Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam

Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam

Trang 1

BO GIAO DUC VA DAO TAO BO Y TE TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM HÀ THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG THỰC VẬT

VA THANH PHAN HOA HOC CUA CAC LOAI

TRONG CHI GYMNEMA R.BR O VIET NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Trang 2

BO GIAO DUC VA DAO TAO BO Y TE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM HÀ THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG THỰC VẬT VA THANH PHAN HOA HOC CUA CAC LOAI

TRONG CHI GYMNEMA R.BR O VIET NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CƠ TRUYÊN

Nơi thực hiện đề tài : Bộ mơn Thực vật Thời gian thực hiện : Từ 12/2010 đến 10/2012

Trang 3

LOI CAM ON

Trong quả trình thực hiện luận văn, tơi đã nhận được sự ủng hộ và tạo điều kiện của Đảng ủy, Ban giảm hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội và Bộ mơn Thực vật nơi tơi cơng tác và học tập

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Ơn và TS

Trần Thế Bách là những người Thây đã hướng dẫn và truyền đạt cho tơi những kinh nghiệm quý bảu trong nghiên cứu khoa học

Tơi xin chân thành cảm ơn các ẩơn vị, cơ quan đã hợp tác và hỗ trợ

nghiên cứu cho tơi trong suốt quá trinh thực hiện luận văn: Bộ mơn Kỹ thuật

di truyền — Viện Di truyền nơng nghiệp; Phịng thí nghiệm Dược liệu — Khoa Dược Đại học Quốc gia Seoul, Phịng tiêu bản — Viện sinh thái và tài nguyên

sinh vật, Phịng tiêu bản — Đại học quốc gia Hà Nội,

Đề hồn thiện luận văn, tơi khơng thể quên sự giúp đỡ chân thành của

các thay cơ và các anh chi đồng nghiệp tại Bộ mơn Thực vật và các Bộ mơn,

phịng ban trong Nhà trường

Lời cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người thân luơn giúp đỡ động viên tơi trong suốt quá trình hồn thiện luận văn

Trang 4

ACN ADN AFLP CTAB DAGA DTD EDTA HNIP HPLC HPTLC ISSR LDL NCBI OGTT PCR PVP RAPD SDS STZ UPGMA VLDL HNU HN DANH MUC CHT VIET TAT Acetonitryl

Acid Deoxyribo Nucleic

Amplified Fragment Length Polymorphisms

(Tính đa hình chiều dài các phân đoạn được nhân bản) Cetyl trimethylammonium bromide

Deacylgymnemic acid

Đái tháo đường

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

Gymnema

Phịng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội

High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao)

High performance thin layer chromatography (Sac ky lép mỏng hiệu năng cao)

Inter-simple sequence repeat (Các đoạn giữa của các trình tự lặp lại đơn)

(Low density lipoprotein — Lipoprotein tỷ trọng thấp)

National center for biotechnology Information (Trung tâm quốc gia về cơng nghệ sinh học Hoa Kỳ)

Oral Glucose Tolerance Test

(Nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống)

Polymerase Chain Reaction (Phan tmg chu6i tring hgp)

Poly (vinyl pyrrolidone)

Random Amplification of Polymorphic DNA (DNA da hinh khuéch dai ngau nhién)

Sodium dodecyl sulfate

Streptozotocin

Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages

Very low density Lipoprotein (Lipoprotein ty trong rat thap)

Phong tiéu ban dai hoc quốc gia Hà Nội

Trang 5

Stt Bang 1.1 Bang 1.2 Bang 1.3 Bang 1.4 Bang 2.1 Bang 2.2 Bang 2.3 Bang 2.4 Bang 3.1 Bang 3.2 Bang 3.3 Bang 3.4 Bang 4.1 DANH MUC BANG Tén bang Vi tri phan loai cla chi Gymnema R.Br

Danh sach tén loai thye vat thudc chi Gymnema R.Br theo “The Plant list”

Phân bố các lồi Gymnema R.Br ở một số nước Khĩa phân loại các lồi Gyznnema R Br ở Việt Nam

Vị trí nơi thu các mẫu trong nghiên cứu

Đặc điểm hình thái các loai trong chi Gymnema R.Br Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR

Các mơi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

Các đặc điểm vi phẫu phân biệt giữa các lồi trong chỉ Gymnema R.Br

Các đặc điểm vi phẫu lá phân biệt giữa các lồi trong chi Gymnema R.Br

Tỷ lệ băng đa hình của các mơi nghiên cứu Tỷ lệ GX4 định lượng trong các mẫu nghiên cứu Các lồi trong chi Gymnema R.Br cng bé trong cdc

Trang 6

Stt Hình 1.2 Hình 1.4 Hình 1.6 Hình 2.2 Hình 3.1 Hình 3.3 Hình 3.5 DANH MỤC HÌNH Tên bảng

Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

Sơ đồ phản ứng thủy phân acid gymnemic tạo Gymnemagenin

Quy trình tối ưu hĩa chiết xuat GS4 tir Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

| Quy trình chiết xuất phân đoạn và thủy phân các mẫu

trong nghiên cứu

Trang 7

Hinh 3.8 Hinh 3.11 Hinh 3.13 Hinh 3.14 Wight "Cấu tạo giải phẫu lá Gymnema iatifolium Wallich ex Wight

Các băng điện di của của các mẫu với mỗi OPAH17

Sắc ký đồ HPLC dịch chiết methanol 8 mẫu nghiên cứu khai triển với hệ ACN:H¿0 (grandient 10-90%), thời gian

30 phút

Trang 8

MUC LUC Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ cQQQ HT n TT n TH nh nh nha 1 CHƯƠNG 1: TƯNG QUAN .-ccccccccc 2c si 3 1.1 Nghiên cứu vé thye vat chi (Gymnema R.Br.) trên thế giới 3 1.1.1 Nghiên cứu về thực vật - ccc ni 3 1.1.2 Nghiên cứu về đa dạng di truyền .- - : 7

1.1.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học .ccccc cà: 9 1.1.4 Nghiên cứu về thành phần hĩa học .:‹ :- 12

1.1.5 Các nghiên cứu chuẩn hĩa thành phần tác dụng 14

1.2 Nghiên cứu chỉ Gynnema R.Br ở Việt Nam 16

1.2.1 Nghiên cứu về thực vật cccc nen l6 1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hĩa học . ‹ - 17

1.2.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học .- - c<¿ 19 1.2.4 Các vấn đề tồn tại cu nhớ 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứỨu . 21

2.2 — Địa điểm nghiên cứu con xa 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Nghiên cứu hình thái và giải phẫu . . 23

2.3.2 Nghiên cứu da dang di truyền "¬ 25 2.3.3 Nghiên cứu hĩa học .cccẰ cà 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU 32

3.1 _ Đặc điểm thực vật và đa dạng sinh học của Gymnema R.Br 32

3.1.1 Đặc điểm chung của chỉ Gymnema R.Br 32

3.1.2 Đặc điểm hình thái các lồi trong chỉ Gymnema R.Br 33

Trang 9

3.1.4 Da dang di truyền các lồi trong chi Gymnema R.Br 45

3.2 Thành phần hĩa học của các lồi trong chi Gymnema R.Br 49

3.2.1 So sánh thành phần hố học các mẫu nghiên cứu 49

3.2.2_ Định lượng GX4 trong các mẫu nghiên cứu 51

3.2.3 So sánh thành phần phân đoạn GX4 trong các mẫu nghiên cứu 32 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .- c- ccccc Sẽ 54 4.1 Về đặc điểm thực vật và đa đạng sinh học 34

4.1.1 Về đa dạng các lồi trong chỉ Gymnema R.Br ở Việt Nam 34

4.1.2 Đa dạng mẫu thu trong nghiên cứu .-. - 56

4.1.3 Xác định tên khoa học của các mẫu thu được trong nghiên cứu 57 4.2 Về đặc điểm cấu tạo giải phẫu ‹- cc cà 57 4.3 VỀ đa dạng di truyền .- Lí SH se 38 4.44 Về thành phần hĩa học .- cc-cccc cc sen 60 KẾT LUẬN -.- CC ST nh TH nh nh nen nha 64 | Co 8 Cs nh 64 2 DE XUAE na .a.<4 64

Tài liệu tham khảo

Phụ lục 1: Bản đồ phân bố các mẫu thu trong nghiên cứu Phụ lục 2: Đặc điểm hình thái của chỉ Gymnema R.Br

Trang 10

DAT VAN DE

Day thia canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) da duge nền y học cơ truyền An D6 Ayurveda str dung tir hon 2.000 nam để điều trị Đái tháo đường (ĐTĐ) [69] [72] Dựa trên kinh nghiệm này, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành xác định nhĩm hoạt chất chính đem lại tác dụng của dược liệu này là các acid gymnemic [60][66] Tuy nhiên việc tách chiết acid

gymnemic ở quy mơ lớn để ứng đụng chữa bệnh cho đến nay cịn nhiều khĩ

khăn do chi phí cao nên đã giới hạn việc sử dụng nhĩm đơn chất này trong thực tế Vì thế, một định hướng nghiên cứu được liệu này là tách chiết GS4, là phân đoạn các saponin triterpenoid phân lập từ dịch chiết tồn phần của cây [54, 55] Khả năng tách chiết đơn giản cĩ thê ứng dụng trên quy mơ lớn cùng với việc hiệu quả hạ đường huyết được chứng minh trong các nghiên

cứu và đã mở ra hướng ứng dụng rộng rãi GS4 trong nghiên cứu phát triển

sản phẩm thuốc thảo được từ Dây thìa canh

Tại Việt Nam, các nghiên cứu liên quan lồi Dây thìa canh (Gyzmnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) cĩ nguồn gốc trong nước đã được thực

hiện từ năm 2008 [18] và từ đĩ một số sản phẩm từ dược liệu này đã được

phát triển nhằm phục vụ nhu cầu sử dụng trong hỗ trợ điều trị đái tháo đường

bước đầu đã được thương mại hĩa như Diabetna (Nam Dược), DK-betics (DK-Pharma), Tainsulin (Dược Nhân Hồ), Gygurmar (TC-Pharma), Bitabet

(Hataphar), Ayubes (K-Link), Trong bối cảnh đĩ, các nghiên cứu liên

quan dược liệu này ngày cảng quan tâm hon phân đoạn GS4 nhằm đáp ứng những nhu cầu sản phẩm cĩ chất lượng điều trị cao của thị trường [10]

Bên cạnh đĩ, một xu hướng mới đang được các nhà khoa học quan

tâm áp dụng là tìm kiếm, sàng lọc tác dụng điều trị đái tháo đường tương tự

Trang 11

[21][50], Gymnema_ inodorum (Lour.) Decne [57][58], Gymnema

yunnanense Tsiang [70],

Cho dén nay các nghiên cứu trong nước được thực hiện trên 2 lồi là Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult [18] va Gymnema latifolium Wallich ex Wight [14] Các nghiên cứu này bước dau đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết của nguồn gen các lồi này thu ở trong nước Tuy nhiên chưa cĩ nghiên cứu nào được thực hiện một cách hệ thống về tính đa dạng thực vật các lồi trong chỉ Gymnema R.Br và thành phần các phân đoạn GX4 (là phân đoạn giàu saponm triterpenoid của các lồi trong chi Gymnema được phân lập theo quy trình tương tự như quy trình phân lập GS4 của Dây thia canh Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

Xuất phát từ thực tế này, đề tài “Nghiên cứu đa dạng thực vật và thành phần hố học của các lồi trong chỉ Gymnema R.Br ở Việt Nam” được thực hiện với các mục tiêu:

1 Mơ tả đặc điểm thực vật, cầu tạo giải phẫu và xác định tính đa dạng di truyền của các lồi trong chỉ Gymnema R Br ở Việt Nam

Trang 12

CHUONG 1: TONG QUAN

1.1 NGHIEN CUU CHI (GYMNEMA R.BR.) TREN THE GIOI 1.1.1 Các nghiên cứu về thực vật

1.1.1.1 VỊ trí phân loại

Lich sir phan loai cua chi Gymnema R.Br gan lién voi lich sit quan điểm phân loại của hai họ Thiên lý (Asclepiadaceae) và họ Trúc đảo (Asclepiadaceae) Trong đa số các tài liệu phân loại thực vật kinh điễn, chi Gywmnema R.Br được xếp trong họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [23][25] Tuy nhiên, theo hệ thống phân loại cơng bố năm 2009, Takhtajan đã theo quan điểm của Hallier (1905, 1912), Stebbins (1974), Thorne (2006), Endress &

Bruyns (2000) va Endress & Stevins (2001) để nhĩm Apocynaceae và

Asclepiadaceae thành một họ duy nhất, và theo đĩ Gymnema R.Br trở thành một chi trong phân họ Asclepiadoideae của một họ lớn là Apocynaceae (Hình 1.1) Quan điểm gộp này dựa trên giả thuyết của Cronquist về sự tiến

hĩa thẳng trong cấu tạo hoa của Apocynaceae và Asclepiadaceae, cụ thế từ phân họ Plumerioideae đến lần lượt các phân họ Apocynoideae,

Periplocoideae, Secamoneae và cuối cùng là phân họ Asclepiadoideae [67]

Cho đến nay quan điểm thứ 2 được thừa nhận rộng rãi trong các hệ

thống phân loại quốc tế [68]

Trang 13

Hình 1.1: Giả thuyết về sự tiến hĩa thẳng trong cấu tạo hoa của các phân họ trong Apocynaceae và Asclepiadaceae [63 |

1.1.1.2 Đặc điễm thực vật của chỉ Gymnema R.Br

Cây leo, khơng cĩ rễ phụ trên thân Lá mọc đối, khơng nạc Cụm hoa xim, dạng tán hoặc chùm Hoa nhỏ Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài cĩ tuyến, ít khi khơng cĩ tuyến Tràng hình bánh xe; thùy tràng khơng gập trong nụ, tiền khai vặn phải Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ đính ở tràng, thường cĩ các hàng lơng xếp đọc theo tràng Chỉ nhị dính nhau; bao phấn 2 ơ, cĩ phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và cĩ sáp bao bên ngồi vách khối phấn, khối phân khơng cĩ mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn cĩ gĩt đính và 2 chuơi; khối phấn hướng lên; chỉ cĩ một khối phấn trong mỗi ơ phấn Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu khơng thĩt lại thành dang vịi nhụy Cột nhi - nhụy hình ống nhọn đầu [23][34]

1.1.1.3 Các lồi thuộc chỉ Gymnemau R.Br

Trang 14

định là tên đồng nghĩa (30,1%) và 23 tên chưa xác định được chính xác thơng tin (22,3%) Danh sách các tên được chấp nhận theo The plant list

được trình bày trong Bảng 1.2 Một điểm đáng lưu ý theo danh sách này là loai Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult phé bién trong chỉ được xếp

là tên đồng nghĩa của lồi Ä⁄2rsđenia sylvestris (Retz.) P.I.Forst [68] Bảng 1.2: Danh sách tên lồi thực vật thuộc chỉ Gyznnema R.Br theo

Trang 15

Bảng 1.2: Danh sách tên lồi the vat thudc chi Gymnema R.Br theo Stt | 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47

“The Plant list” [68]

Tên các lồi trong chi Gymnema R.Br được chấp nhận Gymnema lacei Craib

| Gymnema lactiferum (L.) R.Br ex Schult

| Gymnema latifolium Wall ex Wight

Gymnema littorale Blume

Gymnema longiretinaculatum Tsiang

Gymnema lushaiense M.A.Rahman & Wilcock | Gymnema macrothyrsa Warb

Gymnema maingayi Hook.f Gymnema mariae Schltr Gymnema micradenium Benth | Gymnema molle Wall ex Wight

Gymnema montanum Hook.f

Gymnema rufescens Decne

| Gymnema schlechterianum Warb Gymnema spirei Costantin

Gymnema suborbiculare K.Schum

Gymnema syringaefolium (Decne.) Costantin | Gymnema thorelii Costantin

Trang 16

Bảng 1.2: Danh sách tên lồi the vat thudc chi Gymnema R.Br theo “The Plant list” [68]

Trang 17

Các nghiên cứu đa dạng di truyền hiện được tập trung nghiên cứu trên

loai Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult sử dụng các chỉ thị phân tử

khác nhau nhv isozyme [62], RAPD[53][62], ISSR[53] va AFLP[43] Trình

tự ADN của mét sé loai trong chi gm Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult., Gymnema inodorum (Loureiro) Decaisne đã cơng bố trên Blast [64]

Padmalatha (2006) đã nghiên cứu tối ưu hĩa quy trình chiết xuất ADN từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult st dung phuong phap CTAB cai tién dat ham lugng ADN 1-2 pg/pl ti 1g mé 14 Quy trinh RAPD

sử dụng nồng độ cao MgCl; (3 mM), nồng độ thấp mơi (0.5 uM) và Tag

polymerase (0.2 đơn vị), 50 ng khuơn ADN với nhiệt độ gắn mơi 37°C được chứng minh cho kết quả tách ADN tối ưu nhất [44]

Smita Nạr và cộng sự đã phân tích tính đa đạng di truyền của 18 mẫu Gymnema thu ở các vùng khác nhau của Kerala (An Ðộ) sử dụng chỉ thị

1sozymes và RAPD Trong nghiên cứu, 3 hệ enzyme malate dehydrogenase, esterase, và RUBISCO đã khảo sát, trong đĩ 5/8 locus (62.5%) cho biéu hién

đa hình, trong đĩ hệ enzym RUBISCO khơng cho biểu hiện đa hình giữa các

mẫu nghiên cứu Trong nghiên cứu RAPD thu được 123 băng ADN sử dụng

15 mỗi ngẫu nhiên Trong đĩ cĩ 90 băng đa hình (73.2%) Chỉ số Jaccard trong khoảng 0.72 - 0.85 cho thấy mức độ khác biệt giữa các mẫu khảo sát

[62]

Trong một nghiên cứu khác trên mối quan hệ di truyền của 22 quan thé Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult phan b6é & ving Maharashtra (Ân Độ) sử dụng 2 chỉ thị phân tử RAPD va ISSR cho thấy cĩ sự khác nhau ở mức độ cao (GST = 0.41 theo chỉ thị ISSR va Nm = 0.92 dựa trên chi thi

RAPD) [53]

Mức độ đa hình cua 20 mau Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex

Schult được đánh giá bằng chỉ thị AFLP sử dụng phan tng Multiplex PCR phối hợp 64 (8x8) mơi 14 kết hợp mỗi được xác định là phù hợp nhất với

lồi nghiên cứu cho 1689 băng trong đĩ 972 (57.5%) thể hiện đa hình và

Trang 18

mồi từ 55-225, trong đĩ băng đa hỉnh trong khoảng 34 (E-ACC/M-CAC) đến

157 (E-AGG/M-CAG) và các băng đặc trưng của mỗi mẫu quan sát được trong khoảng 8 (E-ACC/M-CAC) tới 69 (E-AGG/M-CAC) Các cặp mỗi E- AGG/M-CAC, E-AGG/CTG, E-AGG/CAG va E-ACA/CAT cho nhiều

thơng tin về đa đạng di truyền nhất Hệ số đồng dạng di truyền giữa các mẫu trong khoảng 0.212 tới 0.731 [43]

1.1.3 Các nghiên cứu về tác dụng sinh học

Tổng hợp tài liệu 202 tài liệu cơng bố tra cứu với từ khĩa “Gymnermna” từ thư viện Y học quốc gia Hoa Kỳ NCBIỊ, tại thời điểm thực hiện nghiên cứu này cĩ 4 nước đang quan tâm tới những tác dụng sinh học của các lồi trong chi Gymnema R.Br là Mỹ, Nhật, Trung Quốc, Ân Độ Các nghiên cứu đã tách biệt theo hai xu hướng:

Xu hướng 1 (chiếm khoảng 50%): Gồm cĩ Trung Quốc và Ấn Độ Hai quốc gia này đang đi sâu nghiên cứu nhằm phân lập và chuẩn hĩa các thành phần cĩ tác đụng hạ đường huyết, tiếp tục đi sâu nghiên cứu về tác dụng và cơ chế phân tử của Gymnema sylvesire (Retz.) R Br ex Schult

Xu hướng 2 (chiếm khoảng 50%): Gồm cĩ Mỹ và Nhật Hiện tại mỗi quan tâm của hai quốc gia này là nghiên cứu các cơng thức kết hợp Gymnema syivesire (Retz.) R Br ex Schult với các thành phần khác như các chất chống oxy hĩa trong các chế phẩm giảm béo Một trong những hướng đi duoc quan tam gan day 1a nghién ctu Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult làm thực phẩm chức năng giúp kiểm sốt đường huyết và lipid máu 1.1.3.1 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các lồi thuộc chỉ Gymnema R Br

Tác dụng hạ đường huyết được tập trung nghiên cứu trên cây Dây thìa

canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult) dya trén kinh nghiém st dụng lâu đời của nền Y học Ayuveda của Ấn Độ [26] Các nghiên cứu được thực hiện từ thăm dị dược lý, xác định cơ chế tác dụng của dịch chiết tồn

phần, phân đoạn tác dụng GS4 hoặc từ đơn chất cĩ tác dụng chính là acid

Trang 19

bước đầu đã được nghiên cứu chứng minh Một số kết quả nghiên cứu về tác

dung ha dwong huyét cua Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult di được thực hiện:

Chế độ ăn cĩ chứa bột lá Gymnema syivesire (Retz.) R.Br ex Schult với liều 500mg/chuột/ngày trong 10 ngày cĩ tác dụng bảo vệ đáng kế đối với chuột gây ĐTĐ thực nghiệm bằng beryllium nitrat và đưa mức đường

huyết trở về mức bình thường sau 4 ngày so với 10 ngày ở lơ chuột khơng

duge dung Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult Tuy nhién, ở 16 chuột bình thường được cho ăn bột lá trong 25 ngày thì mức hạ đường huyết khơng cĩ ý nghĩa thống kê [45]

Dịch chiết nước GS3 và GS4 cia 14 Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult với liều 20mg/ngày trong 20-60 ngày làm cân bằng mức đường huyết ở chuột cống được gây ĐTĐ thực nghiệm bằng streptozotocin (STZ) do phục hồi tế bào B đảo tụy Dịch chiết làm tăng gấp đơi số lượng đảo tụy và tế bào B [54]

Thí nghiệm với GS4 điều trị lặp lại trong 32-35 ngày với liều 1g/kg/ngày

ở chuột cống bình thường và chuột được gây ĐTĐ nhẹ bằng STZ liều 30mg/kg cho thấy sự giảm đường huyết cĩ ý nghĩa thống kê trong thử nghiệm dung nạp glucose bằng đường uống (OGTT) và khơng cĩ bất cứ một biến đơi cĩ ý nghĩa nào tới kháng thể kháng insulin [42]

Thử nghiệm lâm sàng trên 27 bệnh nhân ĐTĐ typ I được cho uống cao GS4 400mg/ngày cùng với điều tri bang insulin cho thay nồng độ đường huyết, HbA1C (Glycosylated hemoglobin AC), protein glycosylate huyết tương hạ thấp nhanh chĩng và giảm lượng insulin cần dùng Lipid máu giảm về mức gần bình thường [55]

Trong một thử nghiệm khác, 22 bệnh nhân ĐTĐ typ II được cho uống cao

GS4 400mg/ngày trong 18-20 tháng kết hợp với thuốc điều trị tiêu đường

Nhĩm được điều trị cĩ sự giảm đường huyết và HbA1C đáng kể và tăng

lượng insulin tiết ra từ tụy Lượng thuốc uống điều trị tiểu đường cũng

giảm và 5 người cĩ thể bỏ thuốc [22]

Trang 20

Cac loai khac ctng chi Gymnema R Br cing da dugc nghiên cứu chứng minh tác dụng ha đường huyết trén thyc nghiém bao g6m: Gymnema

montanum H [20, 21], Gymnema inodorum (Lour.) Decne [58] va

Gymnema latifolium Wall ex Wight [11]

1.1.3.2 Nghiên cứu trên các tác dụng sinh học khác

Day thia canh Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult ti lau da được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian với các tác dụng là thuốc tiêu hĩa, làm săn se, lợi tiêu Dịch từ rễ được sứ đụng chống nơn và chữa kiết ly Dịch chiết của cây cịn được cho vào sữa mẹ để chữa các triệu chứng lở loét miệng

ở trẻ nhỏ [51 |

Trong một thử nghiệm độc tính cấp, LDso của địch chiết nước và dịch

chiết cồn của Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult thir nghiém trén chuột nhắt được xác dinh 14 375mg/kg, khong cé cdc biéu hién tang can, bat thường thần kinh và phản ứng phản xa Ty 16 an toan (LDso/EDs) la 11 trén chuột bình thường và 16 trên chuột tiêu đường [51]

Các tác dụng khác của Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult đã được nghiên cứu thực nghiệm chứng minh gồm cĩ:

(Very low density Lipoprotein - VLDL) và Lipoprotein tỷ trọng thấp

(Low density lipoprotein — LDL) lam tang bai tiét các Sterol trung tinh va Sterol acid qua phân, ngồi ra nĩ cịn làm giảm tổng lượng Cholesterol và mức Triglycerid trong huyết tương [35] Tác đụng này phụ thuộc liều và

tương đương với clifibrate trên mơ hình thực nghiệm [69]

©Ị _ Tác dụng giảm cân, chống béo phì: Gurmarin, một polypeptip phân lập được từ địch chiết Gymnema syivestre (Retz.) R.Br ex Schult cd kha nang

làm giảm cảm giác ngọt mà khơng ảnh hưởng đến các vị giác khác do ức

chế chọn lọc cảm giác ngọt trên dây thần kinh và tế bảo vị giác chuột

cống và chuột nhất [30][40][56] Tác dụng làm mắt vị ngọt Dây thìa canh cịn gặp ở người, tinh tinh và động vật linh trưởng [28, 36] Preuss trong

Trang 21

các nghiên cứu của mình đã chứng minh rằng dịch chiết chuẩn hĩa Dây

thìa canh kết hợp với acid hydrocitric và niacin gắn chromchrom cĩ tác dụng giảm cân kết hợp với việc duy trì mức lipid an tồn cho cơ thê [47]

[46]

©Ị Tac dung khang khuẩn: Dịch chiết cồn của Gymnema syivestre (Retz.)

R.Br ex Schult cho tác dụng tét khang cdc ching Bacillus pumilis,

Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa va Staphylococcus tuy nhién khơng cĩ tác dụng trén Proteus vulgaris va Escherichia coli [52]

©_ Tác dụng kháng viêm: Dịch chiết nước với liều 300 mg/kg làm giảm cĩ ý

nghĩa thống kê thê tích phù so với đối chứng trong mơ hình gây phù chân

chuột bằng dầu hạt bơng

° Tac dung quét gốc oxy hĩa: Dịch chiết nước Gymnema sylvestre (Retz.)

R.Br ex Schult với mức 32 H1 cĩ tác dụng quét 50% gốc diphenyl-I-

picrylhydrazyl (DPPH) [41] 1.1.4 Thành phần hĩa học

Cho đến nay, các nghiên cứu sâu về thành phần hĩa học được tập trung vào lồi Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult với các nhĩm chất triterpene saponin thudc 2 nhém oleane va dammarane Saponin khung Oleane cĩ các acid gymnemic va gymnemasaponins [71, 73], trong khi do saponin khung dammarane là các gymnemasides [29] Trong lá cịn xác định cĩ resine, albumin, chlorophyll, carbohydrates, acid tartaric, acid formic, acid butyric, anthraquinon, alkaloid inositole, acid httu co (5,5%), parabin, calci oxalate (7,3%), lignin (4,8%), cellulose (22%) [59][60][61]

Thành phan tác đụng chính được xác định là acid gymnemic, là tên chung của các acid hữu cơ thuộc nhĩm saponin triferpenoid [27][37][38]I60] Các acid gymmenics là các dẫn chất thế acyl (Tiglolyl, Methyltutylroyl, ) cia deacylgymnemic acid (DAGA) DAGA tương ứng là dẫn xuất thế 3-O-beta- glucoronide của gymemagenin [51] Cấu trúc của Gymnemagenin và 17 loại acid gymnemic được minh họa trong hình 1.2

Trang 22

B-Glucopyranosyl B-gla B-arabino-2 —

(B-glc ) Hexulopyranosyl (B-OG)

II | i Ld

Hình 1.2a: Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

Trang 23

Hình 1.2b: Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult /65/

Thành phần thứ hai được quan tâm nghiên cứu liên quan đến cơ chế hạ đường huyết là Gurmarin (Hình 3), một polypeptid cĩ khả năng làm mất cảm giác ngọt mà khơng ảnh hưởng tới các vị giác khác, được phân lập từ lá Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult [40] [56]

(a)

11 30 aa 37 ag Ae

VX©XSXPXEXT

Hình 1.3: Cấu trúc của Gurmarin [30, 56] 1.1.5 Các nghiên cứu chuẩn hĩa thành phần tác dụng

Trang 24

Hai hướng chính nhằm chuẩn hĩa thành phần tác dụng của Gymnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult là: (1) Chuẩn hĩa theo đơn chất tác dụng được

phân lập và tính khiết hĩa như acid gymnemic, deacylgymnemic acid, gymnemagenin (2) Chuan hĩa theo phân đoạn hĩa học saponin triterpenoid cĩ hàm

lượng acid gymenic cao

a Chuẩn hĩa theo don chat:

* Chuẩn hĩa theo gymnemagenin: Đây là chất chuẩn đánh dấu (marker)

được sử dụng phố biến nhất Gymnemagenin được tạo ra do quá khi thực hiện thủy phân acid gymnemic tồn phân trong điều kiện kiềm và acid [53] [29] SLY Sf po im ~ xxx in ⁄ | x VN —————> sử HN +; am” ayy ƠH pn, - os aoa js ey | 00H [ : et 5L ow sie gc GHẾ: ia ÉP , GIcA - O' ? k = ge er CH,OH Gymnemagenin

Cong thức phân tử :CaoHsoO,s

Khơi lượng phân tử: 506.719 Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng thủy phân acid gymnemic tạo Gymnemagenin [33] * Chuẩn theo acid deacylgymnemic: khi thủy phân acid gymnemic tồn phần trong điều kiện kiềm [66]

Acid deacylgymnemic

Trang 25

Acid gymnemic II | 2- Acetyl | Cơng thức phân tử : C;¿H„;O.;

| methylbutyroyl |

Acid gymnemic III 2- H Khối lượng phân tử: 682.84

| methylbutyroyl

Acid gymnemic IV Tigloyl H

Hình 1.5: Sơ đồ phản ứng thủy phan acid gymnemic tao acid deacylgymnemic [66]

Các phương pháp Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) [66] và sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [48][49] duoc sử dụng để định lượng acid gymnemic trong Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Phuong phap can được sử dụng đề định lượng acid gymnemic tồn phần Phương pháp HPLC được

sử dụng để định lượng acid deacylgymnemic từ dịch chiết lá và phương pháp HPTLC định lượng bằng cách so sánh gymnemagenin trong lá với gymnemagenin

chuẩn [74] Ưu điểm của phương pháp này là cĩ tính chính xác và độ tin cậy cao Tuy nhiên phương pháp này hiện nay cĩ nhiều khĩ khăn khi áp dụng ở Việt Nam

do thiếu chất chuân và khả năng ứng dụng rộng trong sản xuất

b Chuẩn hĩa theo phân đoạn hĩa học

Hoạt chất chính acid gymnemic trong Gymnema syivesfre (Retz.) R Br ex Schult là là hỗn hợp các acid gymnemic từ I-XVII với độ phân cực gần nhau và nồng độ của mỗi acid gymnemic rất nhỏ (0,05-0,12%) nên gây

nhiều khĩ khăn trong phân lập một acid gymnemic đơn độc Do đĩ xu hướng

chung dé chiét xuat tir Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult là tạo tủa GS4 Phổ biến nhất là phương pháp chuẩn hĩa theo GS4 là saponin toan phan,

được tạo thành bằng cách tủa dịch chiết Gymnema syivestre (Retz.) R Br ex

Schult bang HạSO¿ đo saponin trong cây khơng tan trong mơi trường acid Lượng

GS4 xác định bằng phương pháp cân Phương pháp này cho đến nay được áp dụng

rộng rãi do khả năng ứng dụng thực tiễn cao

1.2 NGHIÊN CUU CHI (GYMNEMA R.BR.) O VIỆT NAM

1.2.1 Về đặc điểm thực vật

Mặc dù chưa được xuất bản trong “Thực vật chí Việt Nam” nhưng theo tài liệu cơng bố mới nhất về họ Asclepiadaceae ở Việt Nam của Trần

Trang 26

Thế Bách (2007), chi Gymnema R.Br phan bố ở Việt Nam cĩ 5 lồi là Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall Ex Wight, Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema reticulatum (Moon) Alst va Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult Dé xdc định các lồi này, tác giả đã xây dựng khĩa phan loai cho chi Gymnema R.Br & Viét Nam (Bang 1.4)

sử dụng các đặc điểm phân loại chính của quả và hạt, bao gồm: kích thước

quả, kích thước mào lơng va d6 dai hat [2]

Bảng 1.4 : Khĩa phân loại các loai Gymnema R Br 6 Viét Nam [2]

1A Quả đài hơn 12 cm co co vn cớ 1 G inodorum 1B Quả ngắn hơn 10 cm

2A Mào lơng ngắn hơn 2,6 cm cc sec sec: 2 G yunnanense 2B Mao léng dai hon hay bang 3 cm

3A Chiéu dai hat ngan Hon 0,9 CM cccccececccesesceeeesveeeesseeeeses 3 G sylvestre 3B Chiều đài hạt lớn hơn 1 cm

4A Chiều dài quả ngắn hơn 6 cm; mào lơng ngắn hơn 3,5 mm 4 G latifolium 4B Chiều đài qua dai hon 7 cm; mao léng dai hon 3,5 mm 5 G reticulatum

Một số đặc điểm giải phẫu thân lá của 2 lồi Gymnema syivestre (Retz) R Br Ex Schult va Gymnema latifolium Wall Ex Wight ciing da dugce m6 ta chi tiét trong các nghiên cứu của Đỗ Anh Vũ [18] và Pham Van Hai [11] 1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hĩa học

Bằng các phản ứng định tính thường quy, Phạm Văn Hải đã xác định các thành phần chính cĩ trong một đại diện của chi là Œyznmnema latjfolium Wall Ex Wight gồm các nhĩm chất saponin, tanin, flavonoid, acid amin, đường khử và coumarm [11]

Trần Văn Ơn và cộng sự (2009) đã khảo sát và xây dựng quy trình tối ưu chiết phân đoạn saponin triterpenoid GS4 từ Dây thìa canh (Gymnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult) Cac diéu kién chiét xuat tối ưu được xác định là: Kích thước bột được liệu (Bột nửa mịn), Phương pháp chiết xuất

(Ngắm kiệt), Dung mơi chiết xuất (Ethanol 40), pH trong phản ứng acid hĩa

Trang 27

(pH 1-3), pH trong phản ứng kiềm hĩa (pH 11) Sơ đồ chiết xuất tối ưu GS4

được trình bày trong hình 1.6 [10] Bột lá (1000g) Chiết ngắm kiệt Ethanol 40 3 # Dịch chiết Ba duoc ligu + Cơ cách thủy Cao lỏng 1:2 pH3 H;S§O¿ 5% Dịch lỏng cĩ tủa Loc lay tua, say ở 60°C Dich loc “—— " | GS3 —r KOH 0,1M Dịch hịa tan pH3 | H;5O¿ 5% Dịch lỏng cĩ tủa Dịch lọc #-— Lọc lấy tủa, say & 60°C * GS4 (50g) Hình 1.6: Quy trình tối ưu hĩa chiết xuat GS4 tir Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

Từ phân đoạn GS4 này, hai chất tinh khiết đã được tỉnh chế và xác định cấu trúc là GS4A1 (Myrtillogenic acid) và GS5F2 (Glochioeriosides A)

(Hình 1.7)

Trang 28

GS4A1 GS5F2

(Myrtillogenic acid) (Glochioeriosides A)

Hình 1.7 : Cấu trúc hĩa học của 2 hợp chat GS4A1 va GS5F2 [10] 1.2.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học

Thử nghiệm trên mơ hình gây tăng đường huyết bởi STZ do Đỗ Anh

Vũ thực hiện cho thấy cao lỏng lá Dây thìa canh (Gymnema syivestre (Retz) R Br ex Schult) cĩ tác đụng hạ đường huyết trên cả lơ chuột bình thường (mức độ hạ cao nhất là 37,58%) và trên lơ chuột ĐT bởi STZ (mức độ hạ cao nhất là 27,81%) Tác dụng đỉnh ở 2h và kéo đài đến 4h Khẳng định thêm một trong những cơ chế hạ đường huyết của Dây thìa canh là kích thích đảo tụy tiết insulin [18] Qua đĩ, liều sử dụng đề xuất đối với cao lỏng 1:2 là

0,5ml/25z (10g lá khơ/ kg)

Thử nghiệm củng với mơ hình trên với đối tượng là Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight.) cũng cho tác dụng tương tự khi dịch chiết cồn cĩ tác dụng hạ đường huyết trên thực nghiệm cả ở chuột thường và chuột đã gây tăng đường huyết bằng STZ [1 I]

1.2.4 Các vấn đề tồn tại

Sau 5 năm kể từ cơng bố khoa học đầu tiên trong nước theo hướng nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của cây Dây thìa canh cĩ nguồn gen trong nước, các nội dung nghiên cứu đã thực hiện: 1 Mơ tả đặc điểm thực vật, giải phẫu; 2 Khảo sát định tính các thành phần hĩa học, chiết xuất và định lượng phan doan saponin triterpenoids GS4; va 3 Danh gia tac dung hạ đường huyét cia 2 loai Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult va Gymnema latifolium Wall ex Wight.) Cac nghién cứu tuy mới ở bước đầu sơ khai nhưng với các kết quả thu được, cùng với các dữ liệu khoa học đã được

Trang 29

chứng minh trên thế giới đã cho thấy tiềm năng phát triển của các dược liệu

trong chỉ Gymnema R.Br tại Việt Nam theo hướng điều trị Đái tháo đường

hoặc mở rộng thêm các hướng điều trị bệnh mới

Thực tế thị trường Việt Nam đã chứng minh điều này khi hiện nay đã

xuất hiện các sản phẩm cĩ nguồn gốc trong và ngồi nước hỗ trợ điều trị đái tháo đường mà trong thành phần cĩ dược liệu Dây thìa canh nhự Diabetna

(Cơng ty cỗ phần Dược phẩm Nam Dược), DK-betic (Cơng ty Dược Khoa), TD-Care (Cơng ty Việt Đức), Trà kháng đường Glucocare (Cơng ty Từ Tâm - nhập khẩu từ Singapore), Vinabetes (Oceanpharm),.v.v Do vậy, việc tiếp tục mở rộng nghiên cứu các dược liệu trong chi Gymnema R.Br ở Việt Nam

là cần thiết Các định hướng cĩ thê mở rộng nghiên cứu bao gồm:

1 Nghiên cứu chuẩn hĩa các dược liệu Dây thìa canh đang được sử

dụng phơ biến hiện nay trong nước bao gồm: GŒymnema syivesire (Retz) R

Br va Gymnema latifolium Wall ex Wight.) Các nội dung cần nghiên cứu bao gồm: Khảo sát tính đa dạng về nguồn gen, vùng trồng, điều kiện chăm

sĩc, thời điểm thu hái, tương quan với sự tích lũy hoạt chất trong cây;

2 Khảo sát đánh giá tác dụng hạ đường huyết của các lồi khác, trên

cơ sở đĩ đánh giá các điều kiện chi phí-an tồn-lợi ích để lựa chọn lồi cho

hiệu quả cao nhất khi áp dụng thực tiến

3 Nghiên cứu chứng minh sự an tồn của các lồi trong sử dụng và hồn tất các nghiên cứu để hồn hồ sơ thứ nghiệm lâm sàng nhằm cung cấp những bằng chứng khoa học vững chắc để cĩ thể ứng dụng phát triển thành các thuốc thảo dược điều trị bệnh

Trang 30

CHUONG II

DOI TUQNG, PHUONG PHAP NGHIEN CUU 2.1 NGUYEN VAT LIEU NGHIEN CUU

Mẫu nghiên cứu hình thái và giải phẫu: 24 mẫu thuộc các lồi khác nhau trong chỉ Gymnema R.Br dugc thu tai các địa điểm khác nhau trong phạm vi lãnh thổ Việt Nam Riêng 2 mẫu được phát hiện và thu ở vùng

Bolikhamxay —- Cộng hịa dân chủ nhân dân Lào cũng được đưa vào trong

nghiên cứu do chúng phân bố gần biên giới Việt Lào cĩ điều kiện khí hậu tương tự như vùng Trung Bộ và Tây nguyên của Việt Nam Một mẫu khác chi Gymnema R.Br la Thién ly (Telosma cordata Burm.f Merr.) duge swt dụng với mục đích đối chứng trong việc nghiên cứu tách lồi Trong đĩ cĩ 11

mẫu thu đầy đủ cơ quan dinh dưỡng và cơ quan sinh sản, 18 mẫu chỉ thu

được cơ quan dinh dưỡng Các mẫu được xử lý theo quy trình xử lý mẫu tiêu bản và lưu trữ tại phịng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP)

Mẫu nghiên cứu đa dạng di truyền: 27 mẫu lá được thu tươi, bảo quản trong silicagel hoặc làm lạnh bảo quản trong tủ lạnh sâu -26°C

Mẫu nghiên cứu hĩa học: Mẫu đại diện của các lồi được thu để

nghiên cứu so sánh thành phần hĩa học giữa các lồi hoặc mẫu trong cùng một lồi trong điều kiện chăm sĩc khác nhau Danh sách và bản đồ phân bố các mẫu nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.1 và Phụ lục 1

2.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thực địa: Tại các địa điểm thu mẫu theo danh sách trong

Bảng 2.1

Nghiên cứu thực vật: Tại Bộ mơn Thực vật — trường đại học Dược

Hà Nội

Nghiên cứu da dạng di truyền: Tại Bộ mơn Thực vat — Truong Đại học Dược Hà Nội, Bộ mơn Kỹ thuật di truyền — Viện DI truyền Nơng nghiệp

Trang 31

Nghiên cứu hĩa học: Bộ mơn Thực vật —- Đại học Dược Hà Nội; Phịng thí nghiệm Dược liệu - Khoa Dược - Đại học Quốc gia Seoul (Hàn Quốc)

Bảng 2.1 Vị trí nơi thu các mẫu trong nghiên cứu

Mẫu Cơ Nghiên

Thời

~ nghién | quan = ctu

Stt Noi thu mau gian thu

~ cứu sinh | hĩa

mau

ADN san hoc

M1 | Tra Cé - Mong Cái - Quảng Ninh 5/2011 X

M2 Thanh Lân- Cơ Tơ - Quảng Ninh 8/2011 x

Mũi Né — Phan Thiết — Bình M3 3/2011 x x Thuan Hon Mun — Nha Trang — Khanh M4 11/2011 X Hịa Mã Bolikhamsay-CHDCNDLào 2/1011 X X X M6_' Lục Nam - Lục Nam- Bắc Giang 3/2012 X M7 Tiop-HạLong-QuảngNinh 8/2011 X Vườn thực vật Đại học Dược Hà M8 6/2012 X X X Nội (21.020884,105.858566) ' Yên Ninh - Phú Lương - Thái M9 3/2012 X X X Nguyên ( 21.885952,105.764394) Yên Ninh - Phú Lương - Thái MI0 3/2012 x x x Nguyên ( 21.885952,105.764394) ' Vên Ninh - Phú Lương Thái _ M11 8/2011 X X X Nguyên (21.885952,105.764394)

Trang 32

Bảng 2.1 Vị trí nơi thu các mẫu trong nghiên cứu Mau | Co | Nghién Thời

nghiên | quan cứu

Stt Noi thu mau gian thu

- cứu sinh hĩa

mau

ADN san hoc

Thi tran Ctra Viét — Gio Linh — M15 5/2011 X Quảng Trị Dak man — Dak Lei — Kon tum M16 8/2011 X X X (15.207006,107.738628, 392m) M17 Na Dương- Hà Đơng-HàNội 6/2012 X ' Xã Đạo Trù- TamĐảo-Vĩnh _ M18 3/2012 X Phúc

MI19 Đại Hiệp - Đại Lộc - Quảng Nam 7/2010 xX

M20 ' Vườn quốc gia Ba Bê - BắcKạn 5/2012 X

Minh Khai — Hai Ba Trung - Ha M21 8/2011 X X Nội Thung Nai — Cao Phong - Hịa M22 8/2011 X X Bình

M23 | Long Son- Kim B6i— Hoa Binh 9/2011 X M24 | Tam Dao — Vinh Phúc 7/2012 X M25 ' Bolikhamsay-CHDCNDLào 2/1011 X Yên Nguyên _ Chiêm Hĩa - | M26 8/2012 X Tuyên Quang Vườn thực vật Đại học Dược Hà M27 2/1011 X Nội

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu hình thái và giải phẫu

2.3.1.1 Phân tích hình thái

Trang 33

Mơ tả phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo

phương pháp mơ tả phân tích [1]|4] Trong nghiên cứu các đặc điểm được

mơ tả, thuộc các nhĩm Dạng sống, Thân, Lá, Hoa, Quả, Hạt (Bảng 2.2) Dụng cụ sử dụng trong phân tích bao gồm: Kính lúp soi nỗi Leica EZ4 , máy ảnh kỹ thuật số chụp trực tiếp (Canon EOS 60D + Tamron 60mm f2.0 Macro) hoặc máy ảnh chụp qua kính lúp soi nổi (Canon SD450018)

Bảng 2.2 : Đặc điểm hình thái mơ tả các lồi trong chỉ Gymnema R.Br

2.3.1.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu

Tiêu bản của thân, lá được làm theo phương pháp cắt, tây và nhuộm kép Tiêu bản được soi và chụp ảnh qua kính hiển vi Kruss ở các vật kính x4, x10, x40 sử dụng máy ảnh Canon SD45001S Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của thân và lá được mơ tả và phân tích theo nguyên tắc nghiên cứu tiêu bản vi phẫu [4]

2.3.1.3 Xác định tên khoa học

Tên khoa học được xác định dựa trên khĩa phân loại và mơ tả lồi trong các tài liệu thực vật trong nước (Khĩa phân loại của Trần Thế Bách [2] , các bản mơ tá trong sách Cây cĩ Việt Nam (Tập 2, 2000) của Phạm Hoang

Trang 34

Hộ [12], Từ điển thực vật thơng dụng của Võ Văn Chi [7]) và các tài liệu ngồi nước (Thực vật chí Trung Quốc [23], Thực vật chí Đài Loan [34], Thực vật chí Đơng Dương[25]) Các mẫu sau khi tra khĩa được so sánh đối

chiếu với các tiêu bản type hoặc isotype của từng lồi tham khảo từ mẫu lưu tại phịng tiêu bản Paris, New York và Kew (nếu cĩ)

2.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền

2.3.2.1 Tách chiết ADN tổng số

ADN của 27 mẫu nghiên cứu được tách chiết sử dụng phương pháp

CTAB theo quy trình của Doyle và Doyle cĩ cải tiến [24] ADN tổng sau khi tách chiết được kiểm tra về nồng độ và chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% đối chiếu với thang ADN chuẩn [17]

Dụng cụ tách chiết ADN bao gồm: Chày cối sứ, máy ly tâm tốc độ cao cho ống nhỏ để bàn Eppendorf 5415R, Tủ lạnh sâu -30°C, bể ổn nhiệt Memmert WNBI0 Các hĩa chất sử dụng đạt tiêu chuẩn trong nghiên cứu sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck, bao gồm: Tris base, Boric acid, NaCl, EDTA, Ethanol, Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, 2-propanol, PVP-40.000, Acetic acid glacial, SDS, Ribonuclease

Trang 35

Quá trình nhân bản ADN được thực hiện theo chu trình nhiệt: Khởi

động nĩng 94°C trong 5 phút Tiếp theo là 38 chu kỳ: 94°C trong 1 phút; 34°C trong 1 phút 20 giây; 72°C trong 1 phút 35 giây Pha tơng hợp cuối cùng 72°C trong 4 phút

1.3.2.3 Phân tích tính đa dạng di truyền

Sản phẩm khuếch đại được phân tích trên gel điện di Agarose 1,2% theo từng mùi riêng biệt chạy ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút bằng phương

pháp nhuộm hiện hình với Ethidium Bromide Kích thước tương đối của các

băng khuếch đại được so sánh với Ladder chuẩn 1kb (Fermentas, lkb ADN Ladder) Tổng cộng 40 mơi đã được khảo sát, trong đĩ cĩ 16 mỗi cĩ xuất hiện các băng đa hình (Bảng 2.4)

Bảng 2.4: Các mỗi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

ơ-``đđ >

Trang 36

Da đạng đi truyền của các mẫu được thống kê trên kết quả điện đi sản phẩm PCR của 16 mùi trên Sự cĩ mặt của các băng di truyền được ghi nhận theo từng cặp mẫu-mỗi và mã hĩa nhị biến là 1 (cĩ băng di truyền) và 0 (khơng cĩ băng di truyền) Hệ số đồng đạng di truyền Sị cua cac mau thudc chi Gymnema R.Br dugc tinh theo cơng thức cla Nei&Li [39] 2 Ni an Ni +N; Trong đĩ: Si : Hệ số đồng dạng di truyền

Nụ : Số băng chung của hai lồi ¡ và j

N; : S6 bang ctia loai i

N; : Số băng của lồi j

1.3.2.4 Xây dựng cây phân loại

Trên cơ sở bảng hệ số đồng dang di truyền của 27 mẫu nghiên cứu, cây phả hệ của các mẫu nghiên cứu được thiết lập sử dụng phép phân tích

chùm theo phương pháp khoảng cách liên kết trung bình UPGMA

(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages) sử dụng phần mém NT-SYS PC 2.02h (Numerical Taxonomy System Applied Biostatistics, New York)

2.3.3 Nghiên cứu hĩa học

2.3.3.1 Định tính thành phần hĩa học

08 mau thuộc ĩ6 lồi trong chi Gymnema R.Br xac dinh diya trén đặc điểm thực vật được lựa chọn tiếp tục nghiên cứu hĩa học nhằm phân tích sự tương đồng và khác biệt về thành phần hĩa học tương ứng với sự khác biệt về đặc điểm thực vật Riêng lồi Gymnema syivestre (Retz.) R Br ex Schult cĩ 3 mẫu cĩ sự khác nhau về màu sắc hoa là đỏ, vàng và trắng nhưng được trồng và chăm sĩc và thu hái trong cùng một điều kiện tập trung giống nhau

Trang 37

Chudn bi dich chiét: Can 10g dược liệu, chiết siêu âm với n-hexan trong 60 phút Loại bỏ dịch chiết n-hexan Cắn tiếp tục được chiết siêu âm 3 lần với MeOH trong 60 phút Dịch chiết được cơ về thể tích 10ml

Định tính sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Dich chiét methanol 1g/ml của các mẫu nghiên cứu được lọc qua màng milipore 0,45 nm để triển khai trong hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Water 2690 với detector PDA 996 Triển khai sắc ký với cột sắc ký Thermo Hypersil Gold (C18 — 5um, 250L x 4,6 mm) với dung mơi pha động là Acetonitryl:H;0, nhiệt độ cột là 27C Quy trình gradient triển khai sắc ký

được trình bày trong Hinh 2.1

ACM

ũ 10 M 22 ?ư 3p — Thởi gian i3)

Hình 2.1: Chu trình gradient HPLC áp dụng trong nghiên cứu Dịch chiết methanol tồn phần được phân đoạn lần lượt sử dụng các

dung mơi n-hexan, ethyl acetate và n-butanol Hai phân đoạn ethyl acetate và n-butanol được thủy phân sử dụng acid chlohydric 2,5N 50% trong 2h và

KOH 11% trong 2h (hình 2.2) Dịch chiết thuỷ phân cuối cùng được chạy sắc

ký theo quy trình triển khai trong hình 2.1 và so sánh với sắc ký đồ của

gymnemagenin chuẩn (Chromadex)

Trang 38

løf?F4 siêu iăn 8Ư piuii x 5 lần: HE! 2,5NM/MaOHl 2%

CăI thái fide that) ơi Hới lưu Ereren 2h

tỏa rạn lại rome rate va an LOC

| [ee

Dịch chiết nước Bã dược liệu

Loại chất lieu Làng m-Ìee2z1 Ko H/MeằH 2%

„ Hếi luu 2h

ị „ Bay lai thu cần

Dich chidt nude | „ Hồ tan cần lại trong 1 en! MeOH

Palin cheers wil 4

rưlacveste | Dịchhiết MaOH ' Dich chiết nước Loc qua 0.45 um milispore LXch chiết nLiớt

Hình 2.2: Quy trình chiết phân đoạn và thuỷ phân các mẫu nghiên cứu 2.3.3.2 Định lượng phân đoạn GX4

Quy trình chiết xuất các mẫu nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ mơ tả trong Hình 2.3 đã được áp dụng quy trình chiết xuất phân đoạn GS4 trong Day thia canh Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult được thực hiện bởi Trần Văn Ơn năm 201 1[14] Các cơng đoạn chính bao gồm:

- Chuẩn bị nguyên liệu: lá được xay tới bột thơ, say khơ ở 45), Dược liệu được thấm 4m bang ethanol 40° và đậy kín trong 2 giờ rồi nạp vào thiết

bị chiết

- Chiết xuất được liệu: lĩt một lớp bơng thấm nước lên trên ống thốt

dịch chiết để bột được liệu khơng gây tắc bình và lẫn vào dịch chiết Sau đĩ

đặt giấy lọc đã cắt vừa vặn vào đáy bình Cho từ từ bột được liệu đã được làm 4m vào bình, vừa cho vừa san đều và nén nhẹ Đỗ dung mơi vào bình chiết cho tới khi cĩ vài giọt chảy ra thì đĩng khĩa lại Tiếp tục đỗ dung mơi tới ngập mặt được liệu 3-4cm Ngâm lạnh trong 48 giờ Hết thời gian ngâm

Trang 39

lạnh, mở khĩa cho dịch chiết chảy ra với tốc độ là 20 giot/phút Chú ý cho thêm dung mơi đảm bảo ngập mặt dược liệu từ 2-3cm Bot la | 100g) L hie{ r ram kiet ký Ethanol +17 Baduoc liéu ~* Dich chiet Co cach thiy ¥ Cao lũng Ì:2 pH 3 | 1; SUL 5 mm " Dich lony oo tua Dịth lạc “>2 L XE Lọc lẫy tủa sả ở Gữ”C GAS | HH 1] +—_ KOH 0.1 M4 1 Dich hoa tan pH 3 moan H:5( 5% +

Dich lono ob tua

Dịch lục " Loc lay tia, sa¥ o 60°C

UX4 |

Hình 2.3: Quy trình chiết xuất GX4 trong nghiên cứu

- Dịch chiết thu được đem cơ cách thủy tới cao lỏng 1:2 (thể tích cao/khối lượng dược liệu)

Trang 40

- Tạo GX:: Nhỏ từ từ dung dịch H;SOa 5% vào cao 1:2 cho tới pH 3, vừa nhỏ vừa khuấy đều, dung dịch sẽ tạo tủa (GX3) Làm lạnh ở 4°C, thấy xuất hiện tủa, để dung dịch tạo tủa hồn tồn, ly tam dé lay tha GX3

- Tạo GX4: Hịa tan tủa thu được ở trên (GX3) trong dung dịch KOH

0,1M tới pH 11 Nhỏ từ từ dung dịch H;S5O¿ 5% vào cho tới pH 3, vừa nhỏ

vừa khuấy đều, dung dịch sẽ tạo tủa (GX4) Làm lạnh dịch cĩ tủa ở 4°C dé dung dịch tạo tủa hồn tồn, ly tâm để lấy tủa Tủa tạo thành được sấy tới khối lượng khơng đơi ở 60° và cân để xác định khối lượng GX4

Ty lệ GX4 được xác định theo cơng thức Mx % GX4 = x 100% Mpr X (100 —h)

Trong đĩ: % GX4: Tỷ lệ % GX4 thu được từ mẫu nghiên cứu

mx : là khối lượng cắn GX4 cuối cùng cân được (g) Mạ, là khối lượng dược liệu ban đầu (g)

h : Hàm ẩm dược liệu (%) 2.3.3.3 Định tính phân đoạn GX4

Chấm mẫu dịch chiết của 8 mẫu nghiên cứu trên bản mỏng silicagel sử dụng hệ thống chấm mẫu bán tự động Linomat 5 (tốc độ chấm mẫu 150n1/s, thể tích chấm mẫu 2l) Triển khai mẫu trong bình triển khai tự động ADC?2 (hệ dung mơi khai triển Chloroform:methanol (25:15), bão hịa dung mơi trong 2 phút, khoảng cách khai triển 70mm)

Định dạng
Số trang	85
Dung lượng	14,28 MB