Xây dựng một số tiêu chuẩn và đánh giá độc tính cấp cao khô lá đu đủ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ HUY TRUNG XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP CAO KHƠ LÁ ĐU ĐỦ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ HUY TRUNG Mã sinh viên: 1301437 XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP CAO KHƠ LÁ ĐU ĐỦ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Quỳnh Chi ThS Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu Bộ môn Dược lực HÀ NỘI - 2018 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đu đủ (Carica papaya L.) 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Nguồn gốc phân bố 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Công dụng tác dụng dược lý 1.1.6 Độc tính 12 1.1.7 Các nghiên cứu đu đủ Việt Nam 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 15 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 15 2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Xây dựng số tiêu cho tiêu chuẩn cao khô đu đủ 17 2.2.2 Đánh giá độc tính cấp cao khô đu đủ 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Xây dựng số tiêu cho tiêu chuẩn cao khô đu đủ 17 2.3.2 Đánh giá độc tính cấp cao khô đu đủ 21 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Xây dựng số tiêu cho tiêu chuẩn cao khô đu đủ 23 3.1.1 Đánh giá sơ thành phần hóa học mẫu thu hái 23 3.1.2 Phân lập carpain 24 3.1.3 Điều chế cao khô đu đủ 27 3.1.4 Xây dựng tiêu chuẩn cao khô đu đủ 27 3.2 Kết đánh giá độc tính cấp cao khơ đu đủ 30 3.3 Bàn luận 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC LỜI CẢM ƠN Trong trình thực khóa luận tốt nghiệp, tơi nhận hướng dẫn giúp đỡ thầy cơ, gia đình bạn bè Trước tiên, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quỳnh Chi, người thầy giàu lòng đam mê, ln tận tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt cho tơi nhiều kiến thức, niềm đam mê nghiên cứu ln tạo điều kiện tốt giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Tuấn Anh, người thầy tận tình hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệm kiến thức quý báu nghiên cứu khoa học Phong cách làm việc thầy gương cho học tập Tôi xin cảm ơn PGS TS Nguyễn Hoàng Anh, TS Nguyễn Thùy Dương Những hỗ trợ quý báu hai thầy giúp tơi hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên công tác Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tồn thể thầy giáo cán trường Đại học Dược Hà Nội nhiệt tình bảo, giúp đỡ mang lại cho tơi kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt năm học vừa qua Cuối cùng, xin bày tỏ lời cảm ơn yêu thương tới gia đình, bạn bè, người ln bên chỗ dựa tinh thần cho tơi lúc khó khăn học tập sống Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2018 Sinh viên Ngô Huy Trung DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT H-NMR 13 C-NMR proton nuclear magnetic resonance carbon-13 nuclear magnetic resonance CH2Cl2 dicloromethan dd dung dịch DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV DEPT distortionless enhancement by polarization transfer DL dược liệu ESI-MS electrospary ionization - mass spectrometry GC-MS gas chromatography - mass spectrometry HPTLC high performance thin layer chromatography LD50 lethal dose 50% MeOH methanol MS mass spectrometry NH3 amoniac p/ứ phản ứng Rf retention factor SKC sắc ký cột SKLM sắc ký lớp mỏng TLC thin layer chromatography TT thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết phân tích sơ thành phần hóa học đu đủ 23 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân CNPD carpain 26 Bảng 3.3 Kết hàm lượng cao khô mẫu dược liệu 27 Bảng 3.4 Kết xác định hàm ẩm cao khô mẫu dược liệu 28 Bảng 3.5 Kết xác định tro toàn phần mẫu cao 28 Bảng 3.6 Kết định tính flavonoid cao khô đu đủ 28 Bảng 3.7 Kết định tính alcaloid cao khô đu đủ 29 Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm cho thử độc tính cấp cao khô đu đủ 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Khu vực phân bố đu đủ (Carica papaya L.) giới Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo số flavonoid phân lập từ đu đủ Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo số alcaloid phân lập từ đu đủ Hình 2.1 Cây đu đủ (Carica papaya L.) 15 Hình 2.2 Sơ đồ trình chiết xuất phân lập carpain từ đu đủ 18 Hình 3.1 Sắc ký đồ dịch chiết methanol mẫu dược liệu 25 Hình 3.2 Kiểm tra độ CNPD 25 Hình 3.3 Cơng thức cấu tạo carpain 26 Hình 3.4 Ba mẫu cao CHN, CTH, CTB 27 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu cao khơ đu đủ 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Hằng năm, nước ta, dịch sốt xuất huyết gây hàm trăm nghìn ca mắc nhập viện năm Đỉnh điểm năm 2017, theo thống kê Cục Y tế dự phòng – Bộ Y tế, tháng đầu năm, nước ghi nhận tổng số 90.626 trường hợp mắc bệnh, tăng 67,8 % so với kỳ năm 2016, số tử vong tăng trường hợp [12] Điều trị sốt xuất huyết chủ yếu điều trị triệu chứng theo dõi chặt chẽ phát sớm sốc xảy để xử trí kịp thời [2] Hiện có vaccin dự phòng sốt xuất huyết, nhiên giá thành cao tranh cãi mức độ an toàn [92], [94] Cây đu đủ (Carica papaya L.) lồi ăn khơng trồng phổ biến Việt Nam mà hầu có khí hậu nhiệt đới giới Trong nước ta, đu đủ trồng chủ yếu để thu quả, dùng số vùng theo kinh nghiệm để hỗ trợ điều trị ung thư số nước Ấn Độ, Indonesia, đu đủ dùng theo y học cổ truyền để điều trị nhiều loại bệnh bao gồm sốt rét, sốt xuất huyết [15], [30], [48] Một số nghiên cứu, có thử nghiệm lâm sàng Ấn Độ chứng minh hiệu điều trị dịch chiết nước đu đủ bệnh nhân sốt xuất huyết [50] Carpain, alcaloid có đu đủ cho hợp chất liên quan đến tác dụng chống giảm tiểu cầu bệnh nhân [90] Như vậy, việc sử dụng dịch chiết nước đu đủ để điều trị cho bệnh nhân sốt xuất huyết tiềm tính sẵn có giá thành rẻ Để thuận tiện cho sử dụng, cao khơ đu đủ dạng bào chế trung gian Bên cạnh đó, để đảm bảo tính hiệu an tồn, dạng cao khô cần xây dựng tiêu chuẩn đánh giá độc tính đầy đủ Do đó, đề tài “Xây dựng số tiêu chuẩn đánh giá độc tính cấp cao khô đu đủ” thực với hai mục tiêu sau đây: Xây dựng số tiêu cho tiêu chuẩn cao khô đu đủ Đánh giá độc tính cấp cao khơ đu đủ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đu đủ (Carica papaya L.) 1.1.1 Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại Takhtajan năm 2009 [81], vị trí phân loại đu đủ Carica papaya L tóm tắt sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Sổ (Dilleniidae) Bộ: Đu đủ (Caricales) Họ: Đu đủ (Caricaceae) Chi: Carica Loài: Carica papaya L 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây cao – 10 m Thân đơn, có sẹo xếp hình xoắn ốc Cuống rỗng, dài 60 – 100 cm, phiến dài 60 cm, xẻ chân vịt – lần, thùy xẻ nơng Cụm hoa đực gặp, bng thõng xuống đến m Hoa đực: khơng có cuống Ống tràng màu vàng, dài 1,6 – 2,5 cm, thùy hình mác, 1,8 x 0,45 cm, nhị 10, dài, ngắn, nhị ngắn gần khơng có nhị, nhị trắng, có lơng tơ trắng Hoa cái: thường đơn độc kép dạng xim ngù, cuống ngắn gần khơng có Đài xẻ thùy khoảng cm Ống tràng vàng, hình mác thn, kích thước – 6,2 x 1,2 – cm, bầu hình trứng Núm nhụy xẻ sâu, gần có lơng viền Hoa lưỡng tính: ống tràng 1,9 – 2,5 cm, thùy dạng thuôn 2,8 x 0,9 cm, nhị 10, vòng vòng, bầu nhỏ hoa 83 Tarkang P A., Agbor G A., et al (2012), "Acute and chronic toxicity studies of the aqueous and ethanol leaf extracts of Carica papaya Linn in Wistar rats", Journal of Natural Product and Plant Resources, 2, pp 617-627 84 Tjahjadi F I (1990), The influence of katu (Sauropus sndrogynus (L.) Merr.) and papaya (Carica papaya L.) leaves consumption on volume, vitamin A level and protein content of breast milk, Master thesis, Universitas of Indonesia, Jakarta 85 Valadeau C., Pabon A., et al (2009), "Medicinal plants from the Yanesha (Peru): evaluation of the leishmanicidal and antimalarial activity of selected extracts", Journal of Ethnopharmacology, 123(3), pp 413-422 86 Villegas V.N (1997), "Carica papaya L.", Edible fruits and nuts, Verheij EWM,Coronel RE, Wageningen University, The Netherlands, 87 Wang X., Hu C., et al (2015), "Isolation and identification carpaine in Carica papaya L leaf by HPLC-UV method", International Journal of Food Properties, 18(7), pp 1505-1512 88 WHO (2009), Dengue Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control 89 Yunita F., Hanani E., et al (2012), "The effect of Carica papaya L leaves extract capsules on platelets count and hematocrit level in dengue fever patient", International Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 2(4), pp 573-578 90 Zunjar V., Dash R P., et al (2016), "Antithrombocytopenic activity of carpaine and alkaloidal extract of Carica papaya Linn leaves in busulfan induced thrombocytopenic Wistar rats", Journal of Ethnopharmacology, 181, pp 20-25 91 Zunjar V., Mammen D T B M., et al (2011), "Pharmacognostic, physicochemical and phytochemical studies on Carica papaya Linn leaves", Pharmacognosy Journal, 3(20), pp 5-8 TRANG WEB 92 Reuters (2018), "Philippines says anti-dengue vaccine may be connected to three deaths", Retrieved May 01, 2018, from https://www.reuters.com/article/ussanofi-dengue-philippines/philippines-says-anti-dengue-vaccine-may-beconnected-to-three-deaths-idUSKBN1FM0SP 93 The Plant List (2013), Version 1.1 Published on the Internet; http://www.theplantlist.org/ (accessed 21st May 2018) 94 WHO (2017), "Updated Questions and Answers related to information presented in the Sanofi Pasteur press release on 30 November 2017 with regards to the dengue vaccine Dengvaxia®", Retrieved May 01, 2018, from http://www.who.int/immunization/diseases/dengue/q_and_a_dengue_vaccine_d engvaxia/en/ PHỤ LỤC Phụ lục Phiếu giám định tên khoa học Giấy chứng nhận mã số tiêu Phụ lục Phổ chất CNPD 3: phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, ESI-MS CNPD3 Current Data Parameters NAME CNPD3 EXPNO 10 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20180416 Time 8.14 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 70.26 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 297.3 K D1 1.00000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 500.1330885 MHz NUC1 1H P1 9.80 usec PLW1 24.00000000 W F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.1300407 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm CNPD3 Current Data Parameters NAME CNPD3 EXPNO 10 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20180416 Time 8.14 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 70.26 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 297.3 K D1 1.00000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 500.1330885 MHz NUC1 1H P1 9.80 usec PLW1 24.00000000 W F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.1300407 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 ppm CNPD3 Current Data Parameters NAME CNPD3 EXPNO 11 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20180416 Time 12.40 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 1024 DS SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 191.38 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 298.7 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 125.7703637 MHz NUC1 13C P1 9.50 usec PLW1 90.00000000 W ======== CHANNEL f2 ======== SFO2 500.1320005 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 24.00000000 W PLW12 0.36015001 W PLW13 0.23050000 W 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm F2 - Processing parameters SI 65536 SF 125.7577885 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 CNPD3 Current Data Parameters NAME CNPD3 EXPNO 11 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20180416 Time 12.40 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 1024 DS SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 191.38 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 298.7 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 125.7703637 MHz NUC1 13C P1 9.50 usec PLW1 90.00000000 W ======== CHANNEL f2 ======== SFO2 500.1320005 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 24.00000000 W PLW12 0.36015001 W PLW13 0.23050000 W 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 ppm F2 - Processing parameters SI 65536 SF 125.7577885 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 CNPD3 Current Data Parameters NAME CNPD3 EXPNO 11 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20180416 Time 12.40 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 1024 DS SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 191.38 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 298.7 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 125.7703637 MHz NUC1 13C P1 9.50 usec PLW1 90.00000000 W ======== CHANNEL f2 ======== SFO2 500.1320005 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 24.00000000 W PLW12 0.36015001 W PLW13 0.23050000 W 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 ppm F2 - Processing parameters SI 65536 SF 125.7577885 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 CNPD3 Current Data Parameters NAME CNPD3 EXPNO 12 PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20180416 Time 13.44 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG dept135 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 512 DS SWH 31250.000 Hz FIDRES 0.476837 Hz AQ 1.0485760 sec RG 191.38 DW 16.000 usec DE 6.50 usec TE 298.1 K CNST2 145.0000000 D1 2.00000000 sec D2 0.00344828 sec D12 0.00002000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 125.7703643 MHz NUC1 13C P1 9.50 usec P2 19.00 usec PLW1 90.00000000 W ======== CHANNEL f2 ======== SFO2 500.1320005 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 P3 9.80 usec P4 19.60 usec PCPD2 80.00 usec PLW2 24.00000000 W PLW12 0.36015001 W 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 ppm F2 - Processing parameters SI 65536 SF 125.7577885 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 File name: TRUNG Solvent: mEoh MODE: ESI, M+H/Na/K… Lab: Materials chemistry, Faculty of Chemistry, HUS-VNU 19 Le Thanh Tong, Hoan Kiem, Ha Noi Tel: 844.38.253.053; Fax: 844.38.241.140 Mail: Chem.vnu@.edu.vn C:\LTQ Orbitrap\ \TRUNG_180416155651 4/20/2018 2:13:07 PM TRUNG_180416155651 #82 RT: 0.76 AV: T: ITMS + c ESI Full m s [150.00-2000.00] Mass Spectrometter NL: 8.89E7 479.43 100 Thermo SCIENTIFIC company 95 Resolution: >60 000 Dt 90 Sensitivity: 10-14 85 Tandem: n >= 15 80 Mass Accuracy: