Nghiên cứu phương pháp sản xuất và kiểm nghiệm nguyên liệu cho chế phẩm probiotics có chứa lactobacllus acidophilus

Bộ giáo dục đào tạo Bộ y tế Bộ giáo dtụrcưvờànđ gàđoạti hoọc dược hà nội i h ä c -d ­ ợ c hà nội trường -đ Bộ y tÕ - - Nguyễn thị vĩnh hồng Nguyễn thị vĩnh hồng Nghiên cứu phương pháp sản xuất vg àhkiê iểnmcn ệư mơn ện ux cu hấ ot N ứg uhpih ng gupyhêánplsiả ch hẩ io cê sncó kế iểpm nm ghpir Öo mbn gtuiy lic Öu ca ho la acpir ll dsoc ph lh us ch ÕcpthoÈbm ou bsioatciic ãic ứa lactobacillus acidophilus Chuyên ngành : Kiểm nghiệm thuốc - độc chất Mã số : 60 73 15 luận văn thạc sĩ dược học luận văn thạc sĩ dược học Người hướng dẫn : TS Đàm Thanh Xuân - Hµ néi - 2008 - Hµ néi - 2008 - Lời cảm ơn Luận văn thực hoàn thành Khoa Vi sinh - Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương - Bộ Y tế, hướng dẫn trực tiếp TS Đàm Thanh Xuân - Giảng viên môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn bảo tận tình TS Đàm Thanh Xuân Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS TS Từ Minh Koóng, thầy cô Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Hoá phân tích, Bộ môn Công nghiệp Dược Bộ môn khác Trường Đại học Dược Hà nội tận tình bảo giúp đỡ trình học tập trường trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương đồng nghiệp giúp đỡ thời gian vừa qua để hoàn thành tốt khoá học Cuối cùng, xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè động viên quan tâm chia sẻ sống nghiệp Hà nội, ngày 24 tháng 12 năm 2008 MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vi sinh vật sinh acid lactic 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Khả chuyển hóa 1.2 Lactobacillus acidophilus 1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý 1.2.2 Khả chuyển hóa carbon hydrat 1.3 Probiotics 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Các vi sinh vật thường sử dụng chế phẩm Probiotics 1.3.3 Ứng dụng Probiotics ngành Dược 1.3.4 Một số chế phẩm Probiotics thông dụng thị 10 trường dược phẩm Việt Nam 1.4 Phương pháp kiểm nghiệm L acidophilus chế 12 phẩm Probiotics 1.4.1 Phương pháp định danh 12 1.4.2 Phương pháp định lượng 14 1.5 Phương pháp đơng khơ 14 1.5.1 Qui trình đơng khơ 15 1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sống vi 15 sinh vật sau đông khô CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG 18 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện dùng nghiên cứu 18 2.2 Đối tượng nghiên cứu 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phương pháp định lượng L acidophilus 23 chế phẩm 2.4.2 Phương pháp định danh vi sinh vật kit 24 API 50 CH 2.4.3 Phương pháp "in vitro" nghiên cứu khả 26 sống L acidophilus dịch dày dịch ruột nhân tạo 2.4.4 Phương pháp phân lập bảo quản L 28 acidophilus 2.4.5 Phương pháp lựa chọn L acidophilus từ chế 28 phẩm để sản xuất sinh khối 2.4.6 Phương pháp sản xuất sinh khối 28 2.4.7 Phương pháp đông khô L acidophilus 29 2.4.8 Phương pháp đánh giá tỷ lệ sống L 30 acidophilus trước đông khô, sau đông khô trình bảo quản CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Xác định số lượng vi sinh vật chế phẩm 31 31 Probiotics 3.2 Định danh vi sinh vật kit API 50 CH 32 3.3 Khảo sát thay đổi pH dịch nghiên cứu trước sau 41 tiếp xúc với chế phẩm 3.4 Khảo sát khả sống vi sinh vật sau tiếp xúc 43 với dịch dày dịch ruột nhân tạo 3.5 Lựa chọn L acidophilus từ chế phẩm để sản xuất sinh 49 khối 3.6 Kết đông khô L acidophilus CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Định danh vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus kit 50 54 54 API 50 CH 4.2 Khảo sát khả sống vi sinh vật sau tiếp xúc 55 với dịch dày nhân tạo pH 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 dịch ruột nhân tạo pH 6,8 4.3 Phương pháp đông khô KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 57 KẾT LUẬN 57 KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 59 CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN: Acid deoxyribonucleic ARN: Acid ribonucleic ATCC: American Type Culture Collection (Ngân hàng chủng Mỹ) BCP: Bromocresol purple medium (Môi trường BCP) B longum: Bifidobacterium longum B subtilis: Bacillus subtilis C butyricum: Clostridium butyricum CFU: Colony forming unit (Đơn vị tạo thành khuẩn lạc) E coli: Escherichia coli H pylori: Helicobacter pylori L acidophilus: Lactobacillus acidophilus L brevis: Lactobacillus brevis L bulgaricus: Lactobacillus bulgaricus L casei: Lactobacillus casei L delbruckii: Lactobacillus delbruckii L fermenti: Lactobacillus fermenti L helveticus: Lactobacillus helveticus L lactis: Lactobacillus lactis L paracasei: Lactobacillus paracasei L plantarum: Lactobacillus plantarum L reuteri: Lactobacillus reuteri L rhamnosus: Lactobacillus rhamnosus L sporogenes: Lactobacillus sporogenes MRS: deMan, Rogossa and Sharpe medium (Môi trường MRS) NBRC: NITE Biological Resource Center (Trung tâm sinh học NITE) PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) S bovis: Streptococcus bovis S cremoris: Streptococcus cremoris S faecalis: Streptococcus faecalis ttn: giá trị t thực nghiệm tlt: giá trị t lý thuyết USP: United State's Pharmacopeia (Dược điển Mỹ) VSV: Vi sinh vật VTCC: Vietnam Type Culture Collection (Ngân hàng chủng Việt Nam) DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số bacteriocin Lactobacilli sinh Bảng 1.2 Đặc tính đối kháng vi sinh vật sinh acid lactic Bảng 1.3 Một số chế phẩm Probiotics thông dụng thị trường 11 Việt Nam Bảng 3.1 Số lượng vi sinh vật chế phẩm 31 Bảng 3.2 Theo dõi phản ứng định danh vi sinh vật kit API 50 37 CH Bảng 3.3 Kết định danh vi sinh vật phần mềm Apiweb 39 Bảng 3.4 pH nước cất trước sau tiếp xúc với chế phẩm 41 Bảng 3.5 pH dịch nghiên cứu trước sau tiếp xúc với chế 42 phẩm Bảng 3.6 Tỷ lệ L acidophilus ANTIBIO sống sau 44 tiếp xúc với dịch dày dịch ruột nhân tạo Bảng 3.7 Giá trị ttn thu so sánh tỷ lệ VSV trung bình 45 chế phẩm Antibio sống sau thời gian tiếp xúc khác Bảng 3.8 Tỷ lệ L acidophilus PROBIO sống sau tiếp 46 xúc với dịch dày dịch ruột nhân tạo Bảng 3.9 Giá trị ttn thu so sánh tỷ lệ VSV trung bình 47 chế phẩm Probio sống sau thời gian tiếp xúc khác Bảng 3.10 Số lượng vi sinh vật sống trung bình chế phẩm Antibio Probio sau tiếp xúc với dịch nghiên cứu khác 48 Bảng 3.11 Độ truyền qua hỗn dịch L acidophilus có nguồn gốc 49 khác môi trường MRS lỏng Bảng 3.12 Số lượng L acidophilus sống trước sau q trình 51 đơng khơ tá dược khác Bảng 3.13 Kết kiểm nghiệm nguyên liệu L acidophilus 53 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình ảnh Lactobacillus acidophilus kính hiển vi điện tử Hình 3.1 Định danh L acidophilus VTCC-B-791 kit API 50 33 CH Hình 3.2 Định danh vi sinh vật chế phẩm ABIO kit API 34 50 CH Hình 3.3 Định danh vi sinh vật chế phẩm ANTIBIO kit 35 API 50 CH Hình 3.4 Định danh vi sinh vật chế phẩm PROBIO kit 36 API 50 CH Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn thay đổi số lượng vi sinh vật trước, sau đông khô trình bảo quản 52 - 58 - KIẾN NGHỊ Chúng tơi có số kiến nghị sau: Sau sử dụng kit API 50 CH, vi sinh vật chế phẩm Abio xác định L rhamnosus khác với công bố tiêu chuẩn chất lượng Tuy nhiên, trước có kết luận định danh cuối cùng, đề nghị tiến hành định danh vi sinh vật chế phẩm phương pháp sinh học phân tử có độ xác cao Tiếp tục nghiên cứu mở rộng phạm vi ứng dụng kit API để định danh vi sinh vật thuộc chi Bacillus, Bifidobacterium, Streptococcus thường sử dụng chế phẩm Probiotics đa thành phần Phương pháp "in vitro" nghiên cứu khả sống vi sinh vật dịch nghiên cứu mà đưa dựa mơ hình "tĩnh" (tức pH thành phần dịch nghiên cứu không thay đổi suốt trình thí nghiệm) thử nghiệm "đơn" (tức vi sinh vật tiếp xúc với dịch dày dịch ruột cách riêng rẽ) Điều khác với thực tế sinh lý người dịch dày dịch ruột ln ln có thay đổi pH thành phần tuỳ theo tình trạng thể lúc đói hay no Ngồi ra, uống chế phẩm Probiotics, vi sinh vật qua toàn hệ tiêu hoá người, trước tiên bị tác động acid hydrocloric, pepsin, cathepsin dày, sau đó, vi sinh vật tiếp tục bị ảnh hưởng dịch mật hay pancreatin, amylase, lipase có dịch tuỵ ruột Do vậy, đề tài tiếp tục phát triển theo hướng nghiên cứu để xây dựng mơ hình "động" tiến hành thử nghiệm "kép" để đánh giá số lượng vi sinh vật sống chế phẩm Probiotics sau tiếp xúc với dịch nghiên cứu kết sát với thực tế - 59 - TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất Y học, Hà nội Phạm Xuân Chung (2004), Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đơng khơ Artesunat, Khố luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại học Dược Hà nội, Hà nội Công ty cổ phần Dược Hậu Giang (2007), Tiêu chuẩn nhà sản xuất: Thuốc bột Ybio Công ty cổ phần Dược phẩm Imexpharm (2004), Tiêu chuẩn nhà sản xuất: Thuốc bột Probio Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, tập 2, tr 68, 69, 218 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, tr 214, 221, 223 Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp (2008), "Vi sinh vật chế phẩm Probiotics", Tạp chí Dược học, số 390, Bộ Y tế, Hà nội Lê Xuân Hoành (2006), Phân lập, tuyển chọn, phân loại số chủng Lactobacillus dùng để sản xuất acid lactic nhạy cảm với vitamin B12, Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Dược Hà nội, Hà nội Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở công nghệ sinh học sản xuất dược phẩm, Nhà xuất Y học, tr 18-25, 70-78 - 60 - 10 Nguyễn Văn Thành (2007), Nghiên cứu chế tạo chế phẩm đông khô Probiotic chống loạn khuẩn đường ruột, Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ, Trường Đại học Dược Hà nội, Hà nội 11 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học, Nhà xuất Giáo dục, tập 5, tr 129-154 12 Nguyễn Vũ Tường Vy, Nguyễn Văn Thanh, Trần Thu Hoa (2007), "Khảo sát khả chịu acid, muối mật kháng sinh số vi sinh vật nguyên liệu sản xuất Probiotics đường uống", Tạp chí Dược học, số 378, Bộ Y tế, Hà nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH 13 G.C Ainsworth and P H A Sneath (1962), Microbial Classification, The Syndics of the Cambridge University Press, p 91, 154, 421 14 AMAREG GmbH, Germany (2005), Quality Specifications and analytical methods of finished product: GYNOFLOR vaginal tablet 15 BioMerieux, Inc (2006), API 50 CH and API 50 CHL Medium, France 16 Melinda A Boyd, May A.D Antonio and Sharon L Hillier (2005), "Comparision of API 50 CH strips to Whole-Chromosomal DNA probes for Identification of Lactobacillus species", Journal of Clinical Microbiology, 43(10), p 5309 - 5311 17 Robert S Breed, E G D Murray, Nathan R Smith (1957), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Bailliere, Tindall and Cox Ltd., United State of American, p 282, 506, 541, 543-552 18 Dae Han New Pharm Co Ltd., Korea (2001), Quality Specifications and analytical methods of finished product: ABIO granule 19 Annie Felten, Claude Barreau, Chantal Bizet, Philippe Henri Lagrange, and Alain Philippon (1999), "Lactobacillus Species Identification, H2O2 - 61 - Production, and Antibiotic Resistance and Correlation with Human Clinical Status", Journal of Clinical Microbiology, 37(3), p 729-733 20 Han Wha Pharma Co., Ltd., (1999), Quality Specifications and analytical methods of finished product: ANTIBIO granules 21 ILDONG Pharmaceutical Co., Ltd., Korea (2006), Quality Specifications and analytical methods of finished product: Biobaby 22 Naparat Kaewkaukul (1998), Development of mixed culture Lactobacillus products, Thesis of master of science, Mahidol University, Thailand 23 Conway P L., Gorbach S L., Goldin B R., (1987), "Survival of lactic bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells", Journal of Dairy Science, 70(1), p 1-12 24 L.V McFarland and G.W Elmer, "Pharmaceutical Probiotics for the treatment of anaerobic and other infections", Academic Press (1997), 3, p 73-78 25 Lansing M Prescott, John P Harley, Donald A Klein (2005), Microbiology, The Mc Graw-Hill Companies Inc., The United States of America, p 413, 515 26 Marteau P., Minekus M., Havenaar and J H J Huis In't Veld (1997), "Survival of lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomch and small intestine: Validation and the effects of bile, Journal of Dairy Science, 80(6), p 1031-1037 27 James Swarbrick (1972), Freeze drying lyophilization of pharmaceutical and biological products, Marcel Dekker Inc., The United States of America 28 The United State of America Pharmacopeia Commision (2006), The United States Pharmacopeia 29, 2, p 3171 - 62 - 29 Elina Tuomola, Ross Crittenden, Martin Playne, Erika Isolauri, and Seppo Salminen (2001), "Quality assurance criteria for probiotic bacteria", The American Journal of Clinical Nutrition, p.393-398 30 Giuseppe Zoppi, Mauro Cinquetti, Anna Benini, Elettra Bonamini and Elisa Bertazzoni Minelli (2001), "Modulation of the Intestinal Ecosystem by Probiotics and Lactulose in children during treatment with Ceftiazone", Current Therapeutic Research, 62(5), p 418 - 435 31 http//www.lactospore.com - 63 - PHỤ LỤC PHỤ LỤC Xử lý kết định danh L acidophilus VTCC-B-791 phần mềm Apiweb PHỤ LỤC Xử lý kết định danh vi sinh vật chế phẩm Abio phần mềm Apiweb PHỤ LỤC Xử lý kết định danh vi sinh vật chế phẩm Antibio phần mềm Apiweb PHỤ LỤC Xử lý kết định danh vi sinh vật chế phẩm Probio phần mềm Apiweb PHỤ LỤC Tiêu chuẩn chất lượng dự kiến nguyên liệu L acidophilus - 64 - PHỤ LỤC - 65 - PHỤ LỤC - 66 - PHỤ LỤC - 67 - PHỤ LỤC - 68 - PHỤ LỤC TIÊU CHUẨN NGUYÊN LIỆU Lactobacillus acidophilus đông khô 109CFU/g YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Tính chất: Bột màu trắng đến trắng ngà 1.2 Định tính: Chế phẩm phải thể phép thử định tính Lactobacillus acidophilus 1.3 Kim loại nặng: Không 20 phần triệu 1.4 Nước: Không 7,0% 1.5 Định lượng: Chế phẩm phải chứa L acidophilus không 109 CFU/g 1.6 Độ nhiễm khuẩn - Tổng số Enterobacteria vi sinh vật Gram âm: không 500CFU/g; - Nấm men mốc: khơng q 100CFU/g; - Khơng có: E coli, Salmonella sp., P aeruginosa S aureus 1g PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Tính chất: Thử cảm quan, chế phẩm phải đạt yêu cầu nêu 2.2 Định tính 2.2.1 Thuốc thử: Theo DĐVN III 2.2.2 Cách thử Sau nuôi cấy vi sinh vật mô tả mục định lượng, lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt cấy chuyển sang 5,0ml mơi trường MRS lỏng (có cơng thức giống mơi trường MRS đặc ghi phần định lượng, khác khơng có thạch) ủ tủ ấm CO2 (có nồng độ CO2 5%) 37 ± 1oC 24 - 69 - a/ Sự phát triển vi sinh vật: Vi sinh vật phát triển tốt điều kiện kị khí b/ Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram soi kính hiển vi với vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần: Vi sinh vật bắt màu tím, hình que, xếp thành đơi, chuỗi ngắn đứng đơn độc (Trực khuẩn Gram dương) c/ Phản ứng catalase: Li tâm 2ml hỗn dịch tốc độ 4000 vòng/phút 15 phút, loại bỏ lớp mơi trường phía thu lấy sinh khối vi sinh vật Thêm vào sinh khối khoảng 2ml dung dịch oxy già 3%, phải không thấy có bọt khí lên (phản ứng catalase âm tính) d/ Định danh vi sinh vật kit API 50 CH: - Nguyên tắc: Mỗi vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus có khả lên men carbon hydrat khác Môi trường API 50 CHL chứa chất dinh dưỡng thích hợp chất thị tía bromocresol Mỗi giếng kit API 50 CH chứa loại carbon hydrat khác Nếu vi sinh vật lên men carbon hydrat giếng sinh acid lactic làm giảm pH môi trường, kết làm đổi màu môi trường - Độ đục chuẩn McFarland số 2: Hút xác 2,0ml dung dịch bari clorid 0,048M vào bình định mức dung tích 100ml pha lỗng dung dịch acid sulfuric 0,18M vừa đủ đến vạch, trộn Độ hấp thụ độ đục chuẩn số đo bước sóng 625nm, cốc đo dày 1cm, sử dụng dung dịch acid sulfuric 0,18M làm mẫu trắng, phải nằm khoảng 0,32 - 0,40 Độ đục chuẩn dùng vòng tháng kể từ ngày pha - Hỗn dịch gốc: Li tâm hỗn dịch vi sinh vật nuôi cấy 24 môi trường MRS lỏng mô tả tốc độ 4000 vòng/phút 15 phút loại bỏ lớp mơi trường phía trên, thu sinh khối Rửa sinh khối cách thêm 5ml dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vào trộn - 70 - Tiếp tục li tâm tốc độ 4000 vòng/phút 15 phút loại bỏ lớp dung dịch phía Phân tán sinh khối 1ml nước cất vô trùng thu hỗn dịch gốc - Tiến hành: Nhỏ từ từ giọt hỗn dịch gốc vào ống nghiệm chứa sẵn 5ml nước cất vô trùng đến độ đục ống tương đương với độ đục chuẩn McFarland số (so sánh mắt thường) Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc cho vào ống nghiệm Cho vào 10ml môi trường API 50 CHL số giọt hỗn dịch gốc gấp đôi số giọt cho vào ống nghiệm lắc Nhỏ khoảng 200µl mơi trường API 50 CHL cấy vi sinh vật vào giếng kit giếng số đến giếng 49, ý tránh tạo bọt khí giếng Sau đó, nhỏ dung dịch dầu parafin vô trùng lên bề mặt giếng ủ 37 ± 1oC Đọc kết sau 24 48 nuôi cấy - Cách đọc kết quả: Giếng âm tính có màu tím giống giếng chứng âm tính số Giếng dương tính mơi trường giếng chuyển từ màu tím sang màu vàng Riêng giếng số 25 màu mơi trường chuyển từ tím sang đen dương tính Ghi kết vào phiếu theo dõi kết sau 24 48 Nhập số liệu vào phần mềm Apiweb để định danh xác vi sinh vật chế phẩm 2.3 Kim loại nặng: Thử theo DĐVN III - Phụ lục 7.4.7 Dùng 1,0g chế phẩm tiến hành thử theo phương pháp Dùng 2,0ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu để chuẩn bị mẫu đối chiếu 2.4 Nước: Thử theo DĐVN III - Phụ lục 6.6 2.5 Định lượng 2.5.1 Thuốc thử: Theo DĐVN III - 71 - 2.5.2 Cách thử: (Tiến hành điều kiện vô trùng) - Môi trường MRS đặc (Merck) Công thức: Pepton 10,0g Cao thịt 8,0g Cao men bia 4,0g Glucose 20,0g Dikali hydrophosphat 2,0g Tween 80 1,0g Amoni citrat 2,0g Natri acetat 5,0g Mangan sulfat 0,04g Magnesi sulfat 0,2g Thạch Nước cất vừa đủ 14,0g 1000ml pH sau tiệt trùng: 5,7 ± 0,2 - Dung mơi pha lỗng Kali dihydrophosphat 3,56g Dinatri hydrophosphat 7,23g Natri clorid 4,30g Pepton từ thịt 1,00g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH sau tiệt trùng 7,0 ± 0,1 - Chuẩn bị hỗn dịch thử: Cân xác khoảng 5,0g chế phẩm vào bình nón vơ trùng, thêm dung mơi pha lỗng với thể tích tính theo mililit lần khối lượng bột thuốc cân vài viên bi thuỷ tinh vô trùng Lắc mạnh 15 phút để vi sinh vật phân tán dung dịch, thu hỗn dịch - 72 - có độ pha lỗng 10-1 Lấy 1000µl hỗn dịch cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9,0ml dung môi pha loãng, lắc máy lắc trộn Vortex hỗn dịch có độ pha lỗng 10-2 Tiếp tục pha loãng 10 lần để thu hỗn dịch có có độ pha lỗng 10-7, 10-8 10-9 - Tiến hành: Chuẩn bị ba đĩa petri vô trùng, chuyển vào đĩa xác 1000µl hỗn dịch có độ pha loãng 10-7 Tiếp tục làm với hỗn dịch có độ pha lỗng 10-8 10-9 Cấy trộn với môi trường MRS đặc (đã tiệt trùng để nguội xuống khoảng 45oC), để môi trường đĩa đông tự nhiên Lật ngược đĩa petri ủ 37 ± 1oC 48 - 72 Sau thời gian ủ, đếm số lượng khuẩn lạc đĩa petri (chỉ đếm đĩa petri có số khuẩn lạc nằm khoảng 30 - 300) - Tính kết quả: Số lượng vi sinh vật 1g chế phẩm tính theo cơng thức: A = nTB × d Trong đó: A : số lượng vi sinh vật 1g chế phẩm (CFU/g), nTB : số lượng khuẩn lạc trung bình đĩa petri (CFU), d : độ pha loãng hỗn dịch thử 2.6 Độ nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN III - Phụ lục 10.7 ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN VÀ BẢO QUẢN Nguyên liệu đóng gói kín, nhãn ghi đầy đủ bảo quản - 8oC ... 2.1 Phương tiện dùng nghiên cứu 18 2.2 Đối tượng nghiên cứu 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phương pháp định lượng L acidophilus 23 chế phẩm 2.4.2 Phương pháp. .. quan đích có tác dụng hay không tỷ lệ bao nhiêu? Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành thực đề tài: "Nghiên cứu phương pháp sản xuất kiểm nghiệm nguyên liệu cho chế phẩm Probiotics có chứa Lactobacillus... 1.3.4 Một số chế phẩm Probiotics thông dụng thị 10 trường dược phẩm Việt Nam 1.4 Phương pháp kiểm nghiệm L acidophilus chế 12 phẩm Probiotics 1.4.1 Phương pháp định danh 12 1.4.2 Phương pháp định