Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể chó phú quốc dựa trên trình tự HV1 thuộc vùng CR trên hệ gen ty thể (tt)

Đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể chó Phú Quốc bằng trình tự vùng CR control region trên genome ty thể” đánh giá sự đa dạng di truyền trong vùng CR của quần thể chó lưng xo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Công trình được hoàn thành tại: Thành phố Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Trần Hoàng Dũng

2 TS Chung Anh Dũng

Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam ngày tháng năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1 Thư viện Quốc gia

2 Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

3 Thư viện Viện KHKTNN Miền Nam

MỞ ĐẦU

1 Giới thiệu

Chó lưng xoáy Phú Quốc là giống chó quý có nguồn gốc từ đảo Phú Quốc (Kiên Giang, Việt Nam), là một trong ba giống chó có xoáy lông ở lưng trên thế giới Hiện nay, chó lưng xoáy Phú Quốc vẫn chưa xác định được chứng nhận chính thức là một giống chó và cũng chưa được xác định nguồn gốc Có ý kiến cho rằng chó lưng xoáy Phú Quốc có nguồn gốc từ chó lưng xoáy Thái Lan vì có cùng kiểu hình lưng xoáy, tuy nhiên, những ý kiến chủ quan này được đưa

ra không dựa trên một căn cứ khoa học nào

DNA ty thể, đặc biệt là vùng kiểm soát (Control Region – CR)

có tốc độ đột biến cao, tạo sự khác biệt về mặt di truyền giữa các cá

thể Đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể chó Phú Quốc

bằng trình tự vùng CR (control region) trên genome ty thể” đánh giá

sự đa dạng di truyền trong vùng CR của quần thể chó lưng xoáy Phú Quốc, tìm hiểu mối quan hệ di truyền với các giống chó khác trên thế giới, từ đó làm cơ sở để suy đoán nguồn gốc của giống chó quý này

2 Mục tiêu của đề tài

Nhận định nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc dựa trên thông tin về đa dạng di truyền vùng CR trên genome ty thể của chó

3 Những đóng góp mới của đề tài

- Lần đầu tiên trên thế giới xây dựng được phần mềm định loại haplotype vùng CR thuộc DNA ty thể của các giống chó trên thế giới

- Đánh giá được sự đa dạng di truyền vùng CR thuộc DNA ty thể của chó lưng xoáy Phú Quốc

- Nhận định được nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc dựa vào các thông tin sinh học phân tử

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này đã cung cấp được những dữ liệu, căn cứ đầu tiên giúp suy đoán nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc Đề tài cung cấp thông tin về đa dạng di truyền và nguồn gốc hình thành chó lưng xoáy Phú Quốc, làm tiền đề cho công tác bảo tồn gen của giống chó lưng xoáy Phú Quốc quý của Việt Nam

5 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

5.1 Đối tượng nghiên cứu

Đề tài thực hiện nghiên cứu trên vùng 582 cặp base thuộc vùng CR DNA ty thể của chó Tổng cộng 200 con chó bao gồm 100 con chó lưng xoáy Phú Quốc và 100 con chó nhà (chó cỏ) Việt Nam được khảo sát trong phạm vi đề tài

5.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu vùng trình tự 582 cặp base thuộc vùng CR DNA ty thể trên 100 con chó lưng xoáy Phú Quốc và 100

con chó nhà Việt Nam Các giống chó trên thế giới được sử dụng trong việc xác định mối quan hệ di truyền với chó lưng xoáy Phú Quốc được chọn dựa trên thông tin về hành trình di cư của chó đã được công bố, và dựa trên sự sẵn có của thông tin, không bao gồm tất

cả các giống chó hiện hữu trên toàn thế giới

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về chó lưng xoáy Phú Quốc

1.1.1 Giới thiệu về chó lưng xoáy Phú Quốc

Chó lưng xoáy sống tại đảo Phú Quốc thuộc vùng biển tỉnh Kiên Giang là một giống chó đặc trưng với nhiều đặc tính quý của Việt Nam Trên thế giới hiện có ba giống chó có xoáy lưng, trong đó, chó lưng xoáy Rhodesian ở Nam Phi và chó lưng xoáy Thái Lan đã được Tổ chức giống chó Thế giới (Federation Cynologique Internationale – FCI) công nhận trong danh sách các giống chó giống, riêng chó lưng xoáy Phú Quốc của Việt Nam vẫn chưa được chấp thuận Nhiều bằng chứng lịch sử đã được các nhà khoa học công bố nhằm chứng minh nguồn gốc đặc chủng của chó lưng xoáy Phú Quốc nhưng tính thuyết phục của các dẫn liệu này chưa cao Cho đến nay, nguồn gốc tiến hóa và mối quan hệ di truyền của giống chó này vẫn chưa được nghiên cứu một cách tường tận

1.1.2 Phân loại chó lưng xoáy Phú Quốc

1.1.3 Đặc điểm hình thái và tập tính của chó lưng xoáy Phú Quốc 1.1.4 Các nghiên cứu về nguồn gốc và di truyền chó lưng xoáy Phú Quốc

Đến nay, ngoài Việt Nam, chưa có nghiên cứu về nguồn gốc

và di truyền của chó Phú Quốc Trần Hoàng Dũng và cộng sự (2017) bước đầu đã phân tích DNA và chứng minh có mối quan hệ di truyền giữa chó lưng xoáy Phú Quốc mang haplotype E4 với giống chó Pungsan ở Triều Tiên

1.2 Đặc điểm di truyền của tính trạng xoáy lưng

Tính trạng xoáy lưng ở chó lưng xoáy do allele trội R trên nhiễm sắc thể số 18 quy định Ngoài ra, chó mang cặp allele RR còn

có nguy cơ bị u nang biểu bì cao, làm ảnh hưởng đến sức sống của chó (Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Tương quan giữa kiểu gen và các kiểu hình xoáy lưng, u

1.3.1 Cấu trúc bộ gen ty thể của chó

1.3.2 Cấu trúc và đặc điểm di truyền vùng CR trên bộ gen ty thể của chó

Vùng CR ở DNA ty thể chó bao gồm ba vùng nhỏ, trong đó vùng HV1 và HV2 là hai vùng siêu biến, có tính đa hình cao Trong

đó vùng HV1 thường được dùng trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền nhằm tìm hiểu nguồn gốc phát sinh loài của các giống chó

Hình 1.4: Vị trí và thành phần vùng CR trong DNA ty thể chó

1.4 Các nghiên cứu về nguồn gốc tiến hóa, phát sinh chủng loại

và đa dạng di truyền của chó

1.4.1 Các nghiên cứu khảo cổ

1.4.2 Các nghiên cứu di truyền hiện đại

1.4.2.1 Các chỉ thị phân tử được dùng trong nghiên cứu

Nhiều trình tự DNA mục tiêu khác nhau đã được sử dụng trong nghiên cứu di truyền ở chó như các siêu tiểu vệ tinh, nhiễm sắc thể Y, COI, CytB….Đặc biệt, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tập trung nghiên cứu sự đa hình của vùng 582 cặp base DNA ty thể để tìm hiểu về nguồn gốc và sự hình thành của nhiều giống chó khác nhau

1.4.2.2 Nghiên cứu về nguồn gốc tiến hóa của chó nhà

Trên cây phát sinh chủng loại dựa trên đoạn trình tự 582 cặp base vùng HV1 của các giống chó trên toàn thế giới, các haplotype của chó và chó sói phân bố thành 6 nhóm và được đặt tên lần lượt là các haplogroup A, B, C, D, E và F Có 72,34% chó trên thế giới thuộc haplogroup A; 97,40% chó thuộc haplogroup A, B hoặc C Chó mang haplotype thuộc nhóm D, E, F chiếm chưa đến 3%, có vị trí phân bố hẹp, được cho là kết quả của lần thuần hóa thứ hai giữa chó

và chó sói Dựa vào sự phân bố của các haplotype, Wang và cs (2016) đã nhận định về vị trí khởi đầu và con đường di cư của chó như hình 1.8

Hình 1.8: Vị trí khởi đầu và con đường di cư của chó

1.4.2.3 Nghiên cứu về đa dạng di truyền của các giống chó

Độ đa dạng di truyền của giống chó rất khác nhau, phản ảnh

vị trí phân bố và thời điểm hình thành của giống chó Các giống chó phân bố ở những vùng bị cách ly thì độ đa dạng haplotype rất thấp, như giống chó Castro Laboreiro Bồ Đào Nha (0,1) Trong khi đó, giống chó Shiba của Nhật Bản có nguồn gốc từ 3 dòng chó thuộc 3 vùng địa lý khác nhau thì có độ đa dạng haplotype khá cao (0,8161)

1.5 Cơ sở dữ liệu DNA GenBank và dữ liệu vùng trình tự HV1 DNA ty thể

1.5.1 Cơ sở dữ liệu DNA GenBank

1.5.2 Dữ liệu về trình tự vùng HV1 DNA ty thể trên GenBank

Dữ liệu về trình tự vùng HV1 DNA ty thể được lưu trữ nhiều trên ngân hàng gen GenBank Cũng như nhiều trường hợp đã công bố trước đây, dữ liệu về trình tự DNA này có nhiều thông tin không chính xác hoặc không nhất quán, cần phải được sửa sai và thống

- Sự đa dạng di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc cùng với mối quan hệ di truyền của giống chó này với các giống chó khác trên thế giới sẽ là cơ sở nhận định về nguồn gốc của giống chó này

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Xây dựng cơ sở dữ liệu và phần mềm định loại haplotype đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể chó

- Nội dung 2: Xác định trình tự nucleotide đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể của chó nhà Việt Nam và chó lưng xoáy Phú Quốc

- Nội dung 3: Đánh giá sự đa dạng di truyền của chó lưng xoáy Phú Quốc dựa trên đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể

- Nội dung 4: Nhận định nguồn gốc của chó lưng xoáy Phú Quốc

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu và phần mềm định loại haplotype đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể

2.2.1.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu các trình tự đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể

Cơ sở dữ liệu được thiết kế theo mô hình quan hệ bao gồm 6 bảng có mối quan hệ ràng buộc với nhau Mỗi bảng chứa thông tin riêng biệt về trình tự: haplotype, trình tự nucleotide, tên loài Các trình tự nucleotide được thu thập từ GenBank bởi phần mềm tự xây dựng Thông tin của các trình tự được tách từ bảng ghi của GenBank

và được lưu trữ vào cơ sở dữ liệu

2.2.1.2 Đánh số nucleotide và trình bày các đột biến

2.2.1.3 Xác định haplotype và hiệu chỉnh dữ liệu

Những thông tin về haplotype của các trình tự DNA bị sai lệch hoặc không rõ ràng sẽ được phát hiện và điều chỉnh Quá trình này sẽ được tiến hành với các luật sau:

1 Trình tự đầu tiên được dùng để công bố một haplotype sẽ được ghi nhận là trình tự chuẩn của haplotype đó

2 Trình tự giống trình tự chuẩn của một haplotype đã công

bố nhưng được dùng để công bố haplotype khác thì haplotype sau sẽ

bị loại ra khỏi danh sách haplotype đã được công bố

3 Trình tự khác với trình tự chuẩn của một haplotype đã công bố nhưng công bố tên giống với haplotype đó thì được xem là công bố sai, thông tin cần phải được hiệu chỉnh

2.2.1.4 Phần mềm xác định haplotype vùng HV1 của DNA ty thể

Phần mềm được viết bằng ngôn ngữ lập trình Perl và HTML, hoạt động ở dạng trang web Phần mềm sẽ phân tích trình tự truy vấn, nhận diện các vị trí đa hình để xác định haplotype hoặc haplogroup

2.2.1.5 Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Các cây phát sinh chủng loại được thiết lập bằng chương trình Paup*, sử dụng phương pháp Neighbor-Joining với 2000 lần lặp

lại để xác định độ tin cậy

2.2.2 Xác định trình tự nucleotide đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể của chó nhà Việt Nam và chó lƣng xoáy Phú Quốc

2.2.2.1 Dụng cụ và thiết bị sử dụng

2.2.2.2 Thu thập và xử lý mẫu

Mẫu vật thu thập là lông của 100 con chó lưng xoáy Phú Quốc và 100 con chó nhà Việt Nam sống tại đảo Phú Quốc, thành phố Rạch Giá (Kiên Giang), Thành phố Hồ Chí Mình và các vùng phụ cận

2.2.2.3 Tách chiết DNA tổng số từ lông chó

DNA từ lông chó được tách chiết theo quy trình được xây dựng trong đề tài, sử dụng Proteinase K để phân hủy protein,

phenol:chloroform để phân tách DNA và các thành phần khác Sau khi được tủa bằng ethanol lạnh với sự có mặt của NaCl, DNA được hòa tan trong nước và trữ ở -30o

độ tin cậy cao

2.2.3 Đánh giá sự đa dạng di truyền của chó lƣng xoáy Phú Quốc dựa trên đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể

Các số liệu trong đề tài được xử lý thống kê bằng phần mềm thống kê R Các biểu đồ thể hiện, minh họa số liệu tính toán được cũng như các chỉ số về đa dạng di truyền quần thể được tính toán bằng phần mềm chuyên dụng Arlequin 3.5

2.2.3.3 Xây dựng mạng lưới quan hệ của các haplotype

Mạng lưới ban đầu thể hiện mối quan hệ giữa các haplotype trong quần thể và số nucleotide sai khác của các haplotype kế cận được tính bởi phần mềm Arlequin Trong trường hợp những haplotype sai khác nhiều hơn 1 nucleotide so với haplotype gần nhất, các haplotype trung gian sẽ được tìm kiếm thủ công trong danh sách các haplotype đã được công bố, và sẽ được chèn vào mạng lưới ở vị trí tương ứng

2.2.3.4 Xác định khoảng cách di truyền giữa hai quần thể

Khoảng cách di truyền (DA) giữa hai quần thể là số nucleotide khác biệt trung bình giữa hai quần thể

2.2.3.5 Phân tích phương sai phân tử (AMOVA)

Độ đa dạng di truyền của quần thể được phân tích ở các mức

độ khác nhau: độ khác biệt giữa các nhóm quần thể nhỏ hơn, giữa các quần thể nhỏ và trong nội bộ các quần thể nhỏ Mức chính xác của

các khác biệt được đánh giá thông qua chỉ số F của kiểm định Fisher 2.2.4 Nhận định nguồn gốc của chó lƣng xoáy Phú Quốc

Nguồn gốc chó lưng xoáy Phú Quốc được nhận định dựa trên

sự tổng hợp các thông tin liên quan thu thập được từ các kết quả của

đề tài cũng như của các nghiên cứu trước đây về loài chó nói chung

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể chó

Bằng công cụ BLAST tìm trong cơ sở dữ liệu về DNA của GenBank, 5567 trình tự nucleotide có nguồn gốc từ các cá thể thuộc loài Canis lupus có độ tương đồng cao với vùng trình tự HV1 của trình tự chuẩn (mã số truy cập GenBank U96639.2) được xác định và lưu trữ vào cơ sở dữ liệu Trong số này, 1921 trình tự chỉ chứa một phần của vùng trình tự 582 cặp base nên không đủ cơ sở để xác định haplotype; 414 trình tự được xác định đúng haplotype theo hệ thống chia thành 6 haplogroup từ A đến F thông dụng hiện nay, 3232 trình

tự có thông tin về haplotype không chính xác hoặc không theo hệ thống thông dụng này hoặc không có thông tin về haplotype đều đã được định loại haplotype và lưu trữ trong cơ sở dữ liệu

Phần mềm xác định nhanh haplotype vùng HV1 của DNA ty thể cũng được xây dựng bằng ngôn ngữ lập trình Perl, chạy trên nền Web và có thể được truy cập miễn phí qua Internet ở địa chỉ http://chd.vnbiology.com Thử nghiệm trên 50 trình tự ngẫu nhiên trong cơ sở dữ liệu cho thấy phần mềm đã hoạt động chính xác, cho kết quả định loại haplotype thích hợp và nhanh hơn kỹ thuật định loại haplotype bằng cây phát sinh chủng loại Các ưu điểm của việc định loại haplotype bằng phần mềm Haplotype identifier so với phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể được tóm tắt trong bảng sau (Bảng 3.5)

Bảng 3.5: So sánh việc định loại haplotype bằng Haplotype identifier

và bằng xây dựng cây phát sinh chủng loại

Haplotype identifier

Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Xác định được haplogroup

Thời gian xác

định haplotype

Nhanh (~ 1 giây/trình tự)

Thời gian xác định lâu, tùy vào phương pháp

sử dụng (10 phút đến 8 giờ)

kỹ thuật định loại haplotype

Người dùng phải nắm được kỹ thuật xây dựng cây phát sinh chủng loại

3.2 Xác định trình tự đoạn 582 cặp base vùng HV1 DNA ty thể chó nhà Việt Nam và chó lƣng xoáy Phú Quốc

3.2.1 Xác định quy trình tách chiết DNA từ lông chó

Bằng cách sử dụng các hóa chất thông dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, và khảo sát các điều kiện ủ mẫu (nhiệt độ, thời gian), một quy trình tách chiết DNA từ lông chó đã được xây dựng như sau (Hình 3.5)

Hình 3.5: Quy trình tách chiết DNA từ lông chó Quy trình tách chiết cho phép thu được DNA toàn phần (gồm DNA trong nhân và DNA ty thể) từ nguồn nguyên liệu là khoảng 40 sợi lông chó DNA thu được có thể được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo

3.2.2 Tách chiết DNA từ lông chó

Hai trăm mẫu lông chó (gồm 100 chó lưng xoáy Phú Quốc

và 100 chó nhà Việt Nam) được đã được sử dụng để tách chiết DNA theo quy trình đã xây dựng Các mẫu DNA thu được có chất lượng tốt, được sử dụng trong các phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự HV1