tác dụng an thần - Thử tác dụng hạ huyết áp Những kết nghiên cứu góp phần chứng minh sở khoa học kinh nghiệm sử dụng dân gian, làm sở cho việc nghiên cứu tạo thuốc để điều trị bệnh tăng huyết áp tìm giá trị vị thuốc PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BÔ CHI UNCARIA SCHREB., HỌ CÀ PHÊ (RUBIACEAE) 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Uncaria Schreb [22], [23], [48] Cây bụi leo Cành có góc Gióng dài có móc câu hai cành bên biến đổi Lá mọc đối, có cuống ngắn; kèm ngun hay chẻ đơi Cụm hoa đơn độc đầu cành kẽ lá; hình cầu; hoa khơng cuống có cuống ngắn; bắc khơng có có dạng sợi xếp lộn xộn; ống đài phía trước hình van hay hình thoi, đài hình chng hình phễu, có thuỳ, tiền khai van tràng hình phễu, họng nhẵn, có thuỳ, tiền khai lợp rõ; nhị đính tràng, nhị ngắn, bao phấn thn góc có sợi lơng cứng; vòi nhuỵ mảnh thò ngồi; đầu nhuỵ hình cầu, hình chuỳ hay hình thoi Bầu hai ơ, giá nỗn dài, đính nỗn trung trụ, nỗn nhiều lợp Quả nang nhiều kéo dài, huỷ vách thành hai mảnh vỏ; hạt lợp lên nhau; vỏ hạt có cánh dài hai bên; phía cánh đính vào giá nỗn chia làm phần 1.1.2 Sơ lượng loài thuộc chi Uncaria Schreb Tài liệu “Index Kewensis” (tập II phụ lục II-IX) có ghi khoảng 80 lồi hợp danh pháp phân loại [39] Theo Trần Ngọc Ninh, “Họ Rubiaceae thực vật chí Việt Nam” giới có khoảng 60 lồi [31] 1.1.3 Những lồi thuộc chi Uncaría Schreb có Việt Nam Theo Lê Khả Kế (1973), “Cây cỏ thường thấy Việt Nam” có mơ tả lồi [23]: - u macrophylla Wall - u rhynchophylla (Miq.) Jacks - u sessilifructus Roxb Trong “Dược liệu Việt Nam” Bộ Y tế xuất năm 1978 mơ tả lồi [9]: - u rhynchophylla (Miq.) Jacks Trong “Tài nguyên thuốc Việt Nam” (1993) mơ tả lồi [13]: - u tonkinensis Havil - u pedicellata Roxb - u sessilifructus Roxb - u acida (Hunt.) Roxb - u rhynchophylla (Miq.) Jacks nhập nội Trong “Cây cỏ Việt Nam”, tập Phạm Hoàng Hộ (2000) mơ tả 11 lồi [22]: - u acida (Hunt.) Roxb - u cordata (Lour.) Merr - u homomalla Miq - u laevigata Wall, ex G Don - u lanosa Wall f ferriea (Bl.) Ridsd - u lancifolia Hutch - u maci'ophylla Wall, in Roxb - u scandens (Smith.) Hutch - u rhynchophylla (Miq.) Miq ex Havil - u sessilifructus Roxb - u sinensis (Oliv.) Havil Trong “Từ điển thuốc Việt Nam” Võ Văn Chi (1997) có ghi lồi [16]: - u homomaỉla Miq - u tonkinensis Havil - u laevigata Wall, ex G Doa - u lancifolia Hutch - u macrophylla Wall, in Roxb - u rhynchophylla Wall, ex Roxb - u scandens (Smith) Hutch - u sessilifructus Roxb - u sinensis (Oliv.) Havil Trong “Thực vật chí Đơng dương” tập (Flore générale de r Indochine, Tome III) H Lecomte, J Pitard xây dựng khoá phân loại mơ tả 10 lồi có Đơng dương, Việt Nam có lồi [48]: - u pediceỉlata Roxb File : Operator : Acquired : Instrument : Sample Name: Misc Info : Vial Number: C:\HPCHEM\1\DATA\N-DIP8 99.D Phong Cau true, Vien Hoa hoc 23 Jul 102 10:15 am using AcqMethod N-DIP 5989B MS CDV5 Solvent: CH30H TIEN-CDV5 , C D C , C13CPD&DEPT D EPT 90 ■■ ■■■■ 180 170 160 15 140 13 -12 ■1 - , ! ! 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm D E P T 135 CH& CH c h " I 1I I T ' | ! I ,-ị I I I I I I I I" ■ I 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm « TIEN-CDV5 , CDC13, C13CPD&DEPT DEPT90 16 155 15 14 155 150 145 140 135 130 125 120 115 ppm 40 135 130 125 120 115 ppm D E PT 135 CH&CH3 CH2 16 I C13CPD ' T , I 160 , , , , I 155 - ! -— 150 145 r — , - -, -. -J - 14 135 130 12 120 115 ppm TIEN-CDV5 O^TH^)nHHVClN(\lLn^(M {NHưi(MfOcoorooHfọơì^ oomojr-r-'O'^rr'CQVDcrvO'i o rIT) ^ Oơíl^OMOUlOơìơiưiHH '^rocococNjCNjcNCNjr-1— * , C D C , C13CPD U) H VD CM I I—I CM LO o r- r- r- r~ r- r~ Hơiơiơicovpi^ưì ưir^oro^ơìCMin r-in^rcMOoor-cn Current Data Parameters NAME TIEN CDV5.2 EXPNO PROCNO > l(T iơ > C T iC O C O O F2 - Acquisition Parameters Date_ 20020729 Time 15.23 INSTRUM av500 PROBHD mm Multinucl PULPROG zgpg TD 65536 SOLVENT CDC13 NS 3072 DS SWH 30030.029 Hz FIDRES 0.458222 Hz AQ 1.0912410 sec RG 724.1 DW 16.650 use DE 6.00 use TE 300.0 K D1 2.00000000 sec dll 0.03000000 sec dl2 0.00002000 sec NUC1 PI PL1 SFOl 13C 7.30 US€ -1.00 dB 125.7703143 MH; ========- CHANNEL f2 =- -= CPDPRG2 waltzl6 NUC2 1H PCPD2 88.00 US€ PL2 -3.00 dB PL12 15.89 dB PL13 120.00 dB SF02 500.1320005 MHz F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7577630 MHĩ WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 60 TTT 50 40 30 20 10 ppm , C D C , 1H ^ r O i - H t r j r o t — cr> cr> r~ LD m CTi r - C O H O ' X J i n ^ ' H O H f M U l ^ o ^ H ^ r ^ T H ^ r - r n v ũ c M i r o c o H M n n r ọ H H o o c o i n ro'sDVDui'T'^rrocommrocMcsj CTi CO r - r~ r - r r - r~- [ - ' r- r ^ r - r '' cor^r-^oưiưi^^ro^õcoco Ị n ^ i k ũ ^ c N i H O ì i c o r - u i H H H r l r l r l H H H O C O C O cocoLnmưiinưiưì-^nHHH r^r'-r'-r-'r-'r^r^r'-r'-r-inin ưìưiuiưiưi^r^T-^r^rromroro 3 60 TIEN-CDV5 CD o C\1 H o o o H r- CO c o o o o C\J o cr> co o o o • o '—I r—II—II—)o o o o o I Current Data Parameters NAME TIEN_CDV5.2 EXPNO PROCNO F2 - Acqu isition Parameters Date_ 20020729 Time 11.44 INSTRUM av500 PROBHD nưn Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT CDC13 NS 32 DS SWH 6613.757 Hz FIDRES 0.100918 Hz AQ 9546471 see RG 203.2 DW 75.600 usec DE 6.00 usec TE 300.0 K DI 1.00000000 see NUC1 P1 PL1 ' SF01 CHANNEL f1 ======== 1H 10.00 usee -3.00 dB 500.1325736 MHz F2 - Processing parameters SI 32768 SF 500.1299734 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 611 TIEN-CDV5 ro r- LO ro r-l ro CDC13, r - LO CO Ơ Ì «-H o o CO CO ro n ro (N CM 1H C O H O ^ i n ' T H O H cor^r^^ũuìưì^^ro Current Data Parameters NAME TIEN CDV5.2 EXPNO PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20020729 11.44 Time INSTRUM av500 PROBHD mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT CDC13 32 NS DS 6613.757 Hz SWH FIDRES 0.100918 Hz 4.9546471 sec AQ RG 203.2 DW 75.600 usee DE 6.00 usee TE 300.0 K D1 0 0 0 0 sec NUC1 PI PL1 SF01 = UnANN till 1 - = 1H 0 usee -3.00 dB 500.1325736 MHz F2 - Processing parameters ST 32768 500.1299734 MHz SF WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 T IE N -C D V o CTi c o U1 CO CO CO CO u~) 00 r—1 (T\ (— H ^OKO 'T , CDC13 Is - (N H o ƠI i n m LD KT i n i n ưì IT) ưì i n ư) f k ; 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 I ' I 4.6 4.4 k LD J 4.2 1H VO CN1 O'* CO r~ in Current Data Parameters NAME TIEN CDV5.2 EXPNO PROCNO F2 - Acquisition Paramete: Date_ 20020729 Time 11.44 INSTRUM av500 PROBHD mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT CDC13 32 NS DS SWH 6613.757 H: FIDRES 0.100918 H: 4.9546471 s< AQ RG 203.2 DW 75.600 Ui DE 6.00 Ui TE 300.0 K D1 1.00000000 Si ị CHANNEL fl ===== 1H 10 0 -3.00 500.1325736 sac , F2 - Processing parameters 32768 500.1299734 MI EM 0 0.30 H: 1.00 4.0 Í 3.6 3.4 k ) ppm PHỤ LỤC PHỔ u v , IR, MS CỦA ALCALOID V2 ( ABS ABS 0.41185 1.56828 0 0 NM NM 283.000 226.000 Sỉĩ„CDỤZ/Ss^ ÂBS _ Base 1ine OFF '»g~i 200.00 - SBU 2V'"jZ002 Page I -I 300.00 0 0 _MU - 400.00 500.00 ABS : 0.0000 -> 2.0000 MM : 200.00 -> 500.00 Basel ine Erase Uieu Re-scale Zoom Labe More Use the graphics cursor, track, slope _ P E R K IN E L M E R 4000 3?00 30 0C /0I3/01 03:.-.5 Phong TrtTTZ: i scar., 4.0CX-1, SITIODth Msu ! ) - k B r / G s Ky File Operator Acquired Instrument Sample Name Misc Info Vial Number c :\HPCHEM\1\DATA\N-DIP912 D Phong Cau true, Vien Hoa hoc 24 Jul 102 12:51 pm using AcqMethod N-DIP 5989B MS CDV2 Solvent: CH30H Library Searched : C:\DATABASE\WILEY2 75.L Quality :92 ID :Mitraphylline $$ Formosanan-16-carboxylic acid, 19-met hyl-2-oxo-, methyl ester, (19.alpha.)- (CAS) $$ Rubrad inin $$ Rubaradinine $$ Library Searched Quality ID C:\DATABASE\WILEY275.L 97 Tetrahydroalstonine $$ Oxayohimban-16-carboxylic acid, 16,17-didehydro-19-methyl-, methyl ester, (19.alpha., 20.alpha.)- (CAS) $$ (-) Abundance Scan 125 (6.214 min) : N-DIP912.D (*) 351 8000 6000 4000 2000 100 150 200 250 300 350 400 450 Abundance#212635 : Tetrahydroalstonine $$ Oxayohimban-16-carboxylic ac 3$2 (* 8000 156 6000 4000 2000 - 223 4255 251 293 321 ill, ị 1,1.1 50 100 ì-'l 150 200 250 ẬT 300 ~1— I— I— I— I— I— I — I— I— I— I — I— r~ 350 400 450 ... Một số thu c có Câu đằng 16 1.4 Những kết nghiên cứu Việt Nam Câu đằng 18 1.4.1 Nghiên cứu thực vật 18 1.4.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 19 1.4.3 Nghiên cứu độc tính 20 1.4.4 Nghiên cứu tác... chống co giật, an thần Câu đằng [40] Gần Gs Phạm Thanh Kỳ thu hái mẫu Câu đằng Cao Bằng khác với loài Uncaria ovalifolia Roxb Uncaria homomalla Miq mà Gs Vũ Ngọc Lộ cộng nghiên cứu Do đó, với mục... sinh học lồi Càu đằng này, chúng tơi tiến hành nghiên cứu lồi Câu đằng thu hái Cao Bằng với nội dung sau: Về thực vật: - Nghiên cứu đặc điểm thực vật, xác định tên khoa học - Nghiên cứu đặc điểm