Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng chống oxy hóa của hạt bình bát

MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ iv DANH MỤC CÁC BẢNG v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY BÌNH BÁT 1.1.1 Giới thiệu Bình bát 1.1.2 Mô tả thực vật 1.1.3 Phân bố, sinh thái 1.1.4 Bộ phận dùng 1.1.5 Công dụng của Bình bát 1.1.6 Tác dụng dược lý 1.2 SƠ LƯỢC VỀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA 1.2.1 Chất oxy hóa – Chớng oxy hóa 1.2.2 Một số phương pháp xác định tác dụng chớng oxy hóa 1.3 TỞNG QUAN ĐỘC TÍNH CẤP 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Nguyên tắc CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 ĐỐI TƯỢNG, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 11 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 11 2.1.3 Dung mơi hóa chất 12 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.2.1 Phương pháp chiết ngấm kiệt 12 2.2.2 Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu 13 2.2.3 Xác định độ tinh khiết của cao chiết 15 2.2.4 Định tính xác định sự hiện diện của hợp chất alkaloid phương pháp hóa học 15 i 2.2.5 Định tính xác định sự hiện diện của hợp chất alkaloid phương pháp SKLM 15 2.2.6 Xác định hàm lượng alkaloid toàn phần phương pháp cân 16 2.2.7 Phương pháp thử nghiệm độc tính cấp đường ́ng 17 2.2.8 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chớng oxy hóa 18 3.1 KẾT QUẢ 20 3.1.1 Chiết xuất cao 20 3.1.2 Kết thử tinh khiết nguyên liệu cao 20 3.1.3 Kết định tính nguyên liệu cao chiết phản ứng hóa học 22 3.1.4 Kết định tính sự hiện diện của hợp chất alkaloid phương pháp sắc ký lớp mỏng 23 3.1.5 Kết định lượng 25 3.1.6 Kết thử đợc tính cấp cḥt 25 3.1.7 Kết chớng oxy hóa của cao hạt Bình bát 27 3.2 BÀN LUẬN 29 3.2.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu ban đầu tiêu chuẩn sở của cao chiết cồn hạt Bình bát 29 3.2.2 Tính an tồn của cao chiết hạt Bình bát 30 3.2.3 Hoạt tính chớng oxy hóa in vitro thơng qua thử nghiệm MDA 30 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 4.1 KẾT LUẬN 31 4.2 KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1: PL-1 PHỤ LỤC 2: PL-2 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt DĐVN Vietnamese Dictionary Dược Điển Việt Nam EtOAC Ethyl acetat Ethyl acetat HTC Antioxidant activity Hoạt tính chớng oxy hóa MeOH Methanol Cồn SKLM Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng iii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1 Hoa Bình bát 03 Hình 2.1 Hạt bợt hạt Bình bát 12 Hình 2.2 Phương trình tạo phức màu MDA acid thiobarbituric 19 Hình 3.1 Phản ứng định tính alkaloid nguyên liệu 22 Hình 3.2 Phản ứng định tính alkaloid cao chiết 22 Hình 3.3 Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất alkaloid nguyên liệu cao chiết hệ 23 Hình 3.4 Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất alkaloid nguyên liệu cao chiết hệ 24 Hình 3.5 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào não cḥt của cao chiết hạt Bình bát 28 Hình 3.6 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào não chuột của thuốc đối chiếu Trolox 29 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Kết độ ẩm của nguyên liệu cao chiết 20 Bảng 3.2 Kết đợ tro tồn phần của ngun liệu cao chiết 21 Bảng 3.3 Kết độ tro không tan acid của nguyên liệu 21 Bảng 3.4 Kết định lượng alkaloid toàn phần nguyên liệu cao chiết 25 Bảng 3.5 Kết thử đợc tính cấp 26 Bảng 3.6 Kết thử test MDA của mẫu cao hạt Bình bát 27 Bảng 3.7 Kết thử test MDA của thuốc đối chiếu Trolox 28 v Khóa ḷn tớt nghiệp Dược sĩ đại học – Năm học 2017 – 2018 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA CỦA HẠT BÌNH BÁT ANNONA RETICULATA L ANNONACEAE Trần Thị Thanh Tuyền Hướng dẫn khoa học: ThS La Hồng Ngọc Mở đầu: Loài Bình bát (Annona reticulata L.) là loại quen thuộc với người dân đồng sông Cửu Long chưa nhận nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Kết nghiên cứu đợc tính và khả chống oxy hóa của hạt Bình bát (Annona reticulata L.) sẽ có ý nghĩa quan trọng đối với ngành dược học Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: hạt Bình bát Annona reticulata L Annonaceae thu hái huyện Chợ Gạo,Tiền Giang Phương pháp nghiên cứu - Chiết cao, định tính, định lượng nguyên liệu cao chiết - Thử nghiệm đợc tính cấp đường ́ng - Khảo sát hoạt tính chớng oxy hóa phương pháp xác định hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào Kết Hiệu suất chiết cao đạt 12.55% Định tính phương pháp hóa học SKLM có hợp chất alkaloid Định lượng alkaloid toàn phần trong cao chiết có hàm lượng (64,51%) cao gấp 5,7 lần so với nguyên liệu (11,24%) Cao hạt Bình bát thể hiện đợc tính cấp đường ́ng với LD50 6,7g cao hạt Bình bát/kg cḥt Mẫu hạt Bình bát có IC50 = 28,96 (µg/ml), khả bắt gớc tự tăng dần theo nồng độ khảo sát Kết luận vi Dịch chiết của nguyên liệu và cao cho phản ứng dương tính với th́c thử alkaloid Hàm lượng alkaloid tồn phần cao cao ngun liệu Đợc tính cấp của cao chiết qua đường uống xác định LD50 = 6,7g/kg Hoạt tính chớng oxy hóa in vitro thử nghiệm MDA của cao chiết có IC50 = 28,96 (µg/ml) tương đương với th́c đới chiếu Trolox có IC50 = 28,32(µg/ml) Từ khóa: alkaloid, đợc tính cấp, chớng oxy hóa, MDA, Annona reticulata, vii Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2017 - 2018 ANALYTICAL RESEARCH ON ACUTE TOXICITY AND ANTIOXIDANT OF CUSTARD APPLE SEED (ANNONA RETICULATA L ANNONACEAE) Author’s name: Tran Thi Thanh Tuyen Supervisor: M.S La Hong Ngoc Introduction Annona reticulata L is very familiar, especially to people living in the Mekong Delta but has not received much attention from researchers I chose and conducted the study because of results on the acute toxicity and antioxidant capacity of Annona reticulata L will have important implications for the pharmacy industry Marterial: Annona reticulata L Annonaceae was collected in Cho Gao district, Tien Giang Methods: - Extreme, qualitative, quantitative materials and extracts - Oral toxicity test - Survey on in vitro antioxidant activity by determining the activity of lipid peroxidation inhibitor Results High extraction efficiency reach 12,55% Qualitative tests for the presence of alkaloid by chemical methods and thin layer chromatography have demonstrated that both have alkaloid compounds The total amount of alkaloid in the extract was 64,51% higher than that of the material (11.24%) Acute Toxicity: High grade acute vascularity and LD50 of 6.7 g/kg In vitro antioxidant activity: The antioxidant activity of IC50 = 28,96 μg/ml, the ability of free radical capture increased with the concentration of survey Conclusion The extracts of the raw materials and the high concentrations were positive for the alkaloid reagents viii Acute Toxicity: High grade acute vascularity and LD50 of 6.7 g/kg The in vitro antioxidant activity in the MDA test of IC50 extracts was 28,96 (μg/ml) equivalent to the Trolox counterpart with IC50 = 28.32 (μg / ml) Keywords: alkaloid, acute toxicity, antioxidant, MDA, IC50, Annona reticulata L… ix ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống ngày xuất hiện ngày nhiều bệnh mới lạ, nguy hiểm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống người, mà một nguyên nhân gây bệnh cho người phải nói đến chất oxy hóa (gớc tự do), chất oxy hóa superoxid, gốc hydroxy tự hay hydroperoxid gây nên gần 200 bệnh khác bao gồm bệnh viêm khớp, hen suyễn, trí nhớ, Parkinson,… thậm chí là ung thư Nhiều tác nhân gây gốc tự thứ gần gũi với cuộc sống tia tử ngoại, thức ăn, nhiễm khuẩn stress, khơng khí, mơi trường ô nhiễm, thuốc lá,….Việc sử dụng tác nhân chớng oxy hóa với khả chớng lại gớc tự xem phương pháp tiếp cận đầy hứa hẹn việc phòng chớng lão hóa và ngăn ngừa nguy bệnh tật Các vitamin E, A, C, flavonoid, polyphenol, polysaccharid, triterpenoid,…được biết đến chất có tác dụng chớng oxy hóa có nhiều loại hoa quả, đặc biệt loại có màu sắc trà xanh, café, việt quốc, dâu tây,… Gần nhiều nhà nghiên cứu giới và nước đã nghiên cứu khả chớng oxy hóa của thuốc vị thuốc cổ truyền dùng y học dân tợc có hoạt tính chớng oxy hóa cao Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có nguồn dược liệu vơ phong phú Và loài Bình bát (Annona reticulata L.) là loại quen thuộc đặc biệt là với người dân sống tại đồng sông Cửu Long chưa nhận nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu, nghiên cứu loại Bình bát này cho thấy có nhiều tác dụng dược lý khác như: chớng oxy hóa, chớng ung thư, giảm đau và ức chế thần kinh trung ương, sốt rét, tẩy giun, giang mai,[11]….Nhiều nghiên cứu lại tập trung vào phần cũng có nghiên cứu phần hạt chỉ chú trọng đến các thành phần hóa học hạt [8],[16], tác dụng hoạt chống oxy hóa và các độc tính của phần hạt cũng cần tìm hiểu kĩ giúp đánh giá tính an toàn của dịch chiết từ hạt Bình bát (Annona reticulata L.) nước ta Kết nghiên cứu đợc tính và khả chống oxy hóa của hạt Bình bát (Annona reticulata L.) sẽ có ý nghĩa quan trọng đối với ngành dược học đèn UV 254nm Tuy nhiên bên sắc ký đồ hình 4.3.B ta nhìn thấy vết tương đồng giá trị Rf, màu sắc hình dạng của nguyên liệu cao chiết sau ta phun với thuốc thử Dragendorff Điều chứng tỏ nguyên liệu cũng cao chiết có chứa hợp chất alkaloid Hệ 2: chloroform: methanol: nước: toluen ( : : 0,5 : 0,5) Rf = 0,94 Rf = 0,80 Rf = 0,80 Rf = 0,71 Rf = 0,71 Rf = 0,47 Rf = 0,47 A B Hình 3.4 SKLM định tính hợp chất alkaolid nguyên liệu cao chiết hệ Chú thích: A: Sắc ký soi dưới đèn UV 254nm B: Sắc ký sau phun th́c thử Dragendorff Nhận xét: Trên sắc kí đồ bên hình 3.4.A ta có thể nhìn thấy có vết tương đồng giá trị Rf, màu sắc hình dạng của nguyên liệu cao chiết soi dưới đèn UV 254nm Tuy nhiên bên sắc ký đồ hình 3.4.B ta nhìn thấy vết tương đồng giá trị Rf, màu sắc hình dạng của nguyên liệu cao chiết sau ta phun với thuốc thử Dragendorff Điều chứng tỏ nguyên liệu cũng cao chiết có chứa hợp chất alkaloid 24 3.1.5 Kết định lượng Bảng 3.4 Kết định lượng alkaloid toàn phần nguyên liệu cao chiết Nguyên liệu Lần Lần Cao chiết Lần Khới lượng bì (g) 34,5582 46,9741 59,4383 Khới lượng mẫu (g) 1,0004 1,0001 34,6631 47,0786 59,5475 Khối lượng bì mẫu sau cắn (g) Hàm lượng (%) Trung bình 11,11 11,06 1,0003 11,56 11,24 ± 0,16 Lần Lần Lần 107,2520 171,0963 113,9051 0,5001 0,5001 0,5005 107,5172 171,3247 114,139 70,57 60,78 62,19 64,51 ± 3,06 Nhận xét: Kết định lượng alkaloid toàn phần nguyên liệu cao chiết hạt Bình bát 11,24% 64,51% 3.1.6 Kết thử đợc tính cấp chuột Sơ khởi: Cao hạt Bình bát pha với nước cất nồng độ đậm đặc có thể bơm qua kim đầu tù cho cḥt ́ng Cḥt thử nghiệm cho ́ng cao hạt Bình bát với liều tối đa có thể bơm qua kim là 12,5 g/kg cḥt với thể tích 0,2 ml/10 g thể trọng có tỷ lệ chết 100%, giảm liều theo phương pháp của GS Đỗ Trung Đàm cho kết quả: LD0 = 2,5 g/kg LD100 = 10,5 g/kg 25 Giai đoạn xác định Bảng 3.5 Kết thử nghiệm đợc tính cấp Sớ cḥt lơ n Liều cao hạt Bình bát Số chuột chết lô (con) (g/kg) (con) 10 12,5 10/10 10 10,5 10/10 10 8,5 8/10 10 6,5 4/10 10 4,5 2/10 10 2,5 Lô Từ bảng 3.5 ta suy LD50 theo theo phương pháp Karber – Behrens Ta có: Df = 10,5 a23 = b23 = a34 = b34 = a45 = b45 = a56 = b56 = LD50 = 10,5 –     3  1 10 LD50 = 6,7 g/kg Nhận xét biểu chuột sau uống cao hạt Bình bát: Sau cho cḥt ́ng cao hạt Bình bát, qua quan sát, theo dõi biểu hiện hoạt động của chuột sau uống cao hạt bình bát 72 giờ 14 ngày Cḥt mức liều 12,5 g/kg 10,5 g/kg sau 30 phút uống cao nằm im chết hết sau giờ, mổ quan sát đại thể không thấy tổn thương gan, tim, thận, dạ dày, ruột Chuột mức liều 8,5 g/kg; 6,5 g/kg 4,5 g/kg sau uống 30 phút, chuột giảm hoạt động, lừ đừ nằm im, sau 72 giờ một số chuột mỗi lô bị chết, mổ quan sát đại thể không thấy tổn thương gan, thận, dạ dày, ṛt; sớ lại trở hoạt động và ăn uống linh 26 hoạt, quan sát thêm 14 ngày sớ lại hoàn toàn bình thường Cḥt mức liều 2,5 g/kg sau uống lừ đừ, giảm hoạt động, nằm im, sau 30 phút bắt đầu vận động, sau giờ ăn uống lại sau giờ vận động và ăn uống linh hoạt, quan sát thêm 14 ngày tồn bợ cḥt bình thường 3.1.7 Kết chống oxy hóa cao hạt Bình bát Bảng 3.6 Kết thử test MDA của mẫu cao hạt Bình bát Nồng đợ ban đầu (µg/ml) Nồng đợ phản ứng (µg/ml) Chứng OD Lần Lần TB 0,419 0,423 0,421 HTCO % 2000 100,0 0,069 0,066 0,068 83,97 1000 50,0 0,140 0,143 0,142 66,39 750 37,5 0,175 0,177 0,176 58,19 500 25,0 0,245 0,233 0,239 43,23 250 12,5 0,311 0,326 0,319 24,35 100 5,0 0,386 0,415 0,401 4,87 Từ bảng 3.6 xây dựng phương trình logarit y = 27,125ln(x) - 41,304; R2= 0,9937 Suy IC50 = 28,96 (µg/ml) 27 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào não chuột (%) 90 80 70 60 50 y = 27,125ln(x) - 41,304 R² = 0,9937 40 30 20 10 0 20 40 60 80 100 120 Hình 3.5 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào não cḥt của cao Bình bát Bảng 3.7 Kết thử test MDA của thuốc đối chiếu Trolox Nồng độ ban đầu Nồng độ ban Nồng độ phản ứng (mM) đầu (µg/ml) (µg/ml) OD HTCO% 10 2500 125,00 0,124 77,70 1250 62,50 0,203 63,49 250 12,50 0,376 32,37 0,5 125 6,25 0,445 19,96 0,1 25 1,25 0,529 4,86 Từ bảng 3.7 xây dựng phương trình logarit y = 16,267ln(x) - 4,3914; R2 = 0,9746; Suy IC50 = 28,32(µg/ml) 28 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào não chuột (%) 90 80 70 60 50 y = 16,267ln(x) - 4,3914 R² = 0,9746 40 30 20 10 -10 000 050 100 150 Hình 3.6 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào não chuột của thuốc đối chiếu Trolox 3.2 BÀN LUẬN 3.2.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu ban đầu tiêu chuẩn sở cao chiết cồn hạt Bình bát Khảo sát một số tiêu chuẩn độ tinh khiết của nguyên liệu cao chiết hạt Bình bát độ ẩm, với độ ẩm của nguyên liệu là 5,56% đạt tiêu chuẩn quy định DĐVN V (