Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 155 16

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ CẨM VÂN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ Streptomyces 155.16 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2011 -1- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ CẨM VÂN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ Streptomyces 155.16 CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 607301 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS CAO VĂN THU HÀ NỘI - 2011 -2- LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS TS Cao Văn Thu, người trực tiếp hướng dẫn, ân cần bảo giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, cán kĩ thuật viên môn Vi sinh Sinh học, môn Công nghiệp dƣợc trường Đại Học Dược Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tơi xin cảm ơn đến ban giám hiệu thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tạp hồn thành đề tài cao học Tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm động viên suốt thời gian qua Do thời gian có hạn, nên luận văn khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong đóng góp ý kiến thầy bạn bè để đề tài hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2011 Học viên Nguyễn Thị Cẩm Vân -3- MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng kháng sinh .2 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cơ chế tác dụng KS 1.1.4 Ứng dụng chất kháng sinh .3 1.2 Đại cƣơng xạ khuẩn 1.2.1 Một số đặc điểm 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 1.2.3 Phân loại chi Streptomyces 1.3 Cải tạo giống xạ khuẩn tổng hợp kháng sinh .6 1.3.1 Chọn lọc ngẫu nhiên .6 1.3.2 Đột biến nhân tạo 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh .7 1.4.1 Lên men bề mặt 1.4.2 Lên men chìm 1.5 Chiết tách, tinh chế 1.5.1 Chiết xuất 1.5.2 Tách tinh chế .9 1.6 Nghiên cứu cấu trúc KS đo phổ 10 1.6.1 Phổ hồng ngoại .10 1.6.2 Phổ tử ngoại 11 1.6.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 11 1.6.4 Khối phổ 12 1.7 Phân loại, xác định tên xạ khuẩn kỹ thuật gen 12 -4- 1.7.1 Kỹ thuật nhân gen PCR 13 1.7.2 Phương pháp giải trình tự gen 14 1.8 Một số nghiên cứu liên quan 16 Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên liệu .19 2.1.1 Chủng xạ khuẩn 19 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định .19 2.1.3 Các công thức môi trường 19 2.1.4 Vật liệu dùng sắc ký 20 2.1.5 Một số dụng cụ, máy móc 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp nuôi giữ giống ống nghiệm 21 2.2.2 Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên 21 2.2.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 22 2.2.4 Phương pháp đột biến ánh sáng UV 23 2.2.5 Phương pháp lên men gián đoạn 23 2.2.6 Phương pháp chiết xuất kháng sinh .24 2.2.7 Xác định cấu trúc phân tử kháng sinh phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân phổ khối 25 Chƣơng – KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 26 3.1 Nghiên cứu cải tạo giống lên men sinh tổng hợp kháng sinh 26 3.1.1 Kết chọn lọc ngẫu nhiên .26 3.1.2 Đột biến lần 27 3.1.3 Đột biến lần 28 3.2 Kết lên men chìm .29 3.2.1 Chọn mơi trường lên men chìm .29 3.2.2 Kết lên men biến chủng tốt môi trường MT1dd 29 3.3 Chiết tách, tinh chế nghiên cứu thành phần KS 30 -5- 3.3.1 Chiết kháng sinh dung môi hữu .30 3.3.2 Sắc ký lớp mỏng thăm dò thành phần kháng sinh từ dịch lọc 33 3.3.3 Kết tinh chế kháng sinh sắc ký cột 33 3.4 Sơ xác định cấu trúc phân tử KS 40 3.4.1 Kết phổ hồng ngoại 40 3.4.2 Kết phổ hồng ngoại 40 Chƣơng 4- BÀN LUẬN 42 4.1 Nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 155.16 42 4.2 Chiết xuất tinh chế kháng sinh 43 4.3 Biện giải phổ thành phần kháng sinh 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .48 PHỤ LỤC -6- DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ATCC American Type Culture Collection DM Dung môi ĐB Đột biến HSCC Hệ sợi chất HSKS Hệ sợi khí sinh IR Infrared (hồng ngoại) ISP International Streptomyces Project (chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh MT Môi trường NMR Nuclear magnetic resonance PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên SKLM Sắc ký lớp mỏng STH Sinh tổng hợp UV Ultra violet (tử ngoại) VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật -7- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học Bảng 2.2: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định 20 Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn [g/100ml] 21 Bảng 2.4: Các dung môi chiết khảo sát 22 Bảng 3.5: Kết chọn lọc tự nhiên chủng Streptomyces 155.16 26 Bảng 3.6: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần 27 Bảng 3.7: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần 28 Bảng 3.8: Kết đánh giá hoạt tính kháng sinh mơi trường 29 lên men Bảng 3.9: Kết lên men biến chủng tốt môi trường 30 MT1dd Bảng 3.10: Kết chọn dung môi pH chiết kháng sinh 31 Bảng 3.11:Kết tách kháng sinh dịch chiết sắc ký lớp 33 mỏng Bảng 3.12: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau sắc ký cột lần 34 Bảng 3.13: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau sắc ký cột lần 36 Bảng 3.14: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau sắc ký cột lần 37 Bảng 3.15: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau sắc ký với hệ dung 38 mơi Bảng 3.16: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau sắc ký với hệ dung môi -8- 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với phát triển xã hội, mơ hình bệnh tật nước ta ngày đa dạng vai trò kháng sinh điều trị ngày nâng cao Kháng sinh lớp hoạt chất hữu ích có tác dụng sinh học mạnh, tổng hợp từ vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm từ số thực vật bậc cao Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ sinh học đại hỗ trợ nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm ứng dụng kháng sinh đạt thành tựu rực rỡ Con người khơng tìm kiếm chủng vi sinh vật sinh kháng sinh từ tự nhiên mà cải tạo chúng nhiều phương pháp dùng kỹ thuật di truyền, công nghệ gene, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp Trong số 15000 kháng sinh biết đến giới khoảng 60% xạ khuẩn tạo ra, chủ yếu chi Streptomyces sản xuất Đây chi xạ khuẩn lớn, gồm nhiều vi sinh vật có khả sinh tổng hợp kháng sinh, số lồi có khả sinh tổng hợp chất chữa ung thư, điều trị HIV Do đó, chi xạ khuẩn nước ta tập trung nghiên cứu Qua nghiên cứu ban đầu cho thấy chủng Streptomyces 155.16 môn Vi sinh- Sinh học cung cấp có hoạt tính kháng sinh mạnh ổn định, phổ rộng có nhiều tiềm thực tế nên chúng tơi chọn đề tài: ”Nghiên cứu q trình sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155.16” với mục tiêu: Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng tăng sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 155.16 Chiết tách, tinh chế, nghiên cứu sơ xác định cấu trúc thành phần kháng sinh chủng Streptomyces 155.16 -9- Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa Kháng sinh hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc VSV (cũng tế bào ung thư) nồng độ thấp [4] 1.1.2 Phân loại Có nhiều cách phân loại KS: phân loại theo nguồn gốc, theo chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học Trong phân loại theo cấu trúc hóa học xem khoa học nhất: [4] Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học KS cụ thể Nhóm KS - lactam Penicillin, Cephalexin Phenicol Chloramphenicol Aminosid Streptomycin, Tobramycin Macrolid Erythromycin, Clarithromycin Lincosamid Lincomycin, Lindamycin Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin Peptid Vancomycin, Polymycin Quinolon Cotrimoxazol Floxacin, Levofloxacin Cotrimoxazol 1.1.3 Cơ chế tác dụng KS Các KS tác động đến trình sinh tổng hợp tế bào [4]:  Ức chế trình tổng hợp vách VK (penicillin, bacitracin, vancomycin )  Ức chế chức màng tế bào (colistin, polymycin, amphotericin )  Ức chế trình sinh tổng hợp protein (Aminoglycosid, Macrolid, tetracyclin )  Ức chế trình tổng hợp acid nucleic (Actinomycin, rifamicin, ) - 10 - Tuy nhiên ta thấy hiệu cải tạo giống lần đột biến chưa cao Nguyên nhân tiến hành đột biến nhiều lần với tác nhân tia UV nên mức độ cải tạo đặc tính chủng lần sau giảm dần Để xạ khuẩn sinh tổng hợp kháng sinh cần tiến hành lên men xạ khuẩn mơi trường dinh dưỡng thích hợp Để lựa chọn chủng cho hiệu suất lên men cao nhất, đề tài tiến hành lên men chìm dạng chủng tốt (3 dạng chủng 13, 17, 23 SLNN; biến chủng 4, 26, 32 đột biến lần biến chủng 4, 5, đột biến lần 2) môi trường dịch thể (MT1dd) nhiệt độ 280C Sau trình lên men chọn biến chủng đột biến lần (ĐB2.6) có hoạt tính sinh tổng hợp KS cao Biến chủng đề tài lựa chọn cho trình lên men chìm để thu kháng sinh 4.2 Chiết xuất tinh chế kháng sinh Sau trình lên men, kháng sinh Streptomyces 155.16 sinh tổng hợp nằm dịch lên men hỗn hợp gồm nhiều thành phần kháng sinh tạp chất nên việc tách chiết, tinh chế để thu sản phẩm tinh khiết quan trọng Đề tài lựa chọn phương pháp chiết dung môi hữu để thu lấy KS thô từ dịch lên men Dịch lên men sau loại sinh khối tiến hành chiết với loại dung môi hữu với mức pH khác để tìm dung mơi pH chiết tối ưu Kết cho thấy, dung môi ethyl acetat pH chiết kiệt kháng sinh nhất, kháng sinh chiết pha ethyl acetat có hoạt tính cao Cất quay chân khơng dịch chiết để thu kháng sinh thô, tiến hành sắc ký lớp mỏng để thử độ tinh khiết sản phẩm dựa khả bị hấp phụ khác chất bề mặt chất rắn (Silicagel) từ xác định thành phần kháng sinh làm sở cho trình tinh chế Các mỏng chấm dịch chiết kháng sinh sau chạy sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khảo sát cho vết kháng sinh, chứng tỏ dịch chiết kháng sinh có thành phần kháng sinh hoạt động Các vết kháng sinh mỏng có vết kéo dài chứng tỏ kháng sinh thơ lẫn nhiều tạp chất Hệ dung môi gồm Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1) thử hình - 50 - VSV quan sát thấy vòng vơ khuẩn có hình giọt nước nên vết kháng sinh có thành phần Hệ có khả tách tốt hệ khảo sát lại nên chọn làm hệ dung môi để chạy sắc ký cột Tiến hành sắc ký cột để tinh chế kháng sinh với pha tĩnh silicagel hoạt hóa, pha động hệ dung môi khảo sát Dung môi thấm qua cột tác dụng trọng lực kéo theo chất hòa tan hỗn hợp cần tách Các chất có lực lớn với pha tĩnh chuyện động chậm qua hệ thống sắc ký so với chất tương tác yếu pha nên ta tách chất qua q trình sắc ký [33] Các phân đoạn có hoạt tính kháng sinh chạy sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi thu phân đoạn (3-5) có Rf Gộp chung phân đoạn sấy khô ta thu kháng sinh tinh chế Để kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm, lấy dịch kháng sinh tinh chế chạy sắc ký lớp mỏng Kết cho thấy có vết kháng sinh mờ chứng tỏ KS thu lẫn tạp, chưa đạt độ tinh khiết mong muốn Sau q trình khảo sát với hệ dung mơi khác để chạy sắc ký cột, lựa chọn hệ dung mơi gồm Ethylacetat: Dicloromethan (9:1) có khả tách tốt nên sử dụng hệ làm hệ dung mơi khai triển cho q trình chạy sắc ký cột lần Kết sau chạy cột thử lại sắc ký lớp mỏng với dung mơi hệ cho thấy có vết kháng sinh chứng tỏ KS thu chưa tinh khiết Chúng tiến hành sắc ký cột lần để tinh chế KS với hệ dung mơi có thành phần Ethyl acetat: Dicloromethan (5:1) Các phân đoạn (6-11) có Rf, có hoạt tính KS mạnh gộp lại đem cô chân không thu thành phần kháng sinh Kháng sinh đem thử SKLM có vết tròn, khơng chứng tỏ kháng sinh thu tinh khiết tiến hành đo phổ để định hướng cấu trúc 4.3 Biện giải phổ thành phần kháng sinh Sau q trình tách chiết, tinh chế việc phân tích phổ thành phần kháng sinh tinh khiết thu nhằm định hướng cấu trúc kháng sinh coi khâu then chốt trình nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh - 51 -  Từ đỉnh hấp thụ ghi lại phổ hồng ngoại, đối chiếu với bước sóng đặc trưng cho liên kết, đưa số nhận xét thành phần nhóm chức xuất cấu trúc thành phần kháng sinh chính: - 648 cm-1, 763 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-X (với X= Cl, Br) -R - 858 cm-1 đặc trưng cho liên kết vòng furan - 1107 cm-1 đặc trưng cho liên kết –C-O acid carboxylic - 1386 cm-1 đặc trưng cho liên kết vài nhóm methyl –CH3 kết hợp nguyên tử C - 1471 cm-1 đặc trưng cho liên kết muối amoni NH4+ liên kết –C=C- vòng thơm - 1640 cm-1 đặc trưng cho liên kết –C=O hoặcl liên kết –C=C- liên hợp - 1746 cm-1 đặc trưng cho liên kết –C=O acid carboxylic monome - 2352 cm-1 đặc trưng cho liên kết –NH [R3NH]3+A- 2928 cm-1 đặc trưng cho liên kết –NH2 [R2NH2]+A- liên kết –CH mạch thẳng - 3422 cm-1 đặc trưng cho liên kết –NH amid amin thơm bậc 1, alcol bậc Như sơ dự đốn kháng sinh có nhóm chức amin, amid, acid carboxylic, aldehyd, este, có nhân thơm, muối amin bậc 2, bậc  Với đỉnh hấp thụ phổ hồng ngoại kháng sinh phụ ta có số liên kết đặc trưng cấu trúc tương tự thành phần kháng sinh 620 cm-1, 1104 cm-1, 1383 cm-1, 1472 cm-1, 1640 cm-1, 1748 cm-1, 3418 cm-1 tương đương với đỉnh hấp thụ 648 cm-1,1107 cm-1, 1386 cm-1, 1471 cm-1, 1640 cm-1, 1746 cm-1 , 3422 cm-1 phổ tử ngoại kháng sinh phụ Ngoài đỉnh trên, kháng sinh phụ có đỉnh hấp thụ khác tương ứng với liên kết : - 52 - - 699 cm-1 đặc trưng cho liên kết –NH2 amin bậc I liên kết trans RCH=CHR’ - 806 cm-1 đặc trưng cho liên kết đặc trưng cho liên kết –NH2 amin mạch thẳng RCH2NH2 - 887 cm-1 đặc trưng cho liên kết OH acid carboxylic dime - 2761 cm-1 đặc trưng cho liên kết amin mạch thẳng bậc RCH2NR’2 - 2924 cm-1 đặc trưng cho liên kết amin mạch thẳng bậc RCH2NHR’ Như vậy, sơ dự đốn kháng sinh phụ có nhóm chức amin, amid, acid carboxylic, aldehyd, este, có nhân thơm, khơng có muối amin bậc 2, bậc có chứa liên kết amin mạch thẳng bậc 2, bậc Do có số nhóm chức khác với thành phần kháng sinh nên nhiệt độ nóng chảy chất KS KS phụ khác nhau: Tchính = 198,5C – 204 C, Tphụ = 160,3C -165C  Từ kết đo UV cho thấy kháng sinh có đỉnh hấp thụ tương ứng với bước sóng λmax λ1 = 193,50 nm, λ2 = 253,50 nm λ3 = 424,50 nm, λ4 = 443,00 nm Với vết kháng sinh phụ, phổ UV có đỉnh hấp thụ tương đương với bước sóng λ1 = 254,00 nm, λ2 = 425,00 nm, λ3 = 443,00nm Các đỉnh hấp thụ tương ứng với chuyển dịch điện tử từ n lên π* Trong n cặp điện tử tự (không liên kết) dị nguyên tử O, N, S, halogen Như kháng sinh nghiên cứu hợp chất có chứa điện tử n liên kết π Hay nói cách khác cấu trúc kháng sinh có nhân thơm, nối đơi liên hợp, có chứa dị tố, kết hợp yếu tố  Đã tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1H-NMR 13C-NMR) Tuy nhiên hạn chế mặt thời gian nên kết chưa hoàn thành - 53 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua q trình nghiên cứu, chúng tơi hoàn thành mục tiêu đề rút số kết luận sau đây:  Sau cải tạo chủng Streptomyces 155.16 phương pháp đột biến nhân tạo đề tài lựa chọn biến chủng số lần đột biến để tiến hành q trình lên men  Mơi trường nuôi cấy bề mặt tốt MT1 môi trường lên men tốt MT1 lỏng (MT1dd) Dung môi chiết tối ưu Ethyl acetat pH  Hệ dung môi tốt để tách chất thu sau chiết hệ (Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1)) Tuy nhiên để thu kháng sinh tinh khiết cần phải chạy sắc ký cột lần hệ dung môi (Ethyl acetat: Dicloromethan (9:1)) lần hệ dung môi (Ethyl acetat: Dicloromethan (5:1))  Có thành phần bột kháng sinh thô thu Hiệu suất thu kháng sinh tinh khiết đạt 8,67%  Kháng sinh tinh khiết thu có số đặc điểm sau:  Kháng sinh có màu đỏ cam, tan tốt methanol, butanol, cloroform  Có phổ tác dụng rộng vi khuẩn Gr(+) Gr(-)  Hấp thụ ánh sáng tử ngoại cho đỉnh hấp thụ λ1 = 193,50 nm, λ2 = 253,50 nm λ3 = 424,50 nm, λ4 = 443,00 nm, kháng sinh thu có nhân thơm hay nối đơi liên hợp, có chứa dị tố tổng hợp yếu tố  Biện giải phổ hồng ngoại sơ dự đoán kháng sinh có nhóm chức: amin, amid, acid carboxylic, aldehyd, este, có nhân thơm, muối amin bậc 2, bậc  Đã tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân nhiên chưa có kết  Nhiệt độ nóng chảy Tchính = 198,5C – 204 C  Kháng sinh phụ có đặc điểm  Kháng sinh có màu cam, tan tốt methanol, butanol, chloroform - 54 -  Có phổ tác dụng rộng vi khuẩn Gr(+) Gr(-)  Hấp thụ ánh sáng tử ngoại cho đỉnh hấp thụ λ1 = 254,00 nm, λ2 = 425,00 nm, λ3 = 443,00nm Như kháng sinh thu có nhân thơm hay nối đơi liên hợp, có chứa dị tố tổng hợp yếu tố  Biện giải phổ hồng ngoại sơ dự đốn kháng sinh có nhóm chức: amin, amid, acid carboxylic, aldehyd, este, có nhân thơm, amin bậc 2, bậc mạch thẳng  Đã tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân nhiên chưa có kết  Nhiệt độ nóng chảy Tphụ = 160,3C -165C KIẾN NGHỊ  Tiếp tục nghiên cứu cải tạo giống để tạo chủng có khả siêu tổng hợp phương pháp (thao tác ADN, dung hợp tế bào …)  Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố thuộc môi trường lên men (cụ thể ảnh hưởng nguồn cacbon, nguồn phosphat, nguồn nito khác nhau) yếu tố thuộc điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ thơng khí, pH mơi trường) tới trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh  Tiếp tục nghiên cứu phương pháp chiết tách nhằm thu sản phẩm tinh khiết với hiệu suất cao  Tiến hành biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR 13C-NMR) kết hợp với kết phổ có để xác định cấu trúc kháng sinh tổng hợp  Tiếp tục giải hệ gen để nhận biết phân loại chủng Streptomyces 155.16  Bước đầu nghiên cứu tìm hiểu ứng dụng lâm sàng kháng sinh tổng hợp - 55 - TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Kiều Hữu Ảnh, Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 48-74, tr 153-180 Bộ mơn Hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, trường Đại học Dược Hà Nội, tr 23-69, 125-147, 215-219, 318 Bộ mơn Hóa Hữu Cơ (2003), Phân tích cấu trúc hợp chất hữu cơ, Trường đại học Dược Hà Nội, tr.4-56 Bộ Y tế, Dược lý học tập 2, NXB Y học, tr.112- 162 Bộ Y tế (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập II, NXB Y học, tr.81- 167 Bộ Y tế, Vi sinh vật học, NXB giáo dục, tr.19-46 Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB giáo dục, p 39-80 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 10 Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm chè Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên, tr.3- 16 11 Đỗ Thu Hà, Động học trình lên men sinh tổng hợp hất kháng sinh chủng xạ khuẩn QN- 29 ĐN- 110 phân lập từ đất khu vực Quảng Nam- Đà Nẵng, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng 12 Đặng Thị Hằng, Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 155.16 (2010), khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường đại học Dược Hà Nội 13 Hoàng Thị Thùy Hương, Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 21.123, Luận văn thạc sĩ, Trường đại học Dược Hà Nội 14 Lê Gia Hy cộng (1992), "Tính đối kháng xạ khuẩn phân lập từ đất Việt Nam bệnh đạo ơn”, Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4, tr.11-12 15 Biền Văn Minh, Phạm Văn Ty, Kiều Hữu ảnh, Phạm Hồng Sơn, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thị hu Thủy (2006), Giáo trình vi sinh vật học,Nhà xuất Đại học Huế, tr.153- 171 16 Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Xây dựng, Hà Nội, tr.47- 49 17 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen-Nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, tr.101-179.] 18 Nguyễn Văn Thanh, Công nghệ sinh học dược, Bộ Y tế, NXB giáo dục, p 2080 19 Trần Thị Thanh, Công nghệ vi sinh (2001), NXB giáo dục, p 1-18, 120- 137 20 Cao Văn Thu, Chu Thị Lộc, Trương Quốc Tuấn (1993), “Góp phần nghiên cứu số loài Micromonospora sinh tổng hợp kháng sinh từ bùn, bùn cát - 56 - 21 Việt Nam”, Tạp chí Dược học, 5, tr.8- 11 Cao Văn Thu, Phan Văn Kiệm, Bùi Việt Hà (2010), “Actinomycin X2, chất kháng sinh phân lập từ trình lên men sinh tổng hợp”, Tạp chí Hóa học, T 48 (4), Tr 469-474 22 Cao Văn Thu, Bùi Việt Hà, Quách Thị Lê Hà, Nguyễn Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Thúy Hiền, Phan Văn Kiệm, Võ Thị Linh, Vũ Nguyên Thành, Võ Thị Thu Thủy (2010), “ Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 - Sptreptomyces microflavus”, Tạp chí khoa học công nghệ, T.48 (5), tr 105-2010 23 Trường đại học nông lâm Huế, Vi sinh vật đại cương, tr.19-41 TIẾNG ANH 24 Arnold L Demain1 and Sergio Sanchez (2009), “Microbial drug discovery: 80 years of progress”, The Journal of Antibiotics, p5–16 25 Chandrashekhara S (2010), Isolation and characterization of antibiotic production from soil isolates by fermentation, Vinayaka Missions University Salem, Tamilnadu, India 26 D.K Maheshwari, R.C.Dubey, R Saravanamurthu, “Industrial exploitation of microorganisms”, Chapter applications of streptomyces sp In pharmaceutical industry”, p166- 198 27 Ellis E golub, Martha a ward, and Jonathan S Nishimura (1969), “Biosynthesis of the Actinomycin Chromophore: Incorporation of 3Hydroxy-4-Methylanthranilic Acid into Actinomycins by Streptomyces antibioticus”, Journal of bacteriology, vol 100, p 977-984 28 Elwood B Shirling and David Gottlieb(1969)," Cooperative description of type cultures of Streptomyces, IV Species descriptions from the second, third and fourth studies”, International journal of systematic bacteriology, Vol 19, No.4, p391-512 29 E B Shirling and D Gottlieb ( 1966 ), “Methods for characterization of Streptomyces species”, International journal of systematic bacteriology, Vol 16, No p 313-340 30 George H Jones(1987), “Actinomycin Synthesis in Streptomyces antibioticus: Enzymatic Conversion of 3-Hydroxyanthranilic Acid to4Methyl-3-Hydroxyanthranilic Acid”, Journal of bacteriology, vol 169, p 5575-5578 31 Hapwood, D.A., Bill, M.J., Charter, K.F., T., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M and Schrempf, H (1985), Genetic manipulation of Streptomycetes: A laboratory manual, John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom, p.71-80 - 57 - 32 JIN Zhi-hua, CEN Pei-lin (2004), “Improved production of spiramycin by mutant Streptomyces ambofaciens”,Journal of Zhejiang University Science, p689- 695 33 K Krishna Kumari, P Ponmurugan and N Kannan (2006), “Isolation and Characterization of Streptomyces sp From soil Samples for Secondary Metabolite Production”, Biotechnology 5, p 478- 480 33 Livia Inbar and Aviva Lapidot (1988), “The Structure and Biosynthesis of New Tetrahydropyrimidine Derivatives in Actinomycin D Producer Streptomyces parvulus use of 13C- and 15 N- labeled L- glutamate and 13C and 15N NMR spectroscopy”, The journal of biological chemistry, Vol 263, No 31p 16014-16022 35 M.F.V.Q Sousa1, C.E.Lopes and N.Pereira Jr (2002), "Development of a bioprocess for the production of actinomycin D", Brazilian Journal of Chemical Engineering, Vol 19, No 03, pp 277 - 285 36 Martin Stocks (3/2008), "Streptomyces Technology", Innovation in life sciences 37 Sivakumar K (2001), Actinomycetes of an Indian mangrove (Pitchavaram) environment, An inventory Ph.D Thesis, Annamalai University, Tamil Nadu 38 Tobias Kieser, Mervyn Bibb, Mark J Butiner Keith F Chater, David A Hopwood (2000), Practical Streptomyces Genetic, The John Innes Foundation Norwich, p.170-171 38 Vineeta Singh1, Vandana Praveen1, Feroz Khan2, Chandra Kant Mani Tripathi1 (2009), Phylogenetics of an antibiotic producing Streptomyces strain isolated from soil 39 Yokata, A (1997), Phylogenetic relationship of actinomycetes Atlas of actinomycetes, Asakura Publishing Co Ltd., Japan, p.194-197 - 58 - PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ hồng ngoại thành phần kháng sinh - 59 - - 60 - Phụ lục 2: Phổ hồng ngoại thành phần kháng sinh phụ Phụ lục 3: Phổ tử ngoại thành phần kháng sinh - 61 - Phụ lục 4: Phổ tử ngoại thành phần kháng sinh phụ - 62 - - 63 - - 64 - ... sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 155. 16 Chiết tách, tinh chế, nghiên cứu sơ xác định cấu trúc thành phần kháng sinh chủng Streptomyces 155. 16 -9- Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng kháng. .. hoạt tính kháng sinh mạnh ổn định, phổ rộng có nhiều tiềm thực tế nên chúng tơi chọn đề tài: Nghiên cứu q trình sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155. 16 với mục tiêu: Nghiên cứu cải tạo... ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ CẨM VÂN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ Streptomyces 155. 16 CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 607301