Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm và thử độc tính cấp cao khô của dây khai ( cotosapelta tomentosa (blume) vahl ) họ cà phê (rubiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH XUÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CAO KHƠ CỦA DÂY KHAI (Coptosapelta tomentosa (Blume) Vahl.) HỌ CÀ PHÊ (Rubiaceae) LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH XUÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CAO KHƠ CỦA DÂY KHAI (Coptosapelta tomentosa (Blume) Vahl.) HỌ CÀ PHÊ (Rubiaceae) LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU – DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60.73.10 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Viết Thân HÀ NỘI 2011 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nguyên liệu 1.1.1 Đặc điểm hình thái phân bố họ Cà phê 1.1.2 Một số đặc điểm chi Coptosapelta Korth … ……………… 1.1.3 Đặc điểm dây Khai 1.2 Các phƣơng pháp chế biến cao thuốc 10 1.2.1 Theo Dƣợc điển 10 1.2.2 Theo kinh nghiệm 12 1.3 Một số tiêu kiểm nghiệm cao thuốc 13 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tƣợng 15 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 15 2.2.1 Hóa chất 15 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 16 2.2.3 Động vật thí nghiệm 16 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Nghiên cứu hiển vi 16 2.3.2 Nghiên cứu hóa học 16 2.3.3 Nghiên cứu tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô dây Khai…….17 2.3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 18 2.3.5 Thử độc tính cấp 18 CHƢƠNG 3.THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20 3.1 Cảm quan 20 3.2 Đặc điểm hiển vi 21 3.2.1 Đặc điểm vi học bột 21 3.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân Dây khai 22 3.3 Đặc điểm hóa học 25 3.3.1 Kết định tính 25 3.3.2 Sắc ký lớp mỏng 27 3.3.3 Xác định số phá huyết 31 3.3.4 Định lƣợng saponin tồn phần có cao thân Dây khai phƣơng pháp cân 34 3.3.5 Chiết xuất phân lập 35 3.4 Xây dựng số tiêu kiểm nghiệm cao khô dây Khai 44 3.4.1 Hàm ẩm 44 3.4.2 Cắn không tan nƣớc 47 3.4.3 Tro toàn phần 48 3.4.4 Giới hạn kim loại nặng 49 3.4.5 Giới hạn nhiễm khuẩn 50 3.5 Thử độc tính cấp 50 CHƢƠNG BÀN LUẬN 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Viết Thân ngƣời thầy hƣớng dẫn giúp đỡ tơi tận tình suốt thời gian nghiên cứu khoa học hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Thanh Bình - giảng viên mơn Dƣợc liệu – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội ngƣời hƣớng dẫn tơi q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới tồn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Dƣợc Liệu, môn Vi Sinh – Công nghiệp dƣợc trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn DS-Lƣơng y Nguyễn Xuân Tuyển Hội Đông Y tỉnh Ninh Thuận; PGS.TS Nguyễn Thị Tâm nguyên cán giảng dạy Bộ môn Dƣợc Liệu, Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội; tới TS.Phạm Thị Giảng toàn thể cán nhân viên phòng kiểm nghiệm đơng dƣợc – Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ƣơng giúp đỡ tơi hồn chỉnh đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể bạn bè, bạn sinh viên trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội giúp đỡ, động viên tơi hồn thành đề tài tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin tỏ lòng cảm ơn chân thành, sâu sắc tới bố mẹ, gia đình, ngƣời thân ln bên cạnh, động viên, ủng hộ tơi suốt q trình học tập để đạt đƣợc kết nhƣ ngày hôm Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2011 Học viên Nguyễn Thanh Xuân DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CSPH: Chỉ số phá huyết Dd: Dung dịch ESI – MS: Electron Spray Ionization Mass Spectrometry (Phổ khối lƣợng phun mù điện tử) EtOAc: Ethyl acetat EtOH: Ethanol GTTB: Giá trị trung bình HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence (Tƣơng tác bội điện tử) HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence KHCN: Khoa học công nghệ MeOH: Methanol NMR: Nuclear magnetic resonance spectrometry (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân) Pƣ: Phản ứng Rf: Hệ số lƣu SD: Độ lệch chuẩn SKLM: Sắc ký lớp mỏng TT: Thuốc thử UV: Ultra violete (Tử ngoại) H- NMR: Proton nuclear magnetic resonance spectrometry (Phổ cộng hƣởng từ proton) 13 C- NMR: Carbon (13) nuclear magnetic resonance spectrometry (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13) DANH MỤC HÌNH TRONG TÀI LIỆU Trang Hình 1.1 Chất A: 3-O-β`-D- glucopyranosyl sitosterol (C35H60O6) Hình 1.2 Cơng thức chất B, C, D Hình 3.1 Hình ảnh Dây khai thực địa 20 Hình 3.2 Hình ảnh lá, thân Dây Khai 20 Hình 3.3 Hình ảnh cao khơ Dây Khai lƣu hành thị trƣờng 21 Hình 3.4 Một số đặc điểm vi học bột Dây Khai 22 Hình 3.5 Một số đặc điểm vi học bột thân Dây Khai 23 Hình 3.6 Một số đặc điểm vi học bột cao khơ Dây Khai 23 Hình 3.7 Đặc điểm vi phẫu Dây Khai 25 Hình 3.8 Đặc điểm vi phẫu thân Dây Khai 25 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu nghiên cứu sau khai triển hệ 30 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu nghiên cứu sau khai triển hệ 30 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu nghiên cứu sau khai triển hệ 31 Hình 3.12 Sắc ký đồ dịch chiết phân đoạn EtOAc 38 Hình 3.13 Sắc ký đồ CT1 dƣới đèn UV 254nm 38 Hình 3.14 Sắc ký đồ CT1 dƣới ánh sáng thƣờng sau phun 38 thuốc thử Hình 3.15 Hình ảnh kết tinh CT1 38 Hình 3.16 Sơ đồ phân lập CT1 39 Hình 3.17 Phổ tƣơng tác HMBC CT1 43 Hình 3.18 Cấu trúc hóa học CT1 44 DANH MỤC BẢNG TRONG TÀI LIỆU Trang Bảng 2.1 Các mẫu nghiên cứu sử dụng đề tài 15 Bảng 3.1 Kết phản ứng định tính 26 Bảng 3.2 Kết khai triển SKLM 29 Bảng 3.3 Chuẩn bị ống nghiệm phản ứng phá huyết 33 Bảng 3.4 Hàm lƣợng saponin toàn phần mẫu nghiên cứu 35 Bảng 3.5 Độ lệch chuẩn (SD) kết phần định lƣợng 35 Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR CT1 40 Bảng 3.7 Hàm lƣợng nƣớc mẫu cao xác định phƣơng pháp cất với dung môi 46 Bảng 3.8 Phần trăm khối lƣợng làm khô mẫu cao 47 Bảng 3.9 Phần trăm lƣợng cắn không tan nƣớc mẫu cao48 Bảng 3.10 Hàm lƣợng tro toàn phần mẫu cao 49 Bảng 3.11 Kết thử độc tính cấp cao khơ Dây khai chuột nhắt trắng 51 ĐẶT VẤN ĐỀ Ninh Thuận địa phƣơng có địa hình bao bọc núi biển, khí hậu tƣơng đối khắc nghiệt mƣa, nhiều nắng gió, độ ẩm thấp tạo nên vùng đất khơ cằn Ở có 34 dân tộc anh em sinh sống đơng dân tộc Kinh, Chăm Rắclây … Đồng bào dân tộc có truyền thống chữa bệnh cỏ Ngƣời dân tộc Rắclây Ninh Thuận có nhiều kinh nghiệm sử dụng Dây khai cao khô nấu từ Dây khai với tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, dùng để rửa, làm lành vết thƣơng, uống để điều trị bệnh xƣơng khớp Gần đây, cao đƣợc sử dụng để chữa Gút, làm thuốc bổ huyết, tăng cƣờng sinh lực Cao khơ Dây khai đƣợc sử dụng rộng rãi nhiều tỉnh miền Nam nam Trung nƣớc ta, chí đƣợc bán sang nƣớc láng giềng nhƣ Lào, Campuchia… Điều đáng quan tâm có nhiều tác dụng lại chƣa có hệ thống tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô Dây khai nên dễ dẫn đến giả mạo, nhầm lẫn gây ảnh hƣởng đến lợi ích ngƣời sử dụng đồng thời gây khó khăn cho việc nghiên cứu tác dụng Vì vậy, năm 2010 Hội Đông y Ninh Thuận phối hợp với môn Dƣợc Liệu – Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội thực đề tài nghiên cứu tiêu chuẩn kiểm nghiệm tác dụng sinh học cao khô Dây khai Đề tài nhằm mục đích bảo tồn, phát huy kiểm nghiệm sản phẩm điều trị bệnh địa phƣơng nhƣ y học cổ truyền Việt Nam đồng thời đảm bảo lợi ích ngƣời bệnh “Nghiên cứu xây dựng số tiêu kiểm nghiệm thử độc tính cấp cao khơ Dây khai (Coptosapelta tomentosa (Blume) Vahl họ Cà phê (Rubiaceae)” phần đề tài nghiên cứu cao khô Dây khai với mục tiêu: - Nghiên cứu số tiêu kiểm nghiệm cao khô Dây khai - Thử độc tính cấp cao khơ Dây khai Nội dung đề tài: - Nghiên cứu đặc điểm vi học, hóa học Dây khai cao khơ Dây khai phản ứng định tính, định lƣợng nhằm xác định tính nguồn nguyên liệu điều chế cao xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô Dây khai - Nghiên cứu số tiêu kiểm nghiệm về: Hàm ẩm, cắn không tan nƣớc, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn Dây khai góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô Dây khai - Phân lập, chiết xuất số hợp chất có cao Khai nhằm mục đích cung cấp thêm tiêu chuẩn để kiểm nghiệm cao khơ Dây khai - Thử độc tính cấp cao khô Dây khai CT1−MeOD−C13CPD 179 071 133 958130 406106 073105 23390 70487 77478 20577 85575 51075 44975 27472 65771 57062 64357 34856 92355 58449 84849 62549 51149 45549 34049 28349 16949 11749 00048 83048 65848 48948 03640 70540 40140 11839 91238 34138 03337 87437 66131 25928 47127 060 − − − 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm 133 958 130 130 406 125 120 115 110 105 106 073 105 233 100 95 90 90 704 87 774 85 80 75 70 78 77 75 75 75 72 71 205 855 510 449 274 657 570 65 62 643 60 ppm 57 348 56 923 55 584 CT1−M eOD−C 13CPD 50 45 40 49 49 49 49 49 49 49 48 48 48 48 511 455 340 283 169 117 000 830 658 489 036 40 40 40 39 38 38 37 37 705 401 118 912 341 033 874 661 35 31 259 30 28 471 27 060 26 512 25 761 25 23 863 21 505 20 19 19 18 18 17 16 ppm 300 090 314 155 064 858 CT1−M eOD−C 13CPD 4.6 579 563 985 4.5 4.4 355 340 961 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 082 629 000 ppm 3 3 908 904 885 880 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 674 662 651 639 503 485 467 414 409 396 393 378 369 353 346 336 333 330 327 323 310 300 293 284 282 273 266 156 147 133 124 116 098 080 3.8 3.7 094 3.6 116 259 3.5 3.4 3.3 921 3.2 928 3.1 3.0 ppm CT1−M eOD−1 H CT1−MeOD−C13CPD &DEPT DEPT90 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 180 170 C13CPD 180 170 CT1−MeOD−C13CPD &DEPT DEPT90 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 75 C13CPD 75 CT1−MeOD−HMBC ppm 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 190 ppm CT1−MeOD−HMBC ppm 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 185 ppm CT1−MeOD−HMBC ppm 70 75 80 85 90 95 100 105 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 ppm CT1−MeOD−HMBC ppm 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm CT1−MeOD−HMBC ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 ppm CT1−MeOD−HMBC ppm 20 25 30 35 40 45 50 55 1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 ppm CT1−MeOD−HSQC ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm CT1−MeOD−HSQC ppm 65 70 75 80 85 90 95 100 105 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 ppm CT1−MeOD−HSQC ppm 20 25 30 35 40 45 50 55 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 ppm ... Nghiên cứu xây dựng số tiêu kiểm nghiệm thử độc tính cấp cao khô Dây khai (Coptosapelta tomentosa (Blume) Vahl họ Cà phê (Rubiaceae) phần đề tài nghiên cứu cao khô Dây khai với mục tiêu: - Nghiên. .. VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH XUÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CAO KHƠ CỦA DÂY KHAI (Coptosapelta tomentosa (Blume) Vahl. ). .. - Nghiên cứu số tiêu kiểm nghiệm cao khơ Dây khai - Thử độc tính cấp cao khô Dây khai Nội dung đề tài: - Nghiên cứu đặc điểm vi học, hóa học Dây khai cao khô Dây khai phản ứng định tính, định