Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM HÀ THANH TÙNG NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HỐ HỌC CỦA CÁC LOÀI TRONG CHI GYMNEMA R.BR Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM HÀ THANH TÙNG NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HỐ HỌC CỦA CÁC LOÀI TRONG CHI GYMNEMA R.BR Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN Nơi thực đề tài : Bộ môn Thực vật Thời gian thực : Từ 12/2010 đến 10/2012 HÀ NỘI, 2012 LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực luận văn, tơi nhận ủng hộ tạo điều kiện Đảng ủy, Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Thực vật nơi công tác học tập Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Ơn TS Trần Thế Bách người Thầy hướng dẫn truyền đạt cho kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn đơn vị, quan hợp tác hỗ trợ nghiên cứu cho tơi suốt q trình thực luận văn: Bộ môn Kỹ thuật di truyền – Viện Di truyền nơng nghiệp; Phịng thí nghiệm Dược liệu – Khoa Dược Đại học Quốc gia Seoul, Phòng tiêu – Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Phòng tiêu – Đại học quốc gia Hà Nội, Để hồn thiện luận văn, tơi khơng thể qn giúp đỡ chân thành thầy cô anh chị đồng nghiệp Bộ môn Thực vật Bộ mơn, phịng ban Nhà trường Lời cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân ln giúp đỡ động viên tơi suốt q trình hồn thiện luận văn Xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu này! DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACN ADN Acetonitryl Acid Deoxyribo Nucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphisms CTAB DAGA (Tính đa hình chiều dài phân đoạn nhân bản) Cetyl trimethylammonium bromide Deacylgymnemic acid ĐTĐ Đái tháo đường EDTA G Ethylendiamin Tetraacetic Acid Gymnema HNIP HPLC Phòng tiêu Trường Đại học Dược Hà Nội High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) High performance thin layer chromatography (Sắc ký lớp HPTLC PCR mỏng hiệu cao) Inter-simple sequence repeat (Các đoạn trình tự lặp lại đơn) (Low density lipoprotein – Lipoprotein tỷ trọng thấp) National center for biotechnology Information (Trung tâm quốc gia công nghệ sinh học Hoa Kỳ) Oral Glucose Tolerance Test (Nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống) Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PVP Poly (vinyl pyrrolidone) ISSR LDL NCBI OGTT RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA (DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên) SDS Sodium dodecyl sulfate STZ Streptozotocin UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages VLDL HNU HN Very low density Lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp) Phòng tiêu đại học quốc gia Hà Nội Phòng tiêu thực vật, Viên sinh thái tài nguyên sinh vật Viện khoa học công nghệ Việt Nam DANH MỤC BẢNG Stt Tên bảng Trang Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Gymnema R.Br Bảng 1.2 Danh sách tên loài thực vật thuộc chi Gymnema R.Br theo “The Plant list” Bảng 1.3 Phân bố loài Gymnema R.Br số nước Bảng 1.4 Khóa phân loại lồi Gymnema R Br Việt Nam 17 Bảng 2.1 Vị trí nơi thu mẫu nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Đặc điểm hình thái lồi chi Gymnema R.Br 24 Bảng 2.3 Các thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 2.4 Các mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 3.1 Các đặc điểm vi phẫu phân biệt loài chi 41 Gymnema R.Br Bảng 3.2 Các đặc điểm vi phẫu phân biệt loài 45 chi Gymnema R.Br Bảng 3.3 Tỷ lệ băng đa hình mồi nghiên cứu 46 Bảng 3.4 Tỷ lệ GX4 định lượng mẫu nghiên cứu 52 Bảng 4.1 Các loài chi Gymnema R.Br công bố 54 tài liệu Việt Nam (đối chiếu tên thức theo The Plant List)       DANH MỤC HÌNH Stt Hình 1.1 Tên bảng Giả thuyết tiến hóa thẳng cấu tạo hoa Trang phân họ Apocynaceae Asclepiadaceae Hình 1.2 Cấu trúc acid gymnemic phân lập từ 13 Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Hình 1.3 Cấu trúc Gurmarin 14 Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng thủy phân acid gymnemic tạo Gymnemagenin 15 Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng thủy phân acid gymnemic tạo Acid 16 deacylgymnemic Hình 1.6 Quy trình tối ưu hóa chiết xuất GS4 từ Gymnema sylvestre 18 (Retz.) R Br ex Schult Hình 1.7 Cấu trúc hóa học hợp chất GS4A1 GS5F2 19 Hình 2.1 Chu trình gradient HPLC áp dụng nghiên cứu 28 Hình 2.2 Quy trình chiết xuất phân đoạn thủy phân mẫu 29 nghiên cứu Hình 2.3 Quy trình chiết xuất GX4 nghiên cứu 30 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex 34 Schult Hình 3.2 Đặc điểm hình thái Gymnema inodorum (Loureiro) 35 Decaisne in A de Candolle Hình 3.3 Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wallich ex 36 Wight Hình 3.4 Đặc điểm hình thái lồi Gymnema yunnanense Tsiang 38 Hình 3.5 Đặc điểm hình thái Gymnema sp 39 Hình 3.6 Cấu tạo giải phẫu thân Gymnema latifolium Wallich ex 41 Wight Hình 3.7 Đặc điểm giải phẫu thân lồi chi Gymnema 42 R.Br Hình 3.8 Cấu tạo giải phẫu Gymnema latifolium Wallich ex 43 Wight Hình 3.9 Cấu tạo giải phẫu lồi chi Gymnema R.Br 44 Hình 3.10 ADN tổng số 27 mẫu nghiên cứu băng điện di 46 Hình 3.11 Các băng điện di của mẫu với mồi OPAH17 47 Hình 3.12 Cây phân loại dựa phân tích UPGMA hệ số tương 48 đồng di truyền lồi nghiên cứu Hình 3.13 Sắc ký đồ HPLC dịch chiết methanol mẫu nghiên cứu 50 khai triển với hệ ACN:H20 (grandient 10-90%), thời gian 30 phút Hình 3.14 Định tính gymnemagenin phân đoạn ethylacetat 51 n-butanol mẫu Gymnema latifolium Wallich ex Wight Hình 3.15 Hình 4.1 Sắc ký đồ HPTLC phân đoạn GX4 mẫunghiên cứu với hệ dung môi pha động Chloroform:Methanol (25:15) Sắc ký đồ Acid gymnemic chuẩn (Nguồn: Abdul Bakrudeen, 2009)         53 61 MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………… CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ………………………………………… 1.1 Nghiên cứu thực vật chi (Gymnema R.Br.) giới … 1.1.1 Nghiên cứu thực vật ………………………………………… 1.1.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền ……………………………… 1.1.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học ……………………………… 1.1.4 Nghiên cứu thành phần hóa học …………………………… 12 1.1.5 Các nghiên cứu chuẩn hóa thành phần tác dụng………… …… 14 1.2 Nghiên cứu chi Gymnema R.Br Việt Nam ………………… 16 1.2.1 Nghiên cứu thực vật ………………………… …………… 16 1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học …………………………… 17 1.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học ……………………………… 19 1.2.4 Các vấn đề tồn tại……………………………………………… 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu …………………………………… 21 2.2 Địa điểm nghiên cứu …………………………………………… 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu ……………………………………… 23 2.3.1 Nghiên cứu hình thái giải phẫu ……………………………… 23 2.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền ………………………………… 25 2.3.3 Nghiên cứu hóa học …………………………………………… 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU …………………………… 32 3.1 Đặc điểm thực vật đa dạng sinh học Gymnema R.Br … 32 3.1.1 Đặc điểm chung chi Gymnema R.Br ……………………… 32 3.1.2 Đặc điểm hình thái lồi chi Gymnema R.Br …… 33 3.1.3 Cấu tạo giải phẫu loài chi Gymnema R.Br …………… 40 3.1.4 Đa dạng di truyền loài chi Gymnema R.Br ………… 45 3.2 Thành phần hóa học lồi chi Gymnema R.Br …… 49 3.2.1 So sánh thành phần hoá học mẫu nghiên cứu …………… 49 3.2.2 Định lượng GX4 mẫu nghiên cứu ………………… 51 3.2.3 So sánh thành phần phân đoạn GX4 mẫu nghiên cứu 52 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN …………………………………………… 54 4.1 Về đặc điểm thực vật đa dạng sinh học …………………… 54 4.1.1 Về đa dạng loài chi Gymnema R.Br Việt Nam …… 54 4.1.2 Đa dạng mẫu thu nghiên cứu …………………………… 56 4.1.3 Xác định tên khoa học mẫu thu nghiên cứu 57 4.2 Về đặc điểm cấu tạo giải phẫu…………………………………… 57 4.3 Về đa dạng di truyền …………………………………………… 58 4.4 Về thành phần hóa học ………………………………………… 60 KẾT LUẬN ………………………………… ………………………… 64 Kết luận ………………………………………………………… 64 Đề xuất ………………………………………………………… 64 Tài liệu tham khảo Phụ lục 1: Bản đồ phân bố mẫu thu nghiên cứu Phụ lục 2: Đặc điểm hình thái chi Gymnema R.Br Phụ lục 3: Chỉ số đồng dạng di truyền Nei&Li 27 mẫu nghiên cứu   ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda sử dụng từ 2.000 năm để điều trị Đái tháo đường (ĐTĐ) [69] [72] Dựa kinh nghiệm này, nhiều nghiên cứu tiến hành xác định nhóm hoạt chất đem lại tác dụng dược liệu acid gymnemic [60][66] Tuy nhiên việc tách chiết acid gymnemic quy mô lớn để ứng dụng chữa bệnh cịn nhiều khó khăn chi phí cao nên giới hạn việc sử dụng nhóm đơn chất thực tế Vì thế, định hướng nghiên cứu dược liệu tách chiết GS4, phân đoạn saponin triterpenoid phân lập từ dịch chiết toàn phần [54, 55] Khả tách chiết đơn giản ứng dụng quy mô lớn với việc hiệu hạ đường huyết chứng minh nghiên cứu mở hướng ứng dụng rộng rãi GS4 nghiên cứu phát triển sản phẩm thuốc thảo dược từ Dây thìa canh Tại Việt Nam, nghiên cứu liên quan lồi Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) có nguồn gốc nước thực từ năm 2008 [18] từ số sản phẩm từ dược liệu phát triển nhằm phục vụ nhu cầu sử dụng hỗ trợ điều trị đái tháo đường bước đầu thương mại hóa Diabetna (Nam Dược), DK-betics (DK-Pharma), Tainsulin (Dược Nhân Hoà), Gygurmar (TC-Pharma), Bitabet (Hataphar), Ayubes (K-Link),… Trong bối cảnh đó, nghiên cứu liên quan dược liệu ngày quan tâm phân đoạn GS4 nhằm đáp ứng nhu cầu sản phẩm có chất lượng điều trị cao thị trường [10] Bên cạnh đó, xu hướng nhà khoa học quan tâm áp dụng tìm kiếm, sàng lọc tác dụng điều trị đái tháo đường tương tự Dây thìa canh từ loài chi Gymnema R Br Phương pháp dựa nguyên lý lồi bậc taxon thực vật thường có thành phần hóa học tương tự có xu hướng có tác dụng sinh học giống [3] Các nghiên cứu giới chứng minh tác dụng hạ đường huyết tương tự có lồi Gymnema montanum Hook.f   hố học tác dụng sinh học Các nghiên cứu tác dụng sinh học chứng minh tác dụng hạ đường huyết loài Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult [18][69] , Gymnema inodorum (Lour.) Decne [57][58], Gymnema latifolium Wallich ex Wight [11], Gymnema yunnanense Tsiang [70] Bên cạnh tương đồng, nghiên cứu khác biệt thành phần hóa học mẫu nghiên cứu thể vết sắc ký pic phụ sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng HPLC tỷ lệ khác GX4 mẫu Điểm đáng lưu ý lồi Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult sắc ký đồ mẫu dù khác hình thái hoa đỏ, hoa vàng hoa trắng trồng cố định điều kiện Thái Nguyên lại có sắc ký đồ hồn tồn tương đồng lại khác so với mẫu trồng Hà Nội Điều tương tự cho kết phân loại di truyền mẫu Thái Nguyên có mức độ tương đồng di truyền cao đồng thời cho thấy tác động điều kiện chăm sóc việc tích lũy chất Hiện sản phẩm điều trị đái tháo đường từ dược liệu Dây thìa canh chủ yếu sử dụng lồi Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Với thành phần tác dụng cho GS4 Trong nghiên cứu kết định lượng GX4 Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult thấp so với loài Gymnema latifolium Wallich ex Wight thu Thái Nguyên (2.25%) Năm 2011, thử nghiệm tác dụng điều trị đái tháo đường thực đồng thời loài cho thấy loài Gymnema latifolium Wallich ex Wight cho tác dụng hạ đường huyết (36,31% ± 3,50) so với lô chứng mạnh so với loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult (23,41 ± 4,09) [14] Kết củng cố thêm giả thuyết liên quan thành phần GX4 với tác dụng chữa đái tháo đường loài chi Gymnema R.Br Trong mẫu nghiên cứu, lồi Gymnema yunnanense Tsiang thu Kon Tum có tỷ lệ GX4 cao (2,57%) Jing-Tian Xie cộng thử nghiệm tác dụng dịch chiết chủng chuột béo phì ob/ob chuột đái   62 tháo đường db/db Kết cho thấy, nhóm chuột sử dụng dịch chiết cho tác dụng hạ đường huyết cao 22% so với nhóm đối chứng [70] Điều cho thấy tiềm nghiên cứu sâu loài để có định hướng khai thác phát triển     63 KẾT LUẬN Đặc điểm thực vật đa dạng sinh học Gymnema R.Br Đã mơ tả đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẫu 26 mẫu chi Gymnema R.Br thu thập từ địa phương khác nước, từ xác định thuộc lồi Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult ; Gymnema inodorum (Loureiro) Decaisne in A de Candolle; Gymnema latifolium Wallich ex Wight; Gymnema inodorum (Loureiro) Decaisne in A de Candolle loài chưa xác định tên khoa học Gymnema sp Về đặc điểm giải phẫu thân lá, loài chi Gymnema R.Br có nhiều điểm đặc trưng giống libe hóa sợi thân non, libe quanh tủy thân, có mơ mềm đồng hóa gân, mơ dày xốp mặt mặt gân Bên cạnh đó, số đặc điểm vi phẫu sử dụng để hỗ trợ nhận biết loài nghiên cứu mặt vi học đường kính thân non, mật độ kích thước lơng che chở thân, mật độ lông che chở phiến gân lá, hình dạng gân đặc điểm lông che chở Sử dụng thị RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 27 mẫu xác định hệ số số tương đồng có giá trị 0,44 – 0.88 Các mẫu nghiên cứu chia thành nhóm tương đồng với phân chia lồi hình thái phân bố địa lý loài Thành phần hóa học lồi chi Gymnema R.Br Đã định tính có mặt saponin 08 mẫu 05 lồi nghiên cứu cho thấy có có mặt acid gymnemic dịch chiết methanol tất mẫu gymnemagenin tất dịch chiết thủy phân Đã định lượng phân đoạn GX4 08 mẫu mẫu lồi cho tỷ lệ cao Gymnema latifolium Wallich ex Wight thu Thái Nguyên (2.25%) Gymnema yunnanense Tsiang thu Kon Tum (2,57%) Định tính so sánh thành phần phân đoạn GX4 mẫu nghiên cứu cho thấy phân đoạn tách có tính tương đồng cao khai triển hệ dung môi CHCl3:methanol (25:15)   64 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Bá (2010), Hình thái học thực vật, Nhà xuất Giáo dục [2] Trần Thế Bách (2007), "Nghiên cứu phân loại Họ Thiên Lý Việt Nam" Luận án Tiến sỹ Sinh Học Viện Sinh thái Tài ngun Sinh vật, [3] Lê Đình Bích (2007 ), Thực vật Dược, Nhà Xuất Y học, trang 302-306 [4] Bộ môn Thực vật (2002), Thực tập Thực vật nhận biết thuốc, In Trung tâm thư viện Đại học Dược Hà Nội, trang 54-66 [5] Bùi Chí Bửu (1999), Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng, Nhà xuất Nông nghiệp [6] Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, Nhà xuất Giáo dục, trang 283-284 [7] Võ Văn Chi (1999), Từ điển thực vật thông dụng (tập 2), Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội, trang 1217-1220 [8] Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội, trang 1218-1219 [9] Nguyễn Thị Minh Dân (2007), "Tính đa dạng chi Gynostemma tỉnh Cao Bằng ", Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học - Trường Đại học Dược Hà Nội [10] Nguyễn Thị Hương Giang (2010), "Nghiên cứu chiết xuất GS4 từ Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.", Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Đại học Dược Hà Nội [11] Phạm Văn Hải (2010), "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học Dây thìa canh to Hịa Bình," Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ Đại học Dược Hà Nội [12] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam (Tập 2), NXB Trẻ, trang 671-703   65 [13] Lê Quang Huấn (2007), Tiến hóa phân tử, Nhà xuất khoa học tự nhiên công nghệ, trang 45-60 [14] Trần Văn Ơn (2011), "Sàng lọc dược liệu có tác dụng điều trị đái tháo đường Việt Nam nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính, hạ đường huyết số dược liệu điển hình", Đề tài khoa học phát triển cơng nghệ cấp Bộ [15] Lê Quân (2009), "Nghiên cứu tính đa dạng sinh học lồi mang tên “Chó đẻ” thuộc chi Phyllanthus L Việt Nam", Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại Học-Trường Đại học Dược Hà Nội [16] Nguyễn Tập (2003), "Sử dụng chất thị phân tử ADN kết hợp với dấu hiệu hình thái nghiên cứu phân loại số thuốc Việt Nam," Báo cáo kết đề tài nghiên cứu cấp Bộ., [17] Lê Duy Thành (2009), Cơ sở sinh học phân tử, NXB Giáo dục [18] Đỗ Anh Vũ (2007), "Nghiên cứu đặc điểm thực vật tác dụng hạ đường huyết Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.)," Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học Đại học Dược Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH [19] Ali Ahmed A B., Rao A S and Rao M V (2009), "In vitro production of gymnemic acid from Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex roemer and schultes through callus culture under abiotic stress conditions," Methods Mol Biol, 547, 93-105 [20] Ananthan R., Latha M., Pari L., Ramkumar K M., Baskar C G and Bai V N (2003), "Effect of Gymnema montanum on blood glucose, plasma insulin, and carbohydrate metabolic enzymes in alloxan-induced diabetic rats," Journal of medicinal food, 6, 43-49 [21] Ananthan R., Latha M., Ramkumar K M., Pari L., Baskar C and Narmatha Bai V (2004), "Modulatory effects of Gymnema   66 montanum leaf extract on alloxan-induced oxidative stress in Wistar rats," Nutrition, 20, 280-285 [22] Baskaran K., Kizar Ahamath B., Radha Shanmugasundaram K and Shanmugasundaram E R (1990), "Antidiabetic effect of a leaf extract from Gymnema sylvestre in non-insulin-dependent diabetes mellitus patients," Journal of ethnopharmacology, 30, 295-300 [23] Bingtao Li M G G W D S and Tsiang Ying L P.-t (1995), Asclepiadaceae R Brown In Wu, Z Y & P H Raven, eds 1995 Flora of China Vol 16 (Gentianaceae through Boraginaceae) Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St Louis 479 pp., [24] Doyle J.J D J L (1990), "Isolation of Plant DNA from fresh tissue," Focus, 12, 13 - 15 [25] Gagnepain e C (1914), "Flore Générale de l'Indochine, Lecomte, ed, IV, Paris," [26] Grover J K., Yadav S and Vats V (2002), "Medicinal plants of India with anti-diabetic potential," Journal of ethnopharmacology, 81, 81-100 [27] Gurav e a S (2007), "Pharmacognosy, phytochemistry, pharmacology and clinical applications of Gymnema sylvestre R Br.," Pharmacognosy Reviews, 338-343 [28] Hellekant G., Ninomiya Y., DuBois G E., Danilova V and Roberts T W (1996), "Taste in chimpanzee: I The summated response to sweeteners and the effect of gymnemic acid," Physiology & behavior, 60, 469-479 [29] Hostettmann M (1995), Saponins - Chemistry and pharmacology of natural products, Cambridge University Press [30] Inoue K., Yamada H., Imoto T and Akasaka K (1998), "High pressure NMR study of a small protein, gurmarin," Journal of biomolecular NMR, 12, 535-541   67 [31] Inthakoun L and Delang C O (2008), Lao Flora - A checklist of plants found in Lao PDR with scientific and vernacular names, Lulu Press [32] Jingyun Fang Z W., Zhiyao Tang (2011), Atlas of woody plants in China (Distribution and Climate) Higher education Press, Springer [33] Kamble B., Gupta A., Patil D., Janrao S., Khatal L and Duraiswamy B (2012), "Quantitative Estimation of Gymnemagenin in Gymnema sylvestre Extract and its Marketed Formulations using the HPLC-ESI-MS/MS Method," Phytochemical analysis : PCA, [34] Lu F Y., Kao, M T., Huang, S F & Wang, J C (1998), Flora of Taiwan - Asclepiadaceae (2nd edition), Editorial Committee of the Flora of Taiwan, Taipei [35] Luo H., Kashiwagi A., Shibahara T and Yamada K (2007), "Decreased bodyweight without rebound and regulated lipoprotein metabolism by gymnemate in genetic multifactor syndrome animal," Molecular and cellular biochemistry, 299, 93-98 [36] Min B C and Sakamoto K (1998), "Influence of sweet suppressing agent on gustatory brain evoked potentials generated by taste stimuli," Applied human science : journal of physiological anthropology, 17, 917 [37] Murakami N., Murakami T., Kadoya M., Matsuda H., Yamahara J and Yoshikawa M (1996), "New hypoglycemic constituents in "gymnemic acid" from Gymnema sylvestre," Chemical & pharmaceutical bulletin, 44, 469-471 [38] Nakamura Y., Tsumura Y., Tonogai Y and Shibata T (1999), "Fecal steroid excretion is increased in rats by oral administration of gymnemic acids contained in Gymnema sylvestre leaves," The Journal of nutrition, 129, 1214-1222   68 [39] Nei M a W.-H L (1979), "Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases," Proc Natl Acad Sci USA 76, 5269-5273 [40] Ninomiya Y., Imoto T and Sugimura T (1999), "Sweet taste responses of mouse chorda tympani neurons: existence of gurmarinsensitive and -insensitive receptor components," Journal of neurophysiology, 81, 3087-3091 [41] Ohmori R., Iwamoto T., Tago M., Takeo T., Unno T., Itakura H., et al (2005), "Antioxidant activity of various teas against free radicals and LDL oxidation," Lipids, 40, 849-853 [42] Okabayashi Y., Tani S., Fujisawa T., Koide M., Hasegawa H., Nakamura T., et al (1990), "Effect of Gymnema sylvestre, R.Br on glucose homeostasis in rats," Diabetes research and clinical practice, 9, 143-148 [43] Osman M A., Dhawan S S., Bahl J R., Darokar M P and Khanuja S P (2011), "AFLP marking and polymorphism among progenies of Gymnema sylvestre: an important medicinal plant of India," Natural product communications, 6, 1679-1682 [44] Padmalatha K P M N V (2006), "Optimization of DNA isolation and PCR protocol for RAPD analysis of selected medicinal and aromatic plants of conservation concern from Peninsular India," African Journal of Biotechnology, 5, 230-234 [45] Prakash A O., Mathur S and Mathur R (1986), "Effect of feeding Gymnema sylvestre leaves on blood glucose in beryllium nitrate treated rats," Journal of ethnopharmacology, 18, 143-146 [46] Preuss H G., Echard B., Clouatre D., Bagchi D and Perricone N V (2011), "Niacin-bound chromium increases life span in Zucker Fatty Rats," Journal of inorganic biochemistry, 105, 1344-1349 [47] Preuss H G., Jarrell S T., Scheckenbach R., Lieberman S and Anderson R A (1998), "Comparative effects of chromium, vanadium   69 and gymnema sylvestre on sugar-induced blood pressure elevations in SHR," Journal of the American College of Nutrition, 17, 116-123 [48] Puratchimani V and Jha S (2004), "Standardisation of Gymnema sylvestre r Br with reference to gymnemagenin by high-performance thin-layer chromatography," Phytochemical analysis : PCA, 15, 164166 [49] Raju V S., Kannababu S and Subbaraju G V (2006), "Standardisation of Gymnema sylvestre R.Br by high-performance thin-layer chromatography: an improved method," Phytochemical analysis : PCA, 17, 192-196 [50] Ramkumar K M., Vanitha P., Uma C., Suganya N., Bhakkiyalakshmi E and Sujatha J (2011), "Antidiabetic activity of alcoholic stem extract of Gymnema montanum in streptozotocininduced diabetic rats," Food and chemical toxicology : an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, 49, 3390-3394 [51] Saneja A (2010), "Gymnema sylvestre (Gurma): A review," Der Pharmacia Lettre, 2, 275-284 [52] Satdive R K., Abhilash P and Fulzele D P (2003), "Antimicrobial activity of Gymnema sylvestre leaf extract," Fitoterapia, 74, 699-701 [53] Shahnawaz M (2012), "Genetic diversity assessment of Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Sm populations from Western Ghats of Maharashtra, India," Genetic Resources and Crop Evolution, 125–134 [54] Shanmugasundaram E R., Gopinath K L., Radha Shanmugasundaram K and Rajendran V M (1990), "Possible regeneration of the islets of Langerhans in streptozotocin-diabetic rats given Gymnema sylvestre leaf extracts," Journal of ethnopharmacology, 30, 265-279 [55] Shanmugasundaram E R., Rajeswari G., Baskaran K., Rajesh Kumar B R., Radha Shanmugasundaram K and Kizar Ahmath   70 B (1990), "Use of Gymnema sylvestre leaf extract in the control of blood glucose in insulin-dependent diabetes mellitus," Journal of ethnopharmacology, 30, 281-294 [56] Shigemura N., Nakao K., Yasuo T., Murata Y., Yasumatsu K., Nakashima A., et al (2008), "Gurmarin sensitivity of sweet taste responses is associated with co-expression patterns of T1r2, T1r3, and gustducin," Biochemical and biophysical research communications, 367, 356-363 [57] Shimizu K., Ozeki M., Iino A., Nakajyo S., Urakawa N and Atsuchi M (2001), "Structure-activity relationships of triterpenoid derivatives extracted from Gymnema inodorum leaves on glucose absorption," Japanese journal of pharmacology, 86, 223-229 [58] Shimizu K., Ozeki M., Tanaka K., Itoh K., Nakajyo S., Urakawa N., et al (1997), "Suppression of glucose absorption by extracts from the leaves of Gymnema inodorum," The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science, 59, 753-757 [59] Sinsheimer J E and McIlhenny H M (1967), "Constituents from Gymnema sylvestre leaves II Nitrogenous compounds," Journal of pharmaceutical sciences, 56, 732-736 [60] Sinsheimer J E and Rao G S (1970), "Constituents from Gymnema sylvestre leaves VI Acylated genins of the gymnemic acids isolated and preliminary characterization," Journal of pharmaceutical sciences, 59, 629-632 [61] Sinsheimer J E., Rao G S and McIlhenny H M (1970), "Constuents from Gymnema sylvestre leaves V Isolation and preliminary characterization of the gymnemic acids," Journal of pharmaceutical sciences, 59, 622-628 [62] Smita Nair R K (2006), "Molecular diversity in chakkarakolli (Gymnema sylvestre R Br.) assessed through isozyme and RAPD analysis," Journal of Tropical Agriculture, 44, 31-36   71 [63] Sreenath R (2012), "Perspective on polinial apparatus and carriers of asclepiadaceae sensu lato ", Global Journal of bio-science and biotechnology, 1, 45-53 [64] Stephen F Altschul T L M., Alejandro A Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J Lipman (1997), ""Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"," Nucleic Acids Res 25:3389-3402., [65] Suttisri R., Lee I S and Kinghorn A D (1995), "Plant-derived triterpenoid sweetness inhibitors," Journal of ethnopharmacology, 47, 9-26 [66] Suzuki K., Ishihara S., Uchida M and Komoda Y (1993), "Quantitative analysis of deacylgymnemic acid by high-performance liquid chromatography" Yakugaku zasshi : Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 113, 316-320 [67] Takhtajan (2009), Flowering Plants, Springer Verlag [68] The-Plant-List (2010) Version Published on the Internet; http://www.theplantlist.org/ [69] Ulbricht C., Abrams T R., Basch E., Davies-Heerema T., Foppa I., Hammerness P., et al (2011), "An evidence-based systematic review of gymnema (Gymnema sylvestre R Br.) by the Natural Standard Research Collaboration," Journal of dietary supplements, 8, 311-330 [70] Xie J T., Wang A., Mehendale S., Wu J., Aung H H., Dey L., et al (2003), "Anti-diabetic effects of Gymnema yunnanense extract," Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society, 47, 323-329 [71] Ye W C., Zhang Q W., Liu X., Che C T and Zhao S X (2000), "Oleanane saponins from Gymnema sylvestre," Phytochemistry, 53, 893-899   72 [72] Yeh G Y., Eisenberg D M., Kaptchuk T J and Phillips R S (2003), "Systematic review of herbs and dietary supplements for glycemic control in diabetes," Diabetes care, 26, 1277-1294 [73] Zhu X M., Xie P., Di Y T., Peng S L., Ding L S and Wang M K (2008), "Two new triterpenoid saponins from Gymnema sylvestre," Journal of integrative plant biology, 50, 589-592 [74] Gurav e a S (2007), "Pharmacognosy, phytochemistry, pharmacology and clinical applications of Gymnema sylvestre R Br.," Pharmacognosy Reviews, 338-343   73 Phụ lục 1: Bản đồ phân bố mẫu thu mẫu nghiên cứu       Phụ lục 2: Đặc điểm hình thái mẫu Gymnema R.Br       Lá     Hoa   Bộ  nhuỵ   Thể  truyền   phấn   Quả     Phụ lục 3: Hệ số đồng dạng di truyền Nei&Li 27 mẫu nghiên cứu M1     M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 M26 M1 1.00 M2 0.71 1.00 M3 0.67 0.68 1.00 M4 0.66 0.69 0.71 1.00 M5 0.58 0.60 0.68 0.77 1.00 M6 0.59 0.64 0.64 0.65 0.67 1.00 M7 0.58 0.69 0.57 0.61 0.54 0.69 1.00 M8 0.55 0.65 0.59 0.59 0.62 0.60 0.58 1.00 M9 0.55 0.65 0.56 0.58 0.54 0.61 0.60 0.68 1.00 M10 0.54 0.67 0.60 0.59 0.57 0.56 0.58 0.65 0.88 1.00 M11 0.61 0.68 0.65 0.61 0.58 0.58 0.55 0.65 0.80 0.77 1.00 M12 0.60 0.63 0.64 0.63 0.60 0.58 0.57 0.65 0.55 0.61 0.71 1.00 M13 0.45 0.56 0.44 0.48 0.48 0.60 0.61 0.57 0.55 0.48 0.52 0.47 1.00 M14 0.62 0.65 0.62 0.61 0.61 0.64 0.60 0.65 0.57 0.67 0.66 0.68 0.56 1.00 M15 0.64 0.62 0.76 0.76 0.70 0.57 0.55 0.56 0.57 0.62 0.68 0.64 0.47 0.73 1.00 M16 0.50 0.56 0.49 0.49 0.52 0.56 0.49 0.60 0.64 0.53 0.57 0.53 0.55 0.59 0.60 1.00 M17 0.46 0.51 0.45 0.52 0.45 0.54 0.52 0.51 0.53 0.44 0.50 0.51 0.59 0.50 0.48 0.56 1.00 M18 0.56 0.59 0.70 0.67 0.65 0.54 0.49 0.58 0.49 0.55 0.61 0.69 0.46 0.73 0.70 0.51 0.49 1.00 M19 0.45 0.53 0.66 0.65 0.61 0.55 0.48 0.54 0.42 0.44 0.47 0.60 0.49 0.62 0.66 0.50 0.55 0.72 1.00 M20 0.54 0.60 0.56 0.60 0.54 0.57 0.60 0.56 0.50 0.52 0.51 0.59 0.54 0.65 0.57 0.52 0.54 0.54 0.58 1.00 M21 0.55 0.60 0.58 0.60 0.58 0.66 0.59 0.53 0.53 0.60 0.57 0.54 0.58 0.71 0.63 0.49 0.46 0.53 0.49 0.68 1.00 M22 0.57 0.66 0.71 0.70 0.66 0.64 0.58 0.63 0.57 0.62 0.64 0.64 0.58 0.75 0.68 0.56 0.50 0.70 0.64 0.65 0.72 1.00 M23 0.58 0.54 0.66 0.60 0.60 0.53 0.56 0.51 0.55 0.53 0.59 0.60 0.49 0.65 0.62 0.45 0.49 0.64 0.60 0.63 0.65 0.66 1.00 M24 0.49 0.56 0.50 0.57 0.57 0.60 0.54 0.56 0.50 0.53 0.52 0.55 0.60 0.59 0.56 0.52 0.47 0.54 0.44 0.60 0.73 0.64 0.49 1.00 M25 0.53 0.59 0.66 0.66 0.64 0.55 0.49 0.62 0.49 0.59 0.59 0.62 0.47 0.62 0.66 0.49 0.45 0.67 0.68 0.51 0.56 0.65 0.59 0.56 1.00 M26 0.48 0.57 0.58 0.59 0.54 0.60 0.57 0.58 0.54 0.55 0.58 0.65 0.52 0.65 0.60 0.47 0.48 0.68 0.57 0.56 0.61 0.69 0.56 0.62 0.64 1.00 M27 0.48 0.55 0.52 0.54 0.43 0.48 0.54 0.48 0.51 0.53 0.47 0.44 0.54 0.53 0.57 0.49 0.47 0.52 0.53 0.50 0.53 0.50 0.52 0.44 0.57 0.53 M27 1.00 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM HÀ THANH TÙNG NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HỐ HỌC CỦA CÁC LOÀI TRONG CHI GYMNEMA R. BR Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC... 1.1.4 Nghiên cứu thành phần hóa học …………………………… 12 1.1.5 Các nghiên cứu chuẩn hóa thành phần tác dụng………… …… 14 1.2 Nghiên cứu chi Gymnema R. Br Việt Nam ………………… 16 1.2.1 Nghiên cứu thực vật …………………………... chung chi Gymnema R. Br ……………………… 32 3.1.2 Đặc điểm hình thái lồi chi Gymnema R. Br …… 33 3.1.3 Cấu tạo giải phẫu loài chi Gymnema R. Br …………… 40 3.1.4 Đa dạng di truyền loài chi Gymnema R. Br …………