Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng chống oxy hóa của hạt bình bát

Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất alkaloid trong nguyên liệu và cao chiết bằng hệ 1 .... Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất alkaloid trong nguyên liệu và cao chiết bằng hệ 2 ...

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY BÌNH BÁT 3

1.1.1 Giới thiệu về cây Bình bát 3

1.1.2 Mô tả thực vật 3

1.1.3 Phân bố, sinh thái 3

1.1.4 Bộ phận dùng 4

1.1.5 Công dụng của cây Bình bát 4

1.1.6 Tác dụng dược lý 5

1.2 SƠ LƯỢC VỀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 7

1.2.1 Chất oxy hóa – Chống oxy hóa 7

1.2.2 Một số phương pháp xác định tác dụng chống oxy hóa 8

1.3 TỔNG QUAN ĐỘC TÍNH CẤP 9

1.3.1 Định nghĩa 9

1.3.2 Nguyên tắc 9

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 ĐỐI TƯỢNG, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 11

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 11

2.1.3 Dung môi và hóa chất 12

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.2.1 Phương pháp chiết ngấm kiệt 12

2.2.2 Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu 13

2.2.3 Xác định độ tinh khiết của cao chiết 15

2.2.4 Định tính xác định sự hiện diện của hợp chất alkaloid bằng phương pháp hóa học 15

2.2.5 Định tính xác định sự hiện diện của hợp chất alkaloid bằng phương

pháp SKLM 15

2.2.6 Xác định hàm lượng alkaloid toàn phần bằng phương pháp cân 16

2.2.7 Phương pháp thử nghiệm độc tính cấp bằng đường uống 17

2.2.8 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa 18

3.1 KẾT QUẢ 20

3.1.1 Chiết xuất cao 20

3.1.2 Kết quả thử tinh khiết nguyên liệu và cao 20

3.1.3 Kết quả định tính nguyên liệu và cao chiết bằng phản ứng hóa học 22

3.1.4 Kết quả định tính sự hiện diện của hợp chất alkaloid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 23

3.1.5 Kết quả định lượng 25

3.1.6 Kết quả thử độc tính cấp trên chuột 25

3.1.7 Kết quả chống oxy hóa của cao hạt Bình bát 27

3.2 BÀN LUẬN 29

3.2.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu ban đầu và tiêu chuẩn cơ sở của cao chiết cồn hạt Bình bát 29

3.2.2 Tính an toàn của cao chiết hạt Bình bát 30

3.2.3 Hoạt tính chống oxy hóa in vitro thông qua thử nghiệm MDA 30

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

4.1 KẾT LUẬN 31

4.2 KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1: PL-1 PHỤ LỤC 2: PL-2

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DĐVN Vietnamese Dictionary Dược Điển Việt Nam

EtOAC Ethyl acetat Ethyl acetat

HTC Antioxidant activity Hoạt tính chống oxy hóa

MeOH Methanol Cồn

SKLM Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Trang

Hình 1.1 Hoa và quả Bình bát 03

Hình 2.1 Hạt và bột hạt Bình bát 12

Hình 2.2 Phương trình tạo phức màu giữa MDA và acid thiobarbituric 19

Hình 3.1 Phản ứng định tính alkaloid trong nguyên liệu 22

Hình 3.2 Phản ứng định tính alkaloid trong cao chiết 22

Hình 3.3 Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất alkaloid trong nguyên liệu và cao chiết bằng hệ 1 23

Hình 3.4 Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất alkaloid trong nguyên liệu và cao chiết bằng hệ 2 24

Hình 3.5 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào não chuột của cao chiết hạt Bình bát 28

Hình 3.6 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào não chuột của thuốc đối chiếu Trolox 29

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Kết quả độ ẩm của nguyên liệu và cao chiết 20 Bảng 3.2 Kết quả độ tro toàn phần của nguyên liệu và cao chiết 21 Bảng 3.3 Kết quả độ tro không tan trong acid của nguyên liệu 21 Bảng 3.4 Kết quả định lượng alkaloid toàn phần trong nguyên liệu và cao chiết 25 Bảng 3.5 Kết quả thử độc tính cấp 26 Bảng 3.6 Kết quả thử trên test MDA của mẫu cao hạt Bình bát 27 Bảng 3.7 Kết quả thử trên test MDA của thuốc đối chiếu Trolox 28

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – Năm học 2017 – 2018

NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA

HẠT BÌNH BÁT ANNONA RETICULATA L ANNONACEAE

Trần Thị Thanh Tuyền Hướng dẫn khoa học: ThS La Hồng Ngọc

Mở đầu:

Loài Bình bát (Annona reticulata L.) là loại tuy rất quen thuộc với người dân

đồng bằng sông Cửu Long nhưng chưa nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Kết quả nghiên cứu về độc tính và khả năng chống oxy hóa của hạt

Bình bát (Annona reticulata L.) sẽ có ý nghĩa quan trọng đối với ngành dược học

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng: hạt Bình bát Annona reticulata L Annonaceae thu hái ở huyện Chợ

Gạo,Tiền Giang

Phương pháp nghiên cứu

- Chiết cao, định tính, định lượng nguyên liệu và cao chiết

- Thử nghiệm độc tính cấp bằng đường uống

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp xác định hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào

Kết quả

Hiệu suất chiết cao đạt 12.55%

Định tính bằng phương pháp hóa học và SKLM đều có hợp chất alkaloid

Định lượng alkaloid toàn phần trong trong cao chiết có hàm lượng (64,51%) cao gấp 5,7 lần so với nguyên liệu (11,24%)

Cao hạt Bình bát thể hiện độc tính cấp đường uống với LD50 là 6,7g cao hạt Bình bát/kg chuột

Mẫu hạt Bình bát có IC50 = 28,96 (µg/ml), khả năng bắt gốc tự do tăng dần theo nồng độ khảo sát

Kết luận

Dịch chiết của nguyên liệu và cao đều cho phản ứng dương tính với thuốc thử alkaloid Hàm lượng alkaloid toàn phần trong cao cao hơn nguyên liệu

Độc tính cấp của cao chiết qua đường uống xác định được LD50 = 6,7g/kg Hoạt

tính chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm MDA của cao chiết có IC50 = 28,96 (µg/ml) tương đương với thuốc đối chiếu Trolox có IC50 = 28,32(µg/ml)

Từ khóa: alkaloid, độc tính cấp, chống oxy hóa, MDA, Annona reticulata,

Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2017 - 2018

ANALYTICAL RESEARCH ON ACUTE TOXICITY AND ANTIOXIDANT

OF CUSTARD APPLE SEED (ANNONA RETICULATA L ANNONACEAE)

Author’s name: Tran Thi Thanh Tuyen

Supervisor: M.S La Hong Ngoc

Introduction

Annona reticulata L is very familiar, especially to people living in the Mekong

Delta but has not received much attention from researchers I chose and conducted the study because of results on the acute toxicity and antioxidant capacity of

Annona reticulata L will have important implications for the pharmacy industry Marterial: Annona reticulata L Annonaceae was collected in Cho Gao district, Tien

Giang Methods:

- Extreme, qualitative, quantitative materials and extracts

- Oral toxicity test

- Survey on in vitro antioxidant activity by determining the activity of lipid

peroxidation inhibitor

Results

High extraction efficiency reach 12,55%

Qualitative tests for the presence of alkaloid by chemical methods and thin layer chromatography have demonstrated that both have alkaloid compounds

The total amount of alkaloid in the extract was 64,51% higher than that of the material (11.24%)

Acute Toxicity: High grade acute vascularity and LD50 of 6.7 g/kg

In vitro antioxidant activity: The antioxidant activity of IC50 = 28,96 μg/ml, the ability of free radical capture increased with the concentration of survey

Conclusion

The extracts of the raw materials and the high concentrations were positive for the alkaloid reagents

Acute Toxicity: High grade acute vascularity and LD50 of 6.7 g/kg

The in vitro antioxidant activity in the MDA test of IC50 extracts was 28,96 (μg/ml) equivalent to the Trolox counterpart with IC50 = 28.32 (μg / ml)

L…

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cuộc sống ngày nay xuất hiện ngày càng nhiều căn bệnh mới lạ, nguy hiểm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống con người, mà một trong những nguyên nhân gây bệnh cho con người phải nói đến là chất oxy hóa (gốc tự do), các chất oxy hóa như superoxid, gốc hydroxy tự do hay hydroperoxid gây nên gần 200 bệnh khác nhau bao gồm các bệnh viêm khớp, hen suyễn, mất trí nhớ, Parkinson,… thậm chí là ung thư Nhiều tác nhân gây ra gốc tự do là những thứ gần gũi với cuộc sống như tia tử ngoại, thức ăn, nhiễm khuẩn và stress, không khí, môi trường ô nhiễm, thuốc lá,….Việc sử dụng các tác nhân chống oxy hóa với khả năng chống lại các gốc tự do được xem như phương pháp tiếp cận đầy hứa hẹn trong việc phòng chống lão hóa và ngăn ngừa nguy cơ bệnh tật Các vitamin E, A,

C, flavonoid, polyphenol, polysaccharid, triterpenoid,…được biết đến là các chất có tác dụng chống oxy hóa có trong nhiều loại hoa quả, đặc biệt là các loại có màu sắc

như trà xanh, café, việt quốc, dâu tây,…

Gần đây nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của các cây thuốc và vị thuốc cổ truyền dùng trong y học dân tộc có hoạt tính chống oxy hóa cao

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có nguồn dược liệu vô

cùng phong phú Và loài Bình bát (Annona reticulata L.) là loại tuy rất quen thuộc

đặc biệt là với người dân sống tại đồng bằng sông Cửu Long nhưng chưa nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu, những nghiên cứu về loại Bình bát này cho thấy rằng nó có nhiều tác dụng dược lý khác nhau như: chống oxy hóa, chống ung thư, giảm đau và ức chế thần kinh trung ương, sốt rét, tẩy giun, giang mai,[11]….Nhiều nghiên cứu lại tập trung vào phần lá và cũng có những nghiên cứu về phần hạt nhưng chỉ chú trọng đến các thành phần hóa học trong hạt [8],[16], tác dụng hoạt chống oxy hóa và các độc tính của phần hạt cũng cần được tìm hiểu kĩ

giúp đánh giá được tính an toàn của dịch chiết từ hạt Bình bát (Annona reticulata

L.) ở nước ta Kết quả nghiên cứu về độc tính và khả năng chống oxy hóa của hạt

Bình bát (Annona reticulata L.) sẽ có ý nghĩa quan trọng đối với ngành dược học

trong nước và trên thế giới vì chúng ta có thể dựa trên những kết quả nghiên cứu được nhận thấy được những lợi ích hay những tác dụng không mong muốn từ hạt Bình bát từ đó đưa ra các hướng nghiên cứu, bào chế ra các loại thuốc trị bệnh từ loài cây này Nhận thấy được việc xác định hoạt tính chống oxy hóa đóng vai trò định hướng và tiền đề để tiến hành các thử nghiệm sàng lọc sinh học sâu hơn đối với mẫu nghiên cứu như kháng viêm, độc tế bào nên tôi chọn và tiến hành thực hiện

đề tài: Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng chống oxy hóa của hạt Bình bát

Annona reticulata L họ Annonaceae ở Việt Nam

 Mục tiêu nghiên cứu

- Chiết cao từ hạt Bình bát

- Định tính, định lượng nguyên liệu và cao chiết

- Nghiên cứu độc tính cấp qua đường uống của hạt Bình bát trên chuột nhắt trắng

- Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của hạt bình bát bằng phương pháp in vitro

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Giới thiệu về cây Bình bát

Tên khoa học: Annona reticulata L

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc lan (Magnoliidae)

Bộ: Ngọc lan (Magnoliades)

Họ na: Annonaceae

Chi na: Annona

Tên gọi khác: cây nê, đào tiên

Tên nước ngoài: Custard apple, wild sweet sop, Bull’s heart,….[3],[6]

1.1.2 Mô tả thực vật

Cây nhỏ, cao 5 – 7 m, thậm chí lên đến 10m Cành non có lông, cành già nhẵn Lá đơn, mọc so le, hình mác thuôn, dài 12 – 15 cm, rộng 5-10cm, gốc tròn, đầu nhọn,

mặt trên nhẵn, bóng, mặt dưới có ít lông tơ, gân lá nổi rõ, có 8 -9 cặp gân phụ

Cụm hoa mọc ở kẽ lá, hoa màu vàng; đài gồm 3 phiến hình tam giác, mặt ngoài có lông; tràng có 2 vòng, cánh hoa hẹp, 3 cánh ngoài to, dày, có lông tơ, 3 cánh trong nhỏ, nhẵn, có bớt đỏ ở trong; nhiều nhị đực và tâm bì

Quả kép, hình tim, có từng ô 5 góc mở, khi chín màu vàng hoặc vàng pha đỏ, thịt quả màu trắng hoặc ngà vàng, ăn được

Mùa hoa: tháng 5 – 6; mùa quả tháng 7 – 8.[6]

Hình 1.1 Hoa và quả Bình bát 1.1.3 Phân bố, sinh thái

Bình bát có nguồn gốc từ vùng Tây Ấn Độ; được trồng rải rác khắp các nước vùng Nam Á, bao gồm Ấn Độ, Xrilanca, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam Ở Việt Nam, Bình bát được trồng để lấy quả ở các tỉnh đồng bằng Nam Bộ và Nam Trung Bộ

Bình bát là loại cây bụi hoặc gỗ nhỏ, ưa sáng và thích nghi cao với những vùng có khí hậu nhiệt đới điển hình Cây sinh trưởng phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm Cây trồng từ hạt sau 3 – 4 năm bắt đầu có hoa quả Cây không trồng được ở các tỉnh phía Bắc do có mùa đông lạnh kéo dài.[6]

1.1.4 Bộ phận dùng

Hạt, lá và rễ.[6]

1.1.5 Công dụng của cây Bình bát

Quả Bình bát chín ăn được, nhưng không ngon như na hoặc mãng cầu xiêm, vì vị hơi chát, ít ngọt Quả xanh thái mỏng phơi khô, sắc uống chữa sốt, tiêu chảy, kiết lỵ, giun sán, nhiễm khuẩn hô hấp

Hạt Bình bát có thể chữa tiêu chảy, kiết lỵ, nhưng độc, nên thường chỉ dùng ngoài Lấy hạt, giã nát, nấu nước đặc rồi gội đầu để trừ chấy, ngâm quần áo để trừ rận, hoặc để diệt trừ sâu bọ Hạt đốt ra tro, trộn với dầu dừa, bôi chữa ghẻ Vỏ thân cũng

có tác dụng như hạt, nhưng kém hơn và ít độc hơn Lá giã nát, ép lấy dịch cũng được dùng trừ chấy rận cho người và gia súc Vỏ rễ và rễ con cây Bình bát dùng chữa sốt, đau bụng, viêm lợi, đau răng Cây có độc, tránh để nước của các bộ phận của cây bắn vào mắt sẽ rất nguy hiểm Nhựa cây Bình bát có tính chất kích ứng ngoài da , có thể giải độc bằng dịch quả chanh.[6]

Vỏ của loài Annona reticulata L có tác dụng làm se mạnh mẽ và có tác dụng như một loại thuốc bổ dưỡng Annona reticulata L từ lâu đã được sử dụng như một tác

nhân kháng viêm trong điều trị vết thương, chống lo âu, chống stress Dịch chiết lá

và cành của Annona reticulata L cho thấy hoạt tính chống co thắt, điều hòa nhịp

tim [19]

Cây Bình bát còn được trồng để làm hàng rào làm ranh đất, chắn sóng, giữ đất, chống sạc

lỡ, thu lượm trái chín làm nguồn thức ăn bổ sung cho cá

Toàn cây Bình bát có vị chát, có độc đặc biệt là hạt và vỏ thân, có tác dụng sát trùng Quả xanh có tác dụng làm săn se, trừ lỵ, trị giun.[6]

1.1.6 Tác dụng dược lý

Tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn: acid kaur – 16 – en - 19 – oic có tác dụng ức

chế sự phát triển của Bacillus subtilis, Staphylococus aureus và Mycobacterium smegmatis nên tác dụng chữa lỵ và nhiễm khuẩn hô hấp.[6]

Một nghiên cứu của Kaladhar Khoa Vi sinh và Tin sinh học, Đại học Bilaspur, Bilaspur, Ấn Độ cho thấy tất cả các thử nghiệm từ chiết xuất vó quả Bình bát

có chứa alkaloids, cholesterol, coumarin, flavonoid, phenol và saponin Ngoài

ra steroid có mặt trong dịch chiết etyl axetat và terpenoids có mặt trong dịch chiết nước Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn cho thấy dịch chiết xuất từ vỏ quả có hoạt tính kháng khuẩn rất lớn chống lại tất cả 6 vi khuẩn và 2 chủng nấm.[15]

Tác dụng diệt côn trùng: Sesquiterpenoid trong quả xanh có tác dụng diệt côn trùng, ấu trùng, điều này chứng minh tác dụng diệt trừ sâu bọ, diệt chấy rận

Tác dụng độc với tế bào: tác dụng độc tế bào trên các dòng ung thư phổi ở người, ung thư kết tràng.[6]

Năm 2012, Suresh và cộng sự đã có nghiên cứu về độc tính của alkaloid từ rễ của

Annona reticulata trên các dòng tế bào ung thư ở người kết quả thu được cho bằng chứng thuyết phục rằng các alkaloid aporphine hiện diện trong rễ của Annona reticulata có thể là một trong những hợp chất gây độc tế bào đối với các dòng tế

bào ung thư.[22]

Theo McLaughlin năm 2008, các đặc tính chống ung thư của trái Bình bát dường như chủ yếu là do một nhóm các hợp chất gọi là acetogenin, đặc trưng cho các loài Annonacae.[17]

1.2.7 Thành phần hóa học của cây Bình bát

Hạt Bình bát có chứa nhiều acetogenin: reticulatain-1, reticulain-2, uvariamicin III, diepoaeticanin-1, diepoaeticanin-2, dieporeticenin, triepoaeticanin, reticulatamol, squamocin, roliniastatin I và nhiều chất thuộc nhóm N-acyltryptamin béo.[6]

Ở Việt Nam, trong các năm 1993, 1994, 1995 nhóm nghiên cứu Vũ Thị Tâm tập trung nghiên cứu lớp chất acetogenin từ hạt Bình bát thu được tại Vĩnh Long

Năm 1993, phân lập hai hợp chất acetogenin mới: squamocin và rolliniastatin

I [23]

Năm 1994, phân lập được 5 hợp chất acetogenin, gồm bốn chất mới dieporeticanin-1, dieporeticanin-2, dieporeticenin , trieporeticanin và một hợp chất đã biết diepomuricanin [25]

Năm 1995, phân lập được ba chất mới là reticulatain-1, reticulatain-2 và reticulatamone [24]

Một dãy các N-fatty acyl tryptamin được Uki và cộng sự phân lập từ hạt của Bình bát.[16]

Năm 2013, nhóm nghiên của Trần Đình Thắng đã nghiên cứu thành phần dầu bay hơi của cây Bình bát [26]

Lá có các acetogenin: annoreticuin-9-on, squamon, solamin, annomonicin, roliniastin-2, anoreticuin, isoanoreticuin.[6]

Vỏ thân và vỏ rễ có các alkaloid.[6]

Forgacs PP và cộng sự phân lập được dopamine và tetrahydroisoquinoline từ lá A reticulata L.[14]

Từ rễ của Bình bát, Suresh và cộng sự đã tìm thấy hợp chất có tên reticulin.[21]

Từ vỏ cây Bình bát, năm 1987 Etse và cộng sự đã phân lập được từ vỏ 17 diterpenoid khung kauran, trong đó có 16α,17-dihydroxykauran và kaur-16-en-19-oat lần đầu tiên được phân lập từ các loài thuộc họ Na [13]

Gần đây nhất là vào năm 2017 trong luận án tiến sĩ của mình tiến sĩ Nguyễn Huy Hùng đã nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cây Bình bát mà đối tượng nghiên cứu chính của ông là bộ phận lá và hạt của cây Bình bát Ông đã nghiên cứu được từ phần tan trong hexane và ethyl acetate của dịch chiết methanol lá của cây Bình bát đã phân lập và xác định cấu trúc

12 hợp chất và từ phần tan trong ethyl acetate của dịch chiết methanol của hạt cây Bình bát phân lập được 10 hợp chất.[8]

1.2.1 Chất oxy hóa – Chống oxy hóa

Trong cơ thể con người, thường xuyên diễn ra nhiều sinh hoạt hoặc xây dựng hoặc huỷ hoại Có những chất tưởng như là thực phẩm chính của tế bào nhưng đồng thời cũng lại làm hại tế bào Gốc tự do, oxy hóa và chất chống oxy hóa là một ví dụ Những phân tử này ảnh hưởng đến cơ thể con người rất nhiều

Chất oxy hoá còn gọi là gốc tự do, đó là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử có một hay nhiều electron không ghép đôi ở lớp ngoài cùng Gốc tự do có thể tồn tại độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của gốc tự do thường rất ngắn (khoảng một phần triệu đến một phần nghìn giây) Các tác nhân gây ra gốc tự do có thể kể đến là tia tử ngoại, nhiễm khuẩn và stress, thuốc lá rượu bia, không khí và môi trường bị ô nhiễm,…[18]

Oxy hóa là quá trình chuyển electron từ nguyên tử này sang nguyên tử khác, oxy hóa rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất Tuy nhiên, khi electron ở trạng thái độc thân, chúng sẽ tạo ra các gốc tự do được gọi là những loại oxy hoạt động như: superoxide, peroxyl, alkoxyl, hydroxyl và nitric oxide.[18]

Trong cơ thể, bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống oxy hóa “ nội sinh” để cân bằng lại, vô hiệu hóa các gốc tự do Hệ thống các chất chống oxy hoá nội sinh gồm các enzym như glutathione peroxidase, superroxid, dismutase đặc biệt là vitamin C, vitamin E, beta-caroten (tiền vitamin A)… Chất chống oxy hóa ngoại sinh có thể lấy được từ các nguồn tự nhiên (vitamin, flavonoid, anthocyanin, một số hợp chất khoáng), nhưng cũng có thể là các hợp chất tổng hợp.[18]

Do vậy, xu hướng nghiên cứu gốc tự do và các chất chống oxy hóa ngày càng được chú trọng trong lĩnh vực Y-dược nhằm phát hiện những chất chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt có lợi cho sức khỏe con người, trong đó chất chống oxy hóa

có nguồn gốc thiên nhiên được nhiều quốc gia, nhiều nhà khoa học quan tâm do đặc tính ít độc, dễ hấp phụ đối với cơ thể và ít gây ra các phản ứng phụ

1.2.2 Một số phương pháp xác định tác dụng chống oxy hóa

Phương pháp xác định hàm lượng MDA

MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm Phản ứng thực hiện ở môi trường

pH 2-3, nhiệt độ 90-100o C trong vòng 10-15 phút

Peroxy hóa lipid là một cơ chế thường gặp của những tế bào bị tổn thương trong thực vật và động vật, nó được coi như là chất chỉ thị của quá trình stress oxy hóa trong tế bào và mô

Việc đo MDA là một phương pháp thuận tiện và nhạy cho việc đánh giá nồng độ lipid peroxy trong nhiều mẫu thử khác nhau bao gồm thuốc,thực phẩm và mô sinh học từ người và động vật Thử nghiệm MDA có độ tuyến tính cao, cũng được sử

dụng trong phương pháp in vivo.[12],[20]

Phương pháp sử dụng DPPH

Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa thể hiện qua cơ chế đánh giá bắt gốc tự do, làm giảm màu của DPPH, sự giảm màu đó sẽ được xác định bằng cách

đo quang ở bước sóng 517nm

DPPH là gốc tự do màu tím, bước sóng hấp thu cực đại ở 517nm

Dưới tác động chất chống oxy hóa, DPPH chuyển sang màu vàng

Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt (II)

Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra các gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc tự do Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn sự tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt (II) với 2,2’-bipyridyl

Phương pháp xác định hàm lượng GSH

GSH trong dịch chiết sinh học phản ứng với thuốc thử DTTB (5-5-dithiobis-2-nitro benzoic acid) (thuốc thử Ellman) sẽ tạo phức có màu vàng hấp thu cực đại ở bước sóng 412 nm Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng GSH

Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd

Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ các gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn tạo thành gốc superoxyd Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolium cho phức chất có màu tím được đo quang ở bước sóng 550 nm Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm sự hình thành phức màu tím.[2],[10]

1.3.1 Định nghĩa

Độc tính cấp của một chất là độc tính xảy ra sau khi sử dụng một liều đơn với các đường sử dụng khác nhau như uống, trong da, dưới da, tĩnh mạch, phúc mô, hô hấp Mục đích thử nghiệm là xác định được mức độ độc của một chất, cung cấp thông tin về tác động từ đó có thể suy ra cơ chế gây độc Bên cạnh đó còn đưa

ra được liều sử dụng nhiều lần trong các thử nghiệm, khoảng thời gian từ khi dùng thuốc đến khi độc tính khởi phát và biến mất.[7]

Khi chọn được liều thích hợp thì sẽ có cả liều tối đa an toàn và liều tối thiểu chí tử tạo thuận lợi cho các thí nghiệm khác Chia số chuột đó ra thành nhiều lô, tối thiểu là 5 lô và mỗi lô tối thiểu là 6 chuột.[1]

Chia động vật thử nghiệm thành các lô tương tự nhau Tất cả động vật trong cùng một lô được cho dùng cùng một liều thuốc ở cùng điều kiện rồi ghi lại phân suất tử

vong trong 24 giờ (72 giờ với dược liệu) Tiếp tục thực hiện với các lô kế tiếp với liều dùng tăng theo cấp số lựa chọn

Giai đoạn 1: giai đoạn sơ khởi, thử nghiệm với số chuột là 4 Bắt đầu từ liều cao nhất có thể qua kim đầu tù cho chuột uống nhằm xác định LD0 (liều tối đa không gây chết bất kì động vật thử nghiệm nào)

Giai đoạn 2: giai đoạn xác định, số lượng chuột được tăng lên từ 12-20 con/lô Nếu:

• Không có chuột chết thì có thể xác định được Dmax

• Số lượng chuột chết không hoàn toàn thì không xác định được Dmax và LD50

(liều gây chết 50% động vật thử nghiệm) Tiếp tục hạ liều cho đến khi không còn vật chết

• Số lượng chuột chết hoàn toàn thì tiến hành với nhiều lô ứng với liều giảm dần cho đến liều không còn gây chết Liều bắt đầu là liều gây chết ở giai đoạn 1 Sau khi dùng thuốc, cho động vật thử nghiệm ăn uống bình thường

Quan sát từ 7-14 ngày, ghi chép tỉ mỉ các triệu chứng xảy ra ở động vật như trạng thái ủ rũ, kích thích, tình trạng màu lông, tình trạng ăn uống, di chuyển và nếu có thể ghi nguyên nhân chết của động vật.[7]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Hạt Bình bát được thu hái ở Tiền Giang

Tiến hành thu hái trái Bình bát chín, bỏ phần thịt lấy hạt Hạt Bình bát được chọn làm nguyên liệu là những hạt tươi, không sâu bệnh Thời gian thu hái vào khoảng tháng 06/2018, địa điểm thu hái tại Chợ gạo, Tiền Giang

Hạt trái Bình bát được rửa sạch, phơi khô tiến hành xay thành bột có kích thước 5mm dùng làm trong đề tài

- Ống nhỏ giọt

- Chén sứ

- Bóp cao su

Thiết bị:

- Cân điện tử Sartotius

- Máy siêu âm

- Máy cô quay Buchi

- Tủ sấy Memmert

- Bếp cách thủy Memmert

- Lò nung Lenton

- Bình chiết ngấm kiệt

- Đèn soi UV

- Máy đo pH Meter Schott

- Thiết bị nghiền đồng thể

- Máy ổn nhiệt hiệu Desconectar

- Máy ly tâm lạnh Sartorius

- Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến

2.1.3 Dung môi và hóa chất

2.2.1 Phương pháp chiết ngấm kiệt

Cân 900 g khối lượng bột nguyên liệu khô Làm ẩm dược liệu với cồn 70% trong 30 phút Tiến hành nạp dược liệu vào bình chiết ngấm kiệt Thêm cồn 70% vào bình ngấm kiệt sao cho dung môi ngập bề mặt dược liệu 5 – 7 cm Ngâm dược liệu ở

nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ rồi tiến hành rút dịch chiết Tốc độ rút dịch chiết

là 2 mL/phút Tập trung toàn bộ dịch chiết thu được cô quay giảm áp ở 60 oC thu cao loãng Cao loãng được cô trên bếp cách thủy ở 60 oC thu được cao chiết.[4] Công thức tính hiệu suất chiết cao:

𝐻(%) = 𝑚′ × (1 − 𝐴′)

𝑚 × (1 − 𝐴) × 100 Trong đó, 𝐻(%): Hiệu suất chiết tính trên khối lượng cô kiệt (%)

𝐴: Độ ẩm nguyên liệu (%) 𝑚: Khối lượng nguyên liệu (g)

𝐴’: Độ ẩm cao chiết (%) 𝑚′: Khối lượng cao chiết (g)

2.2.2 Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu

2.2.2.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Xác định mất khối lượng do làm khô được tiến hành theo DĐVN V

Sấy chén sứ ở nhiệt độ 105 oC cho đến khi cân khối lượng 3 lần liên tiếp không đổi Để nguội trong bình hút ẩm trong 15 phút Cân 2 g mẫu dược liệu vào chén sứ, trải đều mẫu ở đáy chén sứ và sấy ở nhiệt độ 105 oC, áp suất thường, trong 4 giờ Để nguội trong bình hút ẩm 15 phút, cân và ghi nhận khối lượng

Tiếp tục sấy mẫu ở 105 oC, áp suất thường trong 1 giờ, để vào bình hút ẩm đến nguội và cân lại khối lượng sau khi sấy Lặp lại nhiều lần cho đến khi cân 3 lần liên tiếp khối lượng không đổi, độ chênh lệch không quá 5 mg

Thực hiện 3 lần trên 1 mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu.[5]

Công thức tính độ ẩm:

A =a − b

a × 100 (%) Trong đó:

A: Khối lượng mất do làm khô (%)

a: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g)

b: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)

2.2.2.2 Xác định độ tro toàn phần

Xác định độ tro toàn phần theo DĐVN V

Nung chén sứ cho đến khi khối lượng không đổi sau ba lần cân liên tiếp

Cân 2 g mẫu dược liệu khô cho vào chén sứ Trải đều mẫu ở đáy chén và sấy ở nhiệt độ 105 oC trong 30 phút, sau đó đốt dược liệu thành tro

Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 550 oC (tránh đứng trực tiếp trước cửa lò nung) và nung cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) Để nguội trong bình hút ẩm khoảng 30 phút Cân và ghi lại kết quả

Đặt chén nung vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân, ghi nhận kết quả

Tiếp tục tiến hành lặp lại như trên cho đến khi khối lượng cân 3 lần liên tiếp không thay đổi, độ chênh lệch không quá 5 mg

Thực hiện 3 lần trên 1 mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu.[5]

Công thức tính độ tro toàn phần:

X = a − b

c − (c × A)× 100 (%) Trong đó:

X: Độ tro toàn phần của mẫu dược liệu (%)

a: Khối lượng chén có tro (g)

b: Khối lượng chén không tro (g)

c: Khối lượng dược liệu dùng (g)

A: Độ ẩm mẫu dược liệu (%)

2.2.2.3 Xác định độ tro không tan trong acid

Xác định độ tro không tan trong acid được tiến hành theo DĐVN V

Thêm vào tro toàn phần 25 ml dung dịch HCl 2M Đậy chén nung và đun sôi cách thủy trong 15 phút Lọc dung dịch qua giấy lọc không tro, rửa cắn và giấy lọc bằng nước cất nóng cho đến khi dịch lọc là trung tính Chuyển giấy lọc có cắn vào chén nung ở trên, sấy khô, đốt rồi nung ở nhiệt độ 550 oC trong 4 giờ cho đến khối lượng không đổi Để nguội trong bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân, ghi nhận kết quả Đặt chén nung vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân, ghi nhận kết quả Tiếp tục tiến hành lặp lại như trên cho