Nghiên cứu đa dạng di truyền loài sa mu dầu (cunninghamia konishh hayata) đang bị đe dọa tuyệt chủng ở việt nam bằng chỉ thị phân tử microsatellire (ssr)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP&PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI SA MU DẦU (CUNNINGHAMIA KONISHII HAYATA) ĐANG BỊ DE DỌA TUYỆT CHỦNG Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLIRE (SSR) Họ tên học viên : Vũ Thị Thu Hiền Người hướng dẫn : TS Vũ Đình Duy PGS.TS Bùi Văn Thắng Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 1755010293 Hà Nội, 2021 I LỜI CAM ĐOAN Đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Sa mu Dầu (Cunninghamia konishii Hayata) bị đe dọa tuyệt chủng Việt Nam thị phân tử microsatellite (SSR)” Đây đề tài nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học TS Vũ Đình Duy PGS TS Bùi Văn Thắng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, chưa công bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021 Người thực Vũ Thị Thu Hiền I LỜI CẢM ƠN Đề tài nghiên cứu tơi thực phịng thí nghiệm Viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện tạo điều kiện để công việc chuyên môn đề tài tiến hành thuận lợi Khi thực đề tài, nhận động viên giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, bạn bè đồng nghiệp Sự ủng hộ mặt tinh thần dẫn, góp ý, chia sẻ kinh nghiệm, tài liệu vô quý báu khiến thực cảm kích, biết ơn Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Đình Duy PGS.TS Bùi Văn Thắng, người thầy tận tình hướng dẫn tơi q trình hồn thiện luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn góp ý, dẫn, chia sẻ kinh nghiệm cán nghiên cứu thuộc Viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ tơi nhiều q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn cán sở đào tạo trường Đại học Lâm nghiệp tận tâm truyền đạt kiến thức cho suốt khóa học Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy cô làm việc giảng dạy khoa Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình người thân ln bên tơi, động lực để tơi vượt qua khó khăn để hoàn thành luận văn Luận văn thực thơng qua hỗ trợ kinh phí Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga, Bộ Quốc phòng cho đề tài: “Ứng dụng phương pháp thông tin địa lý (GIS) kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ điều tra, giám sát phát triển loài Sa mu dầu (Cunninghamia konishii Hayata) Việt Nam” thời gian từ 2020 – 2022 Chủ nhiệm: Phạm Mai Phương Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021 Người Thực Hiện Vũ Thị Thu Hiền II MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II DANH MỤC HÌNH V DANH MỤC BẢNG VI BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT VII MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận văn PHẦN I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Nghiên cứu phân loại phân bố loài Sa mu dầu 1.2 Nghiên cứu giá trị sử dụng loài Sa mu dầu 1.3 Một số thị phân tử dùng phân tích đa dạng di truyền quần thể loài thực vật 1.3.1 Kỹ thuật isozyme 1.3.2 Kỹ thuật RAPD 1.3.3 Kỹ thuật RFLP 1.3.4 Kỹ thuật AFLP 10 1.3.5 Kỹ thuật SSR 10 1.3.6 Kỹ thuật ISSR 11 1.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Sa mu dầu Việt Nam giới 11 1.4.1 Ngoài nước 11 1.4.2 Trong nước 14 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu, thiết bị hóa chất nghiên cứu 16 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.2 Thiết bị hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 III 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp tổng quan tài liệu 17 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm 17 2.3 Phân tích số liệu 20 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1.Tách chiết ADN tổng số, hàm lượng độ tinh ADN 88 mẫu Sa mu dầu 21 3.2 Phản ứng PCR-SSR, điện di sản phẩm PCR-SSR gel polyacrylamide 8% 26 3.3 Mức độ đa dạng di truyền quần thể Sa mu dầu thị phân tử SSR 27 3.3.1 Đa dạng di truyền quần thể Sa mu dầu 27 3.3.2 Phân tích phương sai phân tử (AMOVA) 28 3.4 Mối quan hệ di truyền khoảng cách quần thể Sa mu dầu 29 3.4.1 Khoảng cách di truyền hệ số tương đồng di truyền quần thể 29 3.4.2 Mối quan hệ di truyền quần thể Sa mu dầu 30 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 4.1 Kết luận 31 4.2 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 IV DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sa mu dầu tự nhiên Kỳ Sơn, Nghệ An Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 17 Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số số mẫu đại diện cho loài Sa mu dầu gel agarose 1% 21 Hình 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR - SSR gel polyacrylamide 8% với số mồi SSR 26 Hình 3.3 Mối quan hệ di truyền quần thể Sa mu dầu sở khoảng cách di truyền 30 V DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Địa điểm số mẫu Sa mu dầu thu thập cho nghiên cứu 16 Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 2.3 Chu trình phản ứng PCR 18 Bảng 2.4 Trình tự nucleotide cặp mồi SSR nghiên cứu 19 Bảng 3.1 Độ hàm lượng ADN 88 mẫu Sa mu dầu 22 Bảng 3.2 Thông số đa dạng di truyền quần thể Sa mu dầu phân tích với thị phân tử SSR 28 Bảng 3.3 Phương sai phân tử (AMOVA) quần thể quần thể Sa mu dầu 29 Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền (dưới) hệ số tương đồng di truyền (trên) theo công thức Nei (1978) 29 VI BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Giải nghĩa ADN Acid deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism bp Cặp base CI Chỉ số cạnh tranh EN Nguy cấp Fis Hệ số cận noãn ISSR Interal simple sequence repeat NCBI Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học PCR Phản ứng chuỗi polymerase 10 RAPD Random Amplified Polymorphism DNA 11 RFLP Restriction fragment length Polymorphism 12 SNP Đa hình đơn nucleotide 13 SSR Simple Sequence Repeat (Kỹ thuật Microsatellite) 14 TAE Tris - acetate - EDTA 15 UV Tia cực tím 16 VU Loài nguy cấp VII MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Loài Sa mu dầu (Cunninghamia konishii Hayata) 33 lồi thơng địa (Nguyễn Đức Tố Lưu, 2004) có giá trị kinh tế cao cung cấp gỗ, nhựa, tinh dầu, dược liệu, làm cảnh, Mặc dù, Việt Nam 10 điểm nóng Thơng giới (Farjon Page, 1999), nghiên cứu gần chứng minh loài Sa mu dầu nguy cấp liên quan đến nơi sống bị thu hẹp bị phân mảnh (Nguyễn Thị Thanh Nga cộng sự, 2017) Phan Kế Lộc cộng (2013) so sánh vùng phân bố loài diện rộng Lào, Trung Quốc Việt Nam cho thấy lồi có khả tái sinh tự nhiên thấp Danh lục Đỏ IUCN 2020 ver1 xếp Sa mu dầu cấp độ nguy cấp (EN), Sách đỏ Việt Nam (2007) Sa mu dầu xếp vào VU A1a, d, C1 thuộc nhóm I danh lục thực vật rừng động vật rừng nguy cấp quí Nghị định 06/2019/NĐ-CP Chính phủ Do đó, việc đánh giá đa dạng di truyền cho quần thể cịn sót lại cần thiết để từ đưa biện pháp bảo vệ, chiến lược bảo tồn phát triển hiệu nguồn gen quý Để bảo tồn nguồn gen loài thực vật quý hiếm, có nguy tuyệt chủng cao, xác định mức độ trao đổi di truyền bố mẹ quần thể với nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền quần thể loài tự nhiên đóng vai trị quan trọng góp phần đưa chiến lược bảo tồn phục hồi loài hữu hiệu (Gupta Varshney, 2000) Kỹ thuật Microsatellite (SSR) công cụ sử dụng phổ biến cho việc đánh giá đa dạng di truyền thực vật có tính đa hình cao tính kế thừa đồng trội genome Cho đến nay, cơng trình nghiên cứu trước mặt sinh thái học, hay nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền lồi Sa mu dầu cịn hạn chế, sở khoa học cho công tác bảo tồn phát triển bền vững loài Việt Nam đặc biệt thiếu liệu Luận văn nghiên cứu tơi tập trung điều tra tính đa dạng di truyền quần thể loài Sa mu dầu bị đe dọa tuyệt chủng Việt Nam để hiểu rõ chất di truyền quần thể lồi, góp phần giúp nhà quản lý đưa giải pháp tối ưu cho công tác bảo tồn, quản lý, phục hồi phát triển bền vững loài Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Đóng góp cho cơng tác bảo tồn phục hồi hữu hiệu loài quý bị đe doạ Việt Nam Giúp nhà quản lý hiểu biết sâu mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Sa mu dầu Việt Nam Các yếu tố tác động người làm xói mịn cấu trúc di truyền quần thể lồi Mục tiêu giúp cộng đồng nhà khoa học hiểu biết tốt trình tuyệt chủng mức độ tiến hố lồi khơng cho lồi Sa mu dầu áp dụng cho lồi khác có lịch sử sống tương tự Mục tiêu cụ thể: Đánh giá mức độ đa dạng khoảng cách di truyền quần thể loài Sa mu dầu điều kiện môi trường kích thước quần thể khác Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Tách chiết ADN tổng số loài loài Sa mu Dầu (Cunninghamia konishii Hayata) bị đe dọa tuyệt chủng Việt Nam Nội dung 2: Thực phản ứng PCR-SSR quần thể Sa mu dầu Việt Nam với thị phân tử microsatellite (SSR) Nội dung 3: Xác định mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Sa mu dầu Việt Nam dựa thị phân tử SSR Nội dung 4: Xác định mối quan hệ di truyền khoảng cách quần thể Sa mu dầu Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận văn - Áp dụng phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử đại đánh giá đa dạng di truyền quần thể thực vật Việt Nam làm sở khoa học đề xuất giải pháp bảo tồn loài - Kết nghiên cứu giúp cung cấp dẫn liệu đa dạng di truyền cho loài Sa mu dầu Việt Nam Dẫn liệu thu sở khoa học quan trọng để hiểu rõ chất di truyền quần thể tác động môi trường sống, đặc biệt liên quan đến hoạt động người - Kết nghiên cứu góp phần cho cơng tác bảo tồn mức độ quần thể loài Sa mu dầu Việt Nam Nâng cao nhận thức người dân địa phương người quản lý cơng tác bảo tồn lồi Sa mu dầu bị đe dọa 44 XL13 0,514 0,292 1,76 25,7 45 XL14 0,819 0,442 1,85 41 46 XL15 0,843 0,47 1,79 42,2 47 XL16 1,041 0,618 1,89 52 48 XL17 0,63 0,328 1,92 31,5 49 XL18 0,432 0,246 1,76 21,6 50 XL19 0,688 0,371 1,85 34,4 51 XL20 0,513 0,29 1,77 25,6 52 XL21 0,555 0,284 1,95 27,8 53 HSP01 0,047 0,026 1,81 52,4 54 HSP02 0,207 0,109 1,9 60,4 55 HSP03 0,214 0,116 1,85 60,7 56 HSP04 0,282 0,165 1,76 54,1 57 HSP05 0,145 0,066 1,82 57,3 58 HSP06 0,118 0,06 1,95 55,9 59 HSP07 0,203 0,106 1,92 50,1 60 HSP08 0,32 0,183 1,75 66 61 HSP09 0,254 0,138 1,84 52,7 62 HSP10 0,972 0,539 1,8 48,6 63 HSP11 0,804 0,392 2,05 40,2 64 HSP12 0,144 0,073 1,98 57,2 65 HSP13 1,03 0,504 2,04 51,5 66 HSP14 4,533 2,597 1,75 62,7 24 67 HSP15 0,202 0,103 1,95 50,1 68 HSP16 0,317 0,159 1,99 55,9 69 HSP17 1,291 0,605 2,13 64,5 70 HSP18 0,449 0,239 1,88 22,5 71 HSP19 0,182 0,101 1,81 59,1 72 HSP20 0,206 0,102 2,03 50,3 73 HSP21 0,628 0,297 2,11 31,4 74 HSP22 0,371 0,244 1,82 58,5 75 HSP23 0,182 0,088 2,06 59,1 76 HSP24 0,112 0,056 1,99 55,6 77 HSP25 0,042 0,016 1,76 52,1 78 HSP26 0,03 0,015 2,06 51,5 79 XN01 0,748 0,377 1,98 37,4 80 XN02 0,978 0,482 2,03 48,9 81 XN03 1,324 0,647 2,05 66,2 82 XN04 0,952 0,457 2,08 47,6 83 XN05 1,378 0,686 2,01 68,9 84 XN06 1,219 0,601 2,03 60,9 85 XN07 1,522 0,749 2,03 76,1 86 XN08 0,302 0,143 2,11 55,1 87 XN09 1,735 0,86 2,02 86,8 88 XN10 1,13 0,569 1,99 56.5 25 3.2 Phản ứng PCR-SSR, điện di sản phẩm PCR-SSR gel polyacrylamide 8% Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể loài 88 cá thể thu từ quần thể lồi Sa mu dầu chúng tơi tiến hành thực phản ứng PCR-SSR với cặp mồi SSR Sau hoàn thành phản ứng PCR-SSR, sản phẩm PCR - SSR điện di gel polyacrylamide 8% để phân tích đa hình ADN mẫu nghiên cứu Phổ điện di sản phẩm PCR - SSR gel polyacrylamide 8% số cặp mồi minh họa hình 3.2 Hình 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR - SSR gel polyacrylamide 8% với số mồi SSR (A: Mồi SSR1; B: Mồi SSR2; C: Mồi SSR3; D: Mồi SSR4; M: marker phân tử 50bp; Giếng 1-24: tên số mẫu Sa mu dầu) 26 3.3 Mức độ đa dạng di truyền quần thể Sa mu dầu thị phân tử SSR 3.3.1 Đa dạng di truyền quần thể Sa mu dầu Mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Sa mu dầu trình bày Bảng 3.2 Số lượng alen quan sát (Na) trung bình quần thể 2,219 (2,1252,250), alen hữu hiệu (Ne) trung bình 1,845 (1,721-1,970) Chỉ số đa dạng Shannon (I) trung bình 65,3% (58-71,1%), Tỷ lệ dị hợp tử quan sát (Ho) trung bình 0,423 (0,339-0,505) Tỷ lệ dị hợp tử mong đợi (He) 0,427 (0,363-0,468) Quần thể XN có mức độ đa dạng di truyền thấp (Ho = 0,339 He = 0,363) quần thể PH có mức độ đa dạng di truyền cao (Ho = 0,505 He = 0,428) Trung bình đa dạng di truyền quần thể Sa mu dầu mức trung bình (Na = 2,219; Ne = 1,845; I = 0,489, Ho = 0,423 He = 0,427) Nguyên nhân của kết hạn chế số cá thể nghiên cứu quần thể Hơn nữa, suy giảm rừng liên quan đến hoạt động người, đặc biệt nơi sống chúng bị phá hủy bị suy giảm nghiêm trọng, kích thước quần thể nhỏ loài Sa mu dầu ngun nhân giải thích mức độ đa dạng di truyền trung bình lồi Sa mu dầu Hệ số cận noãn (Fis) gia tăng tỉ lệ cá thể mang gen đồng hợp tử locus trưởng thành Đây mức giảm dự kiến suốt trình giao phối kiểu gen dị hợp Hệ số dị hợp tử nằm khoảng từ (đối với cá thể dị hợp) đến (đối với cá thể đồng hợp hoàn toàn) Cận noãn gần tạo gia tăng tỉ lệ đồng hợp tử lặn, dẫn đến biểu số allele lặn có hại bẩm sinh Làm cho giống lồi bị làm giảm sức chống chịu Trong quần thể Sa mu dầu nghiên cứu tỷ lệ dị hợp tử quan sát (Ho) lớn tỷ lệ dị hợp tử mong đợi (He), hệ số giao phối cận huyết quần thể (Fis) có giá trị âm (Fis < 0) quần thể PH Nghệ An, cho thấy vượt trội đáng kể kiểu gen dị hợp tử quần thể hay nói cách khác quần thể không xảy xảy thấp tượng giao phối cận huyết tự thụ phấn quần thể nghiên cứu Điều cho thấy tỷ lệ thụ phấn chéo quần thể quần thể lại (XN, XL HSP) hệ số giao phối cận huyết quần thể (Fis) có giá trị dương (Fis > 0), thiếu hụt gen dị hợp tử quần thể Tuy nhiên, hệ số dương thấp xuất quần thể XL, điều phản ánh tính đa dạng di truyền cao quần thể 27 Bảng 3.2 Thông số đa dạng di truyền quần thể Sa mu dầu phân tích với thị phân tử SSR Quần thể N Na Ne I HO He Fis XN 31 2,250 1,721 0,580 0,339 0,363 0,158 PH 26 2,250 1,818 0,658 0,505 0,428 -0,128* XL 21 2,250 1,970 0,711 0,399 0,468 0,212 HSP 10 2,125 1,870 0,663 0,450 0,448 0,061 2,219 1,845 0,653 0,423 0,427 0,076 Trung bình Ghi chú: N: Số mẫu phân tích; Na: Số alen quan sát; Ne: Số alen hiệu quả; I: Chỉ số đa dạng Shannon; He: Tỷ lệ dị hợp tử mong đợi; Ho: Tỷ lệ dị hợp tử quan sát; Fis: hệ số giao phối cận huyết với p < 0,05 3.3.2 Phân tích phương sai phân tử (AMOVA) Kết phân tích phương sai phân tử (AMOVA) quần thể cá thể quần thể bảng 3.3 cho thấy, tổng mức độ thay đổi phân tử thấp quần thể (24%) cao cá thể quần thể (76%) với giá trị P