Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm nấm linh chi (ganoderma lucidum p karst )

30 2.4.7 Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lượng hàm lượng acid ganoderic A trong các mẫu nấm Linh chi .... 69 4.3 HÀM LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG CÁC MẪU NẤM LINH CHI NGHIÊN CỨU ....

NGUYỄN THỊ NGÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU

KIỂM NGHIỆM NẤM LINH CHI

(Ganoderma lucidum P.Karst.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017

NGUYỄN THỊ NGÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU

KIỂM NGHIỆM NẤM LINH CHI

(Ganoderma lucidum P.Karst.)

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Việt Hùng, PGS.TS Đỗ Thị Hà, những người thầy đã quan tâm, chỉ bảo tận tình và tạo mọi

điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Đốc Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương, Ban giám đốc Viện Dược liệu, Khoa Hóa Thực vật 2, Ban giám hiệu, Phòng Quản lý sau đại học và các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài

Đặc biệt, tôi xin cảm ơn các anh chị Khoa Nghiên cứu và Phát triển đã giúp

đỡ, san sẻ công việc và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 4 tháng 4 năm 2017

Học viên Nguyễn Thị Ngân

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum P Karst.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Phân bố, sinh thái 3

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.4.1 Polysaccharid 4

1.1.4.2 Triterpenoid 5

1.1.4.3 Peptid, protein 6

1.1.4.4 Khoáng chất 7

1.1.5 Tác dụng của nấm Linh chi 7

1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi 11

1.2 POLYSACCHARID TRONG NẤM LINH CHI 11

1.2.1 Hàm lượng polysaccharid trong nấm Linh chi 11

1.2.2 Các phương pháp phân tích polysaccharid (PS) trong nấm Linh chi 12

1.2.1.1 Phương pháp tạo màu đo quang phổ hấp thụ UV – VIS 12

1.2.1.2 Phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao HPLC 13

1.3 ACID GANODERIC A TRONG NẤM LINH CHI 13

1.3.1 Hàm lượng acid ganoderic A (GAA) trong nấm Linh chi 14

1.3.2 Các phương pháp phân tích acid ganoderic A (GAA) trong nấm Linh chi 14

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced

1.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 15

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 15

1.4 MỘT SỐ CHỈ TIÊU KHÁC TRONG KIỂM NGHIỆM NẤM LINH CHI 16

1.4.1 Mô tả 16

1.4.2 Bột 16

1.4.3 Định tính 17

1.4.4 Độ ẩm 19

1.4.5 Tro toàn phần 19

1.4.6 Tro không tan trong acid 19

1.4.7 Chất chiết được trong dược liệu 19

1.4.8 Tạp chất 19

1.5 MỘT VÀI NÉT VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

1.5.1 Phương pháp HPTLC 19

1.5.2 Phương pháp HPLC 21

1.5.3 Phương pháp quang phổ UV – VIS 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI 25

2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 26

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.4.1 Định danh thực vật 27

2.4.2 Mô tả dược liệu 27

2.4.3 Mô tả đặc điểm bột dược liệu 27

2.4.4 Xác định độ ẩm 27

2.4.5 Định tính nấm Linh chi bằng phương pháp TLC 28

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced

2.4.6 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng acid ganoderic A trong

nấm Linh chi bằng HPLC 29

2.4.6.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 29

2.4.6.2 Khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC 30

2.4.6.3 Thẩm định phương pháp phân tích 30

2.4.7 Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lượng hàm lượng acid ganoderic A trong các mẫu nấm Linh chi 33

2.4.8 Xây dựng phương pháp định lượng polysaccharid (PS) trong nấm Linh chi bằng phương pháp đo quang 33

2.4.8.1 Lựa chọn nhiệt độ chiết tối ưu 34

2.4.8.2 Khảo sát thời gian chiết 34

2.4.8.3 Khảo sát thời gian và điều kiện phản ứng 34

2.4.8.4 Khảo sát thể tích ethanol 96% thêm vào để kết tủa polysaccharid 34

2.4.8.5 Thẩm định phương pháp 35

2.4.9 Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lượng hàm lượng polysaccharid trong các mẫu nấm Linh chi 36

2.4.10 Xử lý số liệu 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38

3.1 ĐỊNH DANH THỰC VẬT 38

3.2 MÔ TẢ HÌNH THỂ 38

3.3 MÔ TẢ BỘT DƯỢC LIỆU 42

3.4 XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM 46

3.5 ĐỊNH TÍNH NẤM LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC 48

3.6 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 52

3.6.1 Tối ưu quá trình chiết acid ganoderic A (GAA) 52

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced

3.6.2 Khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC 52

3.6.2.1 Lựa chọn thành phần pha động 52

3.6.2.3 Lựa chọn nhiệt độ cột 53

3.6.3 Quy trình định tính, định lượng acid ganoderic A bằng phương pháp HPLC 53

3.6.4 Thẩm định phương pháp 54

3.6.4.1 Độ đặc hiệu 54

3.6.4.2 Tính thích hợp của hệ thống 55

3.6.4.3 Độ tuyến tính 56

3.6.4.4 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian 57

3.6.4.5 Độ đúng 58

3.6.4.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 59

3.7 ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM LINH CHI VIỆT NAM 59

3.8 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARID TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV – VIS 60 3.8.1 Lựa chọn thời gian chiết 60

3.8.2 Lựa chọn thể tích EtOH 96% thêm vào để kết tủa polysaccharid 60

3.8.3 Lựa chọn thời gian và điều kiện phản ứng 61

3.8.4 Quy trình định lượng polysaccharid trong nấm Linh chi 61

3.8.5 Thẩm định phương pháp 62

3.8.5.1 Độ đặc hiệu 62

3.8.5.2 Tính thích hợp của hệ thống 62

3.8.5.3 Độ tuyến tính 62

3.8.5.4 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian 63

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced

3.8.5.5 Độ đúng 64

3.9 ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARID TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM LINH CHI VIỆT NAM 65

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 68

4.1 VỀ ĐẶC ĐIỂM THỂ QUẢ, BỘT NẤM LINH CHI 68

4.2 VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH NẤM LINH CHI BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO HPTLC 68

4.3 VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC 69

4.3 HÀM LƯỢNG ACID GANODERIC A TRONG CÁC MẪU NẤM LINH CHI NGHIÊN CỨU 69

4.4 VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARID BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG 70

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

KẾT LUẬN 72

KIẾN NGHỊ 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR

ẦN H

ƯNG

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

G.lucidum Ganoderma lucidum

LOD Limit of detection (giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantitation (giới hạn định lượng) TLC Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) HPTLC High performance thin layer chromatography (sắc ký lớp

mỏng hiệu năng cao) HPLC High-performance liquid chromatography (sắc ký lỏng

hiệu năng cao)

LDL – C Low-density lipoprotein - cholesterol HDL – C High-density lipoprotein - cholesterol

RSD Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tương đối)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1 1: Phân tích TLC trong bản bổ sung Dƣợc điển Việt Nam và dƣợc

Bảng 1 2: Phân tích TLC trong Dƣợc điển dƣợc liệu Mỹ (AHP) và Dƣợc

Bảng 3 3: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 55

Bảng 3 6: Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian 57

Bảng 3 8: Hàm lƣợng acid ganoderic A trong nấm Linh chi 59 Bảng 3 9: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 62

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian 64

Bảng 3.13: Kết quả định lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi 65

DANH MỤC CÁC HÌNH Trang

Hình 1 1: Công thức đơn vị polysaccharid -proteoglycan chiết xuất từ

Hình 3 15: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol

Hình 3 16: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi

60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bước sóng 254 nm

50

Hình 3 17: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi

60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bước sóng 366 nm

Hình 3 18: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi

60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) sau khi phun thuốc thử

51

Hình 3 19: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid ganoderic A (1), dung dịch

thử (2), dung dịch trắng (3) và so sánh phổ UV của pic acid ganoderic A của dung dịch chuẩn – thử

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, bên cạnh việc sử dụng các thuốc tân dược thì ở Việt Nam nói riêng

và trên thế giới nói chung đang dần dần đi theo hướng sử dụng các thảo dược vì tính hiệu quả và an toàn thân thiện với cơ thể con người, có thể sử dụng thường xuyên hàng ngày Việt Nam là một nước có thảm thực vật phong phú và đa dạng sinh học với nhiều cây dược liệu quý Nhân dân ta vốn có kinh nghiệm lâu đời trong việc dùng thảo dược Nhiều cây thuốc đã được nghiên cứu kỹ càng về thành phần hóa học, cơ chế tác dụng chữa bệnh và được tiêu chuẩn hóa Tuy nhiên, trong thực tế, nhiều cây thuốc dùng để chữa bệnh trong dân gian vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum P Karst) là một loại dược liệu quý được sử

dụng lâu đời, đặc biệt trong điều trị suy nhược thần kinh, mất ngủ, các bệnh về tim mạch, ung thư, thấp khớp, tiểu đường, viêm gan…[13], [20] Ở Trung Quốc, nấm Linh chi còn được coi là một “thần dược” giúp kéo dài tuổi thọ, ngăn ngừa lão hóa, tăng sức dẻo dai cho cơ thể [20] Với những tính năng và công dụng phong phú của

nó đối với sức khỏe, nấm Linh chi được sử dụng phổ biến không những ở các nước phương Đông mà còn khá được ưa chuộng ở các nước phương Tây Tuy nhiên, chất lượng của nấm Linh chi không ổn định, phụ thuộc vào các yếu tố về giống, điều kiện nuôi trồng, nguồn gốc địa lý, điều kiện khí hậu, môi trường, thời gian thu hoạch [20], [40] Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có rất nhiều sản phẩm linh chi có nguồn gốc khác nhau, là loại nuôi trồng hay thu hái tự nhiên, với các mức chất lượng khác nhau Vì vậy cần thiết phải có một phương pháp kiểm tra đánh giá chất lượng chúng

Vì vậy, việc xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm nấm Linh chi nhằm đánh giá chất lượng nấm Linh chi là một vấn đề có ý nghĩa không chỉ về mặt khoa học mà còn đáp ứng nhu cầu cấp thiết hiện nay của xã hội Xuất phát từ nhu cầu trên, chúng

tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm nấm

Linh chi (Ganoderma lucidum P Karst.)” với mục tiêu sau:

1 Xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm nấm Linh chi (Ganoderma lucidum P

Karst.)

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để đánh giá chất lượng một số mẫu nấm

Linh chi (Ganoderma lucidum P Karst.) trên thị trường

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum P Karst.)

Chi Ganoderma trên thế giới có trên 250 loài Trong đó, loài được sử dụng

nhiểu nhất cho đến thời điểm hiện tại để chăm sóc sức khỏe là nấm Linh chi

Ganoderma lucidum P Karst [3]

Nấm linh chi gọi theo tiếng Trung Quốc là Lingzhi, theo tiếng Nhật là Reishi, ở Việt Nam là nấm Lim, nấm Tiên Thảo hay nấm Trường Thọ [13], [14] Trong số rất nhiều tên gọi khác nhau như Chi Linh, Mộc Chi Linh, Linh chi…thì tên Linh chi

(được dùng làm tên gọi chung cho các loài nấm thuộc họ Ganodermataceae) là tiêu

biểu và mang tính lịch sử Trong sách “Thần nông bản thảo” ra đời cách đây hơn

2000 năm, tên này đã chính thức được sử dụng [14]

1.1.1 Vị trí phân loại

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum P Karst [14]

Theo hệ thống phân loại của P Karsten (1881) nấm Linh chi thuộc:

Giới nấm (Fungi) Ngành nấm đảm (Basidiomycota) Lớp nấm đảm (Agaricomycetes)

Mũ mới sinh có màu trắng có sắc thái vàng lưu huỳnh; sau chuyển sang màu vàng, vàng rỉ sắc, nâu, nâu đỏ, nâu hồng tím…tạo nên một lớp vỏ bóng nhoáng như quét sơn hoặc như đánh vecni Kích thước mũ 2 – 2,5 x 3 – 30 cm; dày 0,5 – 1,5 cm [12]

Cuống nấm thường đính ở trên phần lõm vào của mũ nấm Cuống mới hình thành màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, màu nâu…và phủ vỏ bóng, có màu sắc

và cấu trúc tương tự mũ nấm Cuống hình trụ, gần như tròn hoặc hơi dẹp, kích thước (1)3-20 x 0,5-2(4) cm [12]

Bào tử hình bầu dục hoặc hình trứng, cụt đầu, màu gỉ sắt, có một mấu lồi và nhiều gai nhọn Toàn cây nấm màu nâu đỏ, đỏ vàng hoặc nâu đen [13]

1.1.3 Phân bố, sinh thái Nấm Linh chi là loài phân bố khắp nơi trên thế giới Nấm mọc trên gốc, rễ cây

sống và cây đã chết, trên rất nhiều cây gỗ mọc trong rừng và công viên, như cây ăn quả, đặc biệt là các cây thuộc bộ Đậu như lim xanh, lim vàng, phượng vĩ… [12]

Có thể tìm thấy nấm linh chi ở hầu hết các tỉnh vùng núi, từ Lào Cai (Sa Pa) đến Lâm Đồng (Lang Biang) Ở các vùng rừng trước kia có nhiều cây lim đã bị khai thác, trên gốc hoặc phần thân cành còn lại (chủ yếu ở phần giác) đều có thể thấy nấm này mọc vào mùa mưa ẩm, như vùng rừng thuộc lâm trường Hương Sơn, tỉnh

Hà Tĩnh; vùng rừng thuộc Vườn Quốc gia Bến En, tỉnh Thanh Hóa và Tam Đảo (Vĩnh Phúc)…[13]

Nấm Linh chi sinh sản chủ yếu bằng bào tử nằm ở mặt dưới của thể quả Phần

có chức năng sinh dưỡng chính là hệ sợi của nấm mọc ẩn trong gỗ mục hoặc đất Ở Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam người ta đã chủ động nghiên cứu trồng được Nấm Linh chi trên giá thể nhân tạo để dùng làm thuốc [13]

1.1.4 Thành phần hóa học

Cho đến nay, các nhà khoa học đã tìm ra nấm Linh chi có chứa các hoạt chất

quý như triterpenoid, polysaccharid, peptid, steroid, acid amin, khoáng chất [3], acid béo no và không no [9], protein, alkaloid, nucleosid [38], ergosterol [20] và các vitamin [33], [57] Hầu hết, nấm Linh chi tươi chứa khoảng 90% nước theo trọng

lượng, 10% còn lại bao gồm protein 10-40%, 2-8% chất béo, 28% carbohydrat, 32% chất xơ, 8-10% tro, và một số vitamin và khoáng chất chính như: kali, canxi,

3-phốt pho, magie, selen, sắt, kẽm, đồng, …[40]

Trong số các thành phần hóa học của nấm Linh chi thì polysaccharid và triterpenoid được chú ý hơn cả vì những tác dụng sinh học đáng kể của chúng [22], [39], [40], [63] Tuy nhiên, số lượng và tỷ lệ phần trăm của từng thành phần có thể rất đa dạng trong các sản phẩm tự nhiên và thương mại, đã được minh chứng bằng

số liệu trong nhiều nghiên cứu [40], [42]

1.1.4.1 Polysaccharid

Các polysaccharid được phân lập từ bào tử, quả thể và sợi nấm của nấm Linh chi hoặc tách từ dung dịch môi trường nuôi cấy nấm [39]

Polysaccharid là một trong những thành phần có hàm lượng cao (có thể tới

45%) của G.lucidum [3] gồm các polysaccharid trung tính (β-1→3, β-1→6 homo

D-glucan); glucan có tính acid và polyglycan; heteroglucan liên kết protein;

arabinoxyoglucan (một heteroglucan phân nhánh cao); heteroglycan với liên kết

β-1→4 và peptidoglycan (ganoderan A, B, và C) [17] Dây nối (1,3)- β-D-glucan làm cho mạch polysaccharid có dạng xoắn tương tự như tinh bột (1,3)- β-D-glucan tan trong nước nóng và tan một phần trong nước lạnh Dung dịch nước của các (1,3)- β-

D-glucan ở nồng độ cao có độ nhớt cao [3]

Các β – glucan trong thể quả của Linh chi có thể có cùng khối lượng phân tử

nhưng khác nhau về mức độ phân nhánh Khối lượng phân tử của các chất này vào

khoảng 1.050.000 đvc Dây nhánh trong các β – glucan của Linh chi thường là 1→6

[20] Tỉ lệ phân nhánh thay đổi từ 1/3 – 1/23 Các heteropolysaccharid trong Linh chi cấu tạo bởi các đường D – glucose, D-galactose, D-mannose, L-(hay D-)-arabinose, D-xylose hay L-fucose [3], [40]

Hình 1 1: Công thức đơn vị polysaccharid -proteoglycan chiết xuất từ G Lucidum

1.1.4.2 Triterpenoid

Terpen là hợp chất tự nhiên mà bộ khung cacbon của nó bao gồm một hoặc nhiều đơn vị isopren C5 Triterpen là một phân lớp của nhóm terpen, có cấu trúc khung C30 [40] Cấu trúc hóa học của các triterpenoid trong nấm Linh chi dựa trên lanostan, là một chất chuyển hóa của lanosterol [33], [40] Các triterpenoid của nấm Linh chi đã nhận được những chú ý đáng kể do những tác dụng dược lý nổi bật của chúng [23], [25]

Trong phần không phân cực của thể quả có các triterpenoid tự do với hàm lượng có thể tới 3-5% Các chất chính là các acid ganoderic A, B, C, D, F, H, I, J,

K, L, M, R, S, T, V, X, Y, Z, W; lucidenic A, B, C, D, I; ganoderan A, B, C và lucidenol A, B, C Các triterpen khác bao gồm ganoderol A và B, epoxyganoderiol A-C, acid ganoderenic A-D, acid ganodermic, ganoderiol A-I, ganodermanontriol, ganodermatriol, acid ganolucidic A-E, lucidon A-C, acid lucidenic A-M, lucidadiol

và lucidal Một số triterpenoid như acid ganoderic A, C, I, J; acid lucidenic A, D, I

và lucidon A và C làm cho Linh chi có vị đắng, khác với các loại nấm khác [3] Các triterpen lanostanoid oxy hóa khác nhau trong nấm Linh chi bao gồm nhiều cặp C-3 lập thể và C-3/ C-5 đồng phân vị trí [20]

Acid ganoderic A và acid ganoderic B là hai chất thuộc nhóm triterpen được phân lập lần đầu từ Linh chi vào năm 1982 [49]

Cho đến nay, người ta đã xác định có hơn 150 triterpenoid khác nhau được xác định trong quả thể, bào tử và hệ sợi [23] và được phân thành năm nhóm cấu trúc

chính [55] Các acid ganoderic A, B, H chỉ được phát hiện trong thể quả, trong khi acid ganoderic R, S, T là những triterpenoid chính trong sợi nấm [45]

Hàm lượng triterpenoid là khác nhau ở các bộ phận khác nhau và ở các giai

đoạn phát triển của nấm Sự khác nhau của các triterpenoid trong G lucidum có thể

được sử dụng để phân biệt nấm dược liệu này với các loài khác gần tương tự và sử dụng như một tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng của các mẫu nấm Linh chi khác nhau [20], [40]

Protein trong nấm Linh chi có chứa tất cả các acid amin thiết yếu, rất giàu lysin

và leucin Tổng hàm lượng chất béo thấp và tỷ lệ cao các đa acid béo không bão hòa tương đối so với tổng số acid béo của nấm được coi là đóng góp đáng kể cho giá trị sức khỏe của nấm [39]

Tuy nhiên theo Robert T GoW thì hàm lượng protein trong chi Ganoderma

thấp hơn so với các loại nấm khác (chỉ khoảng 7-8%) [32]

1.1.4.4 Khoáng chất

Thành phần khoáng chính trong nấm Linh chi là phosphor, silica, sulfur, kali, calci, và magnesi Ngoài ra, các nguyên tố như sắt, natri, kẽm, đồng, mangan, stronti cũng được phát hiện ở nồng độ thấp, cũng như các kim loại nặng khác như

chì, thuỷ ngân, cadmi Nấm G lucidum cũng có thể chứa hàm lượng selen lên đến

72 µg / g nấm khô [30]

Trong thể quả của G.lucidum, ngoài các khoáng chất thông thường còn có một

hàm lượng cao của germani Hàm lượng germani trong Linh chi châu Á có thể tới

cầu người HL-60 [47], tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3 [44]

Acid ganoderic T (GA-T) phân lập từ nấm Linh chi có hiệu quả ức chế tế bào ung thư xâm thực và di căn trong cơ thể [24]

Theo nghiên cứu của Jiang J và cộng sự, nấm Linh chi ức chế sự phát triển của

tế bào ung thư vú thông qua ức chế tín hiệu Akt/NF-kappaB và có thể sử dụng để điều trị ung thư vú [42]

Các bác sĩ Trung Quốc hiện đại sử dụng nấm Linh Chi để hỗ trợ sức đề kháng ở bệnh nhân trải qua hóa trị liệu thông thường và / hoặc xạ trị cho các hình thức ung thư khác nhau [20]

- Tác dụng hạ đường huyết

Các glycan A, B và C phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng hạ đường máu rõ rệt ở chuột nhắt trắng bình thường và chuột nhắt trắng gây đái tháo đường bằng aloxan [13]

Jia và cộng sự [42] nghiên cứu trên những con chuột bị gây tiểu đường bằng streptozotocin Sau điều trị bằng dịch chiết giàu polysaccharid, nồng độ insulin

huyết thanh tăng (so với chứng) và nồng độ glucose giảm một cách phụ thuộc vào liều Nghiên cứu này cũng cho thấy, ngoài việc điều chế đường huyết, điều trị bằng

G lucidum giúp giảm các tác nhân oxy hóa [42]

- Tác dụng hạ huyết áp

Các thử nghiệm có kiểm chứng trên người cho thấy cao chiết Linh chi (55 mg x

3 lần/ngày) sử dụng trong 1 tháng có tác dụng hạ huyết áp rõ rệt so với giá trị cơ bản trên những bệnh nhân cao huyết áp trung bình không đáp ứng với nifedipin hay với nimodipin, so với placebo Một số acid ganoderic như acid ganoderic B, D, F, H phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng chống tăng huyết áp, trong đó acid ganoderic

F có tác dụng mạnh nhất [3]

- Tác dụng hạ lipid máu

Nguyễn Thị Mai Anh và cộng sự đã nghiên cứu trên chuột cống trắng tăng cholestron máu thực nghiệm, thu được kết quả cao nước nấm Linh chi (2ml cao lỏng chứa 1 g nấm) có tác dụng làm giảm các chỉ số cholesterol toàn phần, triglycerid và LDL – C, đồng thời làm tăng HDL – C trong huyết tương [1]

Ganoderol A và B, ganoderal A và acid ganoderic phân lập từ nấm Linh chi, có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol thông qua ức chế enzym lanosterol- 14α- desmetilase (xúc tác cho phản ứng chuyển 24,25 – dihydrolanosterol thành cholesterol) [36]

- Tác dụng bảo vệ gan và chống loét dạ dày

Nghiên cứu của Đỗ Thị Hà cùng các cộng sự (2013) [34] cho thấy, cao chiết

methanol và các phân đoạn n – hexan, dicloromethan, nước của dịch chiết

methanol, cùng các hợp chất phân lập được từ nấm Linh chi (ergosterol, ergosterol

peroxid và ganodermanontriol) có tác dụng bảo vệ gan in vivo và in vitro liên quan

đến sự kích hoạt enzyme HO – 1 và hợp chất ganodermanontriol thể hiện tác dụng kích hoạt protein HO – 1 thông qua sự kích hoạt yếu tố chuyển vị trong nhân tế bào NRF – 2, trong các con đường tín hiệu PI3K/Akt và p38, làm tăng cường mức độ bảo vệ các tế bào gan chống lại t- BHP gây ra các stress oxy hóa [34]

Theo nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi và cộng sự, cao triterpenoid trong nấm Linh chi với liều 484 mg cao/kg thể trọng chuột có tác dụng bảo vệ tế bào gan Ở

liều này, cao nấm Linh chi có khả năng ức chế 39,86 % sự tăng hoạt độ men ALT trong huyết thanh chuột gây ra bởi paracetamol [16]

Các polysaccharid trong nấm Linh chi được xem là có tác dụng bảo vệ gan

Acid ganoderic R và S trong hệ sợi; acid ganoderic A trong bào tử nấm Linh chi có tác dụng bảo vệ gan gây ra bởi galactosamin [3]

Ngoài ra, tác dụng của nấm linh chi trên những tổn thương dạ dày cũng đã được nghiên cứu Nhóm nghiên cứu Gao, Tang và cộng sự [31] đã gây loét dạ dày chuột

bằng acid acetic đã gây và điều trị bằng GL-PS, một polysaccharide chiết xuất từ G

lucidum, với liều 0,5 và 1,0 g / kg trong 14 ngày Kết quả, GL-PS làm gia tăng đáng

kể việc chữa lành vết loét (40% và 56%, tương ứng với liều điều trị) Điều trị với liều 1,0 g / kg còn cho thấy sự phục hồi đáng kể chất nhầy và nồng độ prostaglandin

so với nhóm chứng [31]

- Tác dụng tăng cường miễn dịch

Năm 2007, Xu Z và cộng sự [68] đã báo cáo một polysaccharid của G.lucidum

giúp đẩy nhanh quá trình phục hồi các tế bào tủy xương, hồng cầu, bạch cầu, các tế bào tiêu diệt tự nhiên và các tế bào T trên chuột bị gây ức chế miễn dịch bằng

quan miễn dịch phản ứng lại kích thích Các thành phần khác nhau từ G lucidum

làm tăng cường sự phát triển và trưởng thành của các lympho T và B, các tế bào

đơn nhân lách, các tế bào NK và các tế bào đuôi gai trong nuôi cấy in vitro và trong các nghiên cứu động vật in vivo [21], [73]

Năm 2005, Nguyễn Thượng Dong và cộng sự tiến hành trên chuột nhắt trắng, nhận thấy cao nước và cao ethanol 80 % chiết xuất từ nấm Linh chi có hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình gây viêm gan cấp bằng CCl4 [7]

Nấm Linh chi đỏ thể hiện hoạt tính khử gốc superoxid in vitro điển hình ở các cao cồn, cao MeOH, phân đoạn n – butanol và phân đoạn diethy ether Theo nhóm

nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi, cao triterpenoid tổng chiết xuất từ nấm Linh chi

có tác dụng chống oxy hóa (ức chế 19,94 % sự tăng hàm lượng MDA so với chứng bệnh lý với liều 484 mg cao/kg thể trọng chuột) [16]

Cao cồn và cao nước nấm Linh chi điều chỉnh về mức bình thường hoạt tính GSH-Px trong gan chuột bị gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid [5]

Năm 2015, Yurkiv B và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa trên chuột được gây đái tháo đường bằng streptozotocin, nhận thấy nấm làm tăng hoạt động của các enzym chống oxy hóa Từ đó giúp ngăn ngừa stress oxy hóa phát triển trong tế bào ở bệnh nhân tiểu đường [71]

- Tác dụng kháng HIV

Các tác giả Hàn Quốc đã đánh giá tác dụng ức chế sự phát triển HIV-1 ở các tế bào lympho T ở người của cao nước nấm Linh chi Kết quả cho thấy, cao nước nấm Linh chi có tác dụng ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virus này [45]

Các chất như ganoderiol A, B và F, ganodermanontriol, acid ganoderic α, B, C1

và H, 3β-5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7,22-dien được phân lập từ nấm có khả năng ức chế enzym protease của virus HIV in vitro [29]

Nghiên cứu của Nguyễn Thượng Dong và cộng sự (2006) cho thấy cao EtOH nấm Linh chi ở cả hai liều thử tương đương 10 và 20 g dược liệu/kg chuột có tác dụng cải thiện sự suy giảm khả năng nhận thức và suy giảm khả năng ghi nhớ gây

ra bởi scopolamin [6]

Nấm Linh chi còn có tác dụng chống viêm trong bệnh Crohn liên quan đến việc ức chế tín hiệu NF-κB của tuyến yên [51] Người ta đã chứng minh được tác dụng giảm đau đến 37,9 % trên chuột thực nghiệm của các acid ganoderic A, B,

C và H [39]

Polysaccharid phân lập từ G.lucidum đã được chứng minh là có tác dụng chống lại sự phá hủy của tia phóng xạ trên in vitro và in vivo [59]

1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi

Linh chi được sử dụng từ lâu và được coi như là một trong các vị thuốc đầu vị của y học cổ truyền phương Đông Trong y học cổ truyền, Linh chi được dùng để tăng cường trí nhớ, kéo dài tuổi thọ… [3]

Theo kinh nghiệm dân gian, Nấm Linh chi được dùng để điều trị suy nhược thần kinh, chóng mặt, mất ngủ; viêm khí quản mạn tính, bệnh bụi silic phổi lao;

tăng huyết áp, tăng cholesterol máu, bệnh động mạch vành tim; viêm gan, đau dạ dày, chán ăn, thấp khớp, thống phong Liều dùng mỗi ngày 3 – 10 g dạng thuốc sắc, hoặc 2 – 5 g tán bột uống Dùng ngoài, xông trị viêm mũi [13]

1.2 POLYSACCHARID TRONG NẤM LINH CHI 1.2.1 Hàm lượng polysaccharid trong nấm Linh chi

Dược điển Trung Quốc yêu cầu hàm lượng polysaccharid trong nấm Linh chi không được thấp hơn 0,5% dược liệu khô [58]

Dược điển Mỹ yêu cầu hàm lượng polysaccharid trong nấm Linh chi không được thấp hơn 0,7% dược liệu khô [67]

Năm 2013, Poh-Guat Cheng và cộng sự [26] đã nghiên cứu trên mẫu nấm

G.lucidum thu hái ở Malaysia, thu được dịch chiết nước chứa tổng lượng

polysaccharid là 25,1%

Theo Juan Lu và cộng sự (2012) [54] nghiên cứu các mẫu nấm G.lucidum được

thu hái từ núi Dabie, quận Longquan, Nantong, núi Changbai, Wuyi, thành phố Liaocheng (Trung Quốc), có hàm lượng polysaccharid lần lượt là 1,85%; 5,88%;

Trần Thị Văn Thi cùng cộng sự [15] cũng đã xác định hàm lượng của phân đoạn polysaccharid từ nấm Linh chi nuôi trồng tại Thừa Thiên Huế Hàm lượng polysaccharid trong cao toàn phần polysaccharid là 86,00 ± 0,53 (P = 0,95, n = 6)

1.2.2 Các phương pháp phân tích polysaccharid (PS) trong nấm Linh chi

Dung môi chiết xuất polysaccharid thường là nước nóng [23], [33], [39] hoặc là dung dịch kiềm [38] sau đó kết tủa bởi rượu [23], [33], [39]

1.2.1.1 Phương pháp tạo màu đo quang phổ hấp thụ UV – VIS

* Phương pháp tạo màu với thuốc thử anthron Nguyên tắc:

- Dùng dung dịch HCl loãng để thuỷ phân polysaccharid thành monosaccharid

- Trong môi trường acid nóng, glucose bị dehydrat hóa tạo thành hydroxymethyl furfural Hợp chất này kết hợp với anthron tạo thành sản phẩm có màu xanh lục hấp thụ cực đại tại 630 nm [37]

Phương pháp này được dược điển Trung Quốc sử dụng để định lượng tổng

lượng polysaccharid trong G.lucidum và G.sinensis [58]

* Phương pháp tạo màu với thuốc thử phenol-acid sulfuric Nguyên tắc:

Dựa vào phản ứng thuỷ phân polysaccharid thành monosaccharid Trong môi trường acid nóng, glucose bị dehydrat hóa tạo thành hydroxymethyl furfural Hợp chất này tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng λ = 490 nm [37]

Theo Krystyna Skalicka-Woźniak [63], sau khi chiết PS bằng nước nóng

(85°C) trong 5 giờ, và kết tủa bằng EtOH, tổng lượng PS tinh khiết được định lượng bằng cách tạo màu với thuốc thử phenol – acid sulfuric theo quy trình: lắc đều 30 phút hỗn hợp 1 ml dung dịch thử, 1 ml dung dịch phenol 5% và 5 ml H2SO4 đặc, đo quang ở bước sóng 490 nm Phương pháp có độ lặp lại cao, tuyến tính trong khoảng nồng độ 0,055-0,475 mg/ml [63]

Theo Masuko T và cộng sự (2005) [56] thứ tự mẫu thử - acid sulfuric – phenol cho độ hấp thụ tối đa Tuy nhiên phương pháp thêm dung dịch đường, phenol vào bình nón, lắc đều rồi thêm H2SO4 đặc cũng được nhiều nghiên cứu chứng minh là cho độ hấp thụ tối đa [62], [70]

1.2.1.2 Phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao HPLC

Dược điển Mỹ [67] đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng polysaccharid toàn phần trong nấm Linh chi Các điều kiện sắc ký như sau:

Detector: UV 250 nm Cột: L1, 4,6 mm x 25 cm, 5 µm Nhiệt độ cột: 35 ± 1°C

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl Pha động: đệm phosphat 0,05 M (dung dịch A) : acetonitril (dung dịch B) Chương trình gradient:

Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B (%)

Khối lượng phân tử: 516,67 g/mol

Acid ganoderic A là một trong những triterpen chính của nấm G.lucidum [59], được phát hiện trong G.lucidum mà không được phát hiện trong một số loài nấm cùng chi Ganoderma như Ganoderma applanatum, Ganoderma lipsiense, Ganoderma

carnosum, Ganoderma sugae, Ganoderma mastoporum, Ganoderma neo-japonicum, Ganoderma amboinense, Ganoderma austral [55] Acid ganoderic A có nhiều trong

thể quả và có tác dụng bảo vệ gan trên chuột bị tổn thương gan gây ra bởi CCl4 bằng cách ức chế β-glucuronidase, trong khi các triterpen khác chỉ làm giảm không đáng

kể các enzym gan [20], [66] Ngoài ra còn có tác dụng chống khối u [47]

1.3.1 Hàm lượng acid ganoderic A (GAA) trong nấm Linh chi

Hàm lượng acid ganoderic A và B chiếm hơn một nửa toàn lượng nấm Linh chi,

do đó việc xác định hàm lượng của axit ganoderic A và B có thể được sử dụng để

đánh giá chất lượng của nấm G.lucidum [49]

Trong nghiên cứu của Poh-Guat Cheng [26], mẫu nấm Linh chi được tiêu chuẩn hóa chứa hàm lượng GAA là 0,45 %

Hàm lượng GAA trong các mẫu nấm thu hái từ núi Dabie, quận Longquan, Nantong, núi Changbai, Wuyi, thành phố Liaocheng (Trung Quốc) lần lượt là 7,254 m/g; 6,658 mg/g; 3,563 mg/g; 2,628 mg/g; 2,154 mg/g và 1,959 mg/g [54]

Hàm lượng GAA trong bào tử và thể quả của G.lucidum cho kết quả lần lượt từ

15,1- 278,6 µg/g và 57,7 – 987,2 µg/g [63]

Acid ganoderic A được sử dụng là một trong các chất đối chiếu để định lượng thành phần triterpenoid của nấm Linh chi trong dược điển Mỹ, với yêu cầu tổng lượng triterpenoid không được ít hơn 0,3 %, tính theo tổng hàm lượng của 10 triterpenoid bao gồm: acid ganoderic A, acid ganoderenic C, acid ganoderic C2, acid ganoderic G, acid ganoderenic B, acid ganoderic B, acid ganoderic H, acid ganoderic D, acid ganoderenic D và acid ganoderic F so với dược liệu khô [67]

1.3.2 Các phương pháp phân tích acid ganoderic A (GAA) trong nấm Linh chi

Dung môi để chiết xuất các hợp chất triterpenpid trong chi Ganoderma là

diclomethan [25], methanol [29], [28], [57], ethanol [68], chloroform [68], [23]

hoặc dung dịch kiềm [18]

1.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Dược điển Mỹ sử dụng acid ganoderic A làm một trong các chất đối chiếu trong định tính nấm Linh chi bằng HPTLC, với hệ dung môi toluen – ethyl format – acid formic (5 : 5 : 0,2) [66]

Các tác giả PGS TS Nguyễn Ngọc Vinh, Ths Nguyễn Thị Kim Danh [19]

cũng chọn GAA để làm chất đối chiếu, và sử dụng hệ dung môi: chloroform – methanol – nước (30 : 4 : 1), lấy lớp dưới

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Dược điển Mỹ [67] định lượng thành phần GAA trong nấm Linh chi bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột L1 (2,1 mm x 15 cm, 1,8 µm); detector UV 257 nm; nhiệt độ cột 25 ± 1°; tốc độ dòng 0,4 ml/phút với pha động như sau:

- Dung dịch A: acid phosphoric/nước 0,075%

- Dung dịch B: acetonitril Chương trình gradient:

Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B (%)

5 triterpenoid, trong đó có acid ganoderic A

Theo Jing Zhao và cộng sự [72] đã định lượng đồng thời 8 triterpen (gồm GAA

và acid ganoderic Y, acid ganoderic DM, ganoderol A, ganoderol B, ganoderal A, methyl ganoderat D, ganoderate G) và sterol bằng HPLC rửa giải gradient, sử dụng cột Zorbax ODS C18, thành phần pha động gồm nước (dung dịch A) và methanol (dung dịch B)

Phương pháp HPLC rửa giải đẳng dòng cũng được sử dụng để phân tích GAA

Với các điều kiện sắc ký: Alltima C18 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), pha động

acetonitril- acid formic 0,04%, bước sóng phát hiện 254 nm, nhiệt độ cột 15°C, Li

B M [48] đã định lượng đồng thời GAA cùng acid ganoderic C2, acid ganoderic

G, acid ganoderenic B, acid ganoderic B, acid ganoderenic A, acid ganoderic A, acid lucideric A, acid ganoderenic D và acid ganoderic C1

Để so sánh hàm lượng triterpenoid trong thể quả và bào tử của G.lucidum, một

chương trình HPLC được xây dựng với pha động ethanol 2% –acetonitril (4:6), phân tách được 7 acid ganoderic là acid ganoderic A, B, C1, H, α, β và acid ganolucidic A [50]

GAA trong nấm Linh chi cũng được định lượng bằng phương pháp HPLC – PAD pha đảo rửa giải isocratic với các điều kiện sắc ký gồm: cột RP 18 (100 x 4,6 mm; 4 µm); pha động acetonitril – acid acetic 1% (30 : 70), bước sóng phát hiện

254 nm, nhiệt độ cột 30°C, tốc độ dòng 1,5 ml/phút [18]

Chương trình HPLC đẳng dòng pha động gồm acetonitril, nước và acid formic (42:58:0.5, v/v/v), cột Agilent Zorbax XDB C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) cho giới hạn phát hiện GAA là 3,0 ng/ml và giới hạn định lượng là 20,0 ng/ml [53]

Theo Da J và cộng sự [28], đã chọn GAA là chuẩn đối chiếu để phân tích các

thành phần triterpen khác trong G.lucidum do có hàm lượng cao trong G.lucidum,

phân tách dễ, và tương đối ổn định

Ngoài ra GAA còn được xác định bằng phương pháp miễn dịch học sắc ký [61]

1.4 MỘT SỐ CHỈ TIÊU KHÁC TRONG KIỂM NGHIỆM NẤM LINH CHI 1.4.1 Mô tả

Thể quả hình thận, hình tròn hay hình quạt, hóa gỗ, cứng, đường kính 5 cm đến

18 cm, dày 1 cm đến 2 cm Mặt trên màu nâu vàng đến nâu đỏ, bóng loáng như đánh vecni, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép mỏng, nhẵn, hơi lượn sóng, Mặt dưới màu vàng nâu đến nâu nhạt với các lỗ nhỏ li ti Phần trong xốp, màu trắng đến nâu nhạt Cuống hình trụ, đính lệch, có khi phân nhánh dài 6 cm đến 10 cm, đường kính 1 cm đến 3,5 cm, màu nâu đỏ đến nâu đen Màu thơm nhẹ, vị đắng [2]

1.4.2 Bột

Bột màu vàng nâu Soi bột dưới kính hiển vi thấy: Sợi nấm rải rác hoặc tụ thành đám, không màu hoặc nâu nhạt, mảnh, hơi cong, phân nhánh, đường kính 2,5 µm đến 6 µm Bào tử hình trứng, màu nâu, đứng riêng lẻ hay tụ thành đám, dài 8 µm

đến 12 µm, rộng 5 µm đến 8 µm, đỉnh trơn nhẵn, lớp vỏ ngoài không màu, lớp vỏ trong có nhiều chỗ lồi ra [2]

1.4.3 Định tính

A Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 20 ml EtOH 96 %, đun sôi hồi lưu 1 giờ, lọc Nhỏ vài

giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc, sấy nhẹ cho khô, phun hỗn hợp dung dịch sắt (III) clorid

0,9 % và dung dịch kali fericyanid 0,6 % theo tỷ lệ 1:1, sẽ có màu xanh lơ [2]

B Phương pháp sắc ký lớp mỏng Bản bổ sung Dược điển Việt Nam, Dược điển Trung Quốc, Dược điển dược liệu Mỹ (AHP) và Dược điển Mỹ đều sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính nấm Linh chi [2], [58], [20], [67]

Bảng 1.1: Phân tích TLC trong bản bổ sung Dược điển Việt Nam và dược điển

Trung Quốc

Bản bổ sung Dược điển Việt

Nam [2] Dược điển Trung Quốc [58]

Bản

Dung môi khai triển

Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C)- ether ethylic – acid formic (15 : 5 : 1)

Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ethyl format – acid formic (15 : 5 : 1);

Dung dịch thử

Lấy 2 g bột thô dược liệu, thêm 30

ml methanol, đun hồi lưu trong 30 phút, lọc Bốc hơi dịch lọc đến cắn Hòa cắn trong 2 ml methanol

Lấy 2g bột dược liệu, thêm 30ml methanol, đun hồi lưu trong 30 phút, lọc, bốc hơi dịch lọc tới cắn Hòa tan cắn trong 2ml methanol

Dung dịch đối chiếu

Lấy 2 g bột thô Linh chi (mẫu chuẩn) tiến hành chiết như mẫu thử

Lấy 2g bột nấm Linh chi (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mẫu thử

Tiến hành

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5

µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 10 cm đến

12 cm, lấy bản mỏng để khô trong không khí, quan sát dưới đèn tử ngoại, bước sóng 366 nm

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 4

µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng , quan sát dưới tia UV bước sóng 365 nm

Yêu cầu

Sắc ký đồ của dung dịch thử phải

có các vết giống với các vết của dung dịch đối chiếu về màu sắc và

vị trí (có ít nhất 4 vết phát quang màu vàng ánh xanh)

Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc

và giá trị Rf, với các vết trên sắc

ký đồ của dung dịch đối chiếu

Bảng 1 2:Phân tích TLC trong Dược điển dược liệu Mỹ (AHP) và Dược điển Mỹ

Bản mỏng HPTLC

Dung môi khai triển

Siêu âm 250 mg bột thuốc trong 5 ml methanol trong

5 phút, lọc Bốc hơi dịch lọc đến cắn Hòa cắn trong

3 ml methanol

Siêu âm khoảng 1,0 g bột mịn nấm Linh chi trong 50 ml EtOH trong 15 phút, ly tâm, phần dịch được bốc hơi đến cắn Hòa cắn trong 2ml EtOH

Dung dịch đối chiếu Không có

-Dung dịch chuẩn A: 1,0 mg acid ganoderic A/EtOH

- Dung dịch chuẩn B: 0,3 mg/ml ergosterol/ EtOH

- Dung dịch chuẩn C: 50 mg/ml nấm

G.lucidum trong EtOH

Thuốc thử H2SO4 10%/ MeOH H2SO4 10%/ EtOH

Tiến hành

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 7 cm

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 2 µl dung dịch A và B, 4 µl dung dịch C và dung dịch thử Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 7 cm

Yêu cầu

Khi quan sát ở bước sóng 366 nm, sắc

ký đồ của dung dịch thử có 6 vết giống với sắc ký đồ của dung dịch chuẩn C về màu sắc và Rf

Ở ánh sáng thường, mẫu thử có vết màu xanh tím trùng với Rf của acid ganoderic A; 2 vết tím đỏ, 1 vết xanh tím ở giữa sắc ký đồ, 2 vết màu tím, trong đó có 1 vết trùng với Rf của ergosterol

1.4.4 Độ ẩm

Yêu cầu không quá 17,0% [1], [58]

1.4.5 Tro toàn phần

Yêu cầu không quá 3,0 % [1], không quá 3,2 % [58]

1.4.6 Tro không tan trong acid

Yêu cầu không quá 0,5 % [1], [58]

1.4.7 Chất chiết được trong dược liệu

Yêu cầu: Không ít hơn 3,0 % tính theo dược liệu khô kiệt [1], [58]

1.4.8 Tạp chất

Yêu cầu:

- Arsen: không vượt quá 3,0 µg/g

- Cadmium: không vượt quá 0,5 µg/g

- Chì: không vượt quá 5,0 µg/g

- Thủy ngân: không vượt quá 0,2 µg/g

- Vi sinh vật: tổng lượng vi khuẩn hiếu khí không vượt quá 105 cfu/g; tổng số lượng nấm mốc và nấm men không vượt quá 103 cfu/g; vi khuẩn Gram âm không vượt quá

103 cfu/g và không có vi khuẩn Salmonella và Escherichia coli [58]

1.5 MỘT VÀI NÉT VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.5.1 Phương pháp HPTLC

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi

để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc [10]

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động

di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một

hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng

thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động [10]

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi [10]:

Trong đó:

a là khoảng cách di chuyển của chất phân tích;

b là khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1

Ngoài ra, khi sắc ký liên tục không xác định được tuyến dung môi, vị trí vết chất thử trên sắc đồ có thể xác định bằng hệ số dịch chuyển tương đối Rr Hệ số dịch chuyển tương đối Rr được xác định bằng tỷ số giữa khoảng cách dịch chuyển của vết chất thử và khoảng cách dịch chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu được sắc ký trong cùng điều kiện và trên cùng bản mỏng với mẫu thử [10]:

Trong đó:

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử;

c là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết chất chuẩn

Giá trị Rr có thể lớn hay nhỏ hơn 1

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức nâng cao của TLC HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng

và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao

Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích Quá trình phun mẫu được tiến hành tự động hoặc bán

b

a f

R 

c

a r

tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ

do đó giảm sự oxi hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng

Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates) Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân giải được tăng cường vì vết sắc kí nhỏ, thời gian sắc kí ngắn hơn và lượng dung môi ít hơn so với TLC

1.5.2 Phương pháp HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân

bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất này ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố trên [4], [10]

Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc đồ Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố lỏng – lỏng, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký pha liên kết, sắc ký gel Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay[4], [10]

Máy HPLC gồm các bộ phận sau: hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc

ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị) Pha động được cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector [4], [10]

Sau đây là một số thông số đặc trưng của kỹ thuật HPLC:

Thời gian lưu t R (phút)

Thời gian lưu t R là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu đến khi xuất hiện đỉnh của pic

Thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất

Hệ số dung lượng k ’

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong 2 pha

và được tính theo sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh

và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng

Độ chọn lọc α

Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A, B có kA’ và

kB’ khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc α (α từ 1,5 đến 2,0 là tối ưu) Nếu α quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài

Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa (H)

Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định

Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động học, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động

Độ phân giải R

Độ phân giải biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho Trong thực tế nếu các pic cân đối (Gauss) thì để 2 pic có độ lớn bằng nhau được coi là tách ra khỏi nhau hoàn toàn thì độ phân giải tối thiểu phải là 1,5

Hệ số bất đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ thu được

T được tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao pic

Trong phép định lượng yêu cầu 0,8 ≤ T ≤ 2,0

1.5.3 Phương pháp quang phổ UV – VIS

Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến còn được gọi là phương pháp quang phổ hấp thụ điện tử, là một trong các phương pháp phân tích dựa trên

I là cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch;

Độ hấp thụ của dung dịch chất tan ở nồng độ 1% (kl/tt) hay 10 g/l trong một cốc

đo có chiều dày 1 cm và đo ở một bước sóng xác định là độ hấp thụ riêng của chất tan và được ký hiệu là A (1 %, 1 cm) Độ hấp thụ riêng của chất tan được tính bằng công thức [10]:

A (1%, 1 cm) =

M

M là khối lượng phân tử của chất thử

Độ hấp thụ riêng của một chất trong một dung môi xác định và đo ở một bước sóng xác định là một đặc tính của chất đó

Khi đo trên máy tự ghi hai chùm tia, cốc đựng dung dịch đối chiếu được đặt ở bên

có chùm tia đối chiếu đi qua [10]

Từ những kết quả tham khảo các tài liệu về tiêu chuẩn kiểm nghiệm nấm Linh chi của các Dược điển trên thế giới và của Việt Nam (bản bổ sung) cùng những tổng quan về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của nấm Linh chi, nhóm nghiên cứu đề xuất một số chỉ tiêu phục vụ kiểm nghiệm nấm Linh chi như sau:

1 Chỉ tiêu mô tả đặc điểm dược liệu, đặc điểm bột dược liệu

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nấm Linh chi trồng và thu hái tự nhiên tại các tỉnh Quảng Nam, Tây Nguyên, Thanh Hóa, Bình Định, Đồng Nai Tên khoa học của cây được xác định là

Ganoderma lucidum Ngoài ra, thu thập mẫu nấm Linh chi Hàn Quốc để nghiên cứu

định tính Các mẫu nấm được xay thành bột thô theo quy định của dược điển Việt Nam

Bảng2 1: Các mẫu nấm Linh chi nghiên cứu

Nấm trồng

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI

- Chất chuẩn đối chiếu: Acid ganoderic A (số lô Gan01/0-8/14) do Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh cung cấp, hàm lượng 98,92%; D-glucose hàm lượng 99,5% của Sigma-Aldrich

- Các hóa chất thuốc thử đạt tinh khiết phân tích (PA) hoặc HPLC: Ether dầu hỏa, diethyl ether, acid formic, dichloromethan, acid acetic 1% (tt/tt), acetonitril (loại HPLC), methanol (loại HPLC), NaHCO3 5%, chloroform, acid hydrochloric 1N, ethanol, phenol, H2SO4 đặc, nước cất…

- Giấy chỉ thị pH, giấy lọc

2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Water với đầu dò PAD, cột sắc

ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), máy quang phổ Shimadzu UV – VIS

2450, hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC Camag, máy ly tâm lạnh Eppendorf 5804R, máy xay dược liệu, cân phân tích Mettler Toledo, bể siêu âm Elmasonic, tủ sấy, nồi cách thủy, tủ lạnh…

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Phễu chiết 100 ml và 250 ml, bình cầu dung tích

1000 ml, bình định mức, cốc các loại, bình tam giác các loại, pipet, lam kính, chày cối sứ…

Máy HPLC Water, Viện Kiểm nghiệm

thuốc Trung ương

Cân phân tích Mettler Toledo XPE 26, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Máy quang phổ UV – VIS Shimadzu

2450, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung

ương

Máy ly tâm lạnh Eppendorf 5804R, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Hình 2.1: Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Định danh thực vật

Các mẫu Nấm Linh chi sau khi thu hái được gửi chuyên gia về nấm để định danh thực vật

Nấm được sấy khô bằng tủ sấy ở 100°C, bảo quản trong túi nilon kín, tránh ánh sáng và ở điều kiện phòng thí nghiệm

2.4.2 Mô tả dược liệu

Quan sát mẫu ở ánh sáng thường Mô tả hình dạng, kích thước, màu sắc và thể chất của dược liệu

2.4.3 Mô tả đặc điểm bột dược liệu

Sấy khô dược liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 100°C sau đó dùng máy xay và thuyền tán nghiền nhỏ Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm nước, đặt lam kính lên, đi nhẹ lam kính và quan sát dưới kính hiển vi vật kính x40

để xác định đặc điểm bột

2.4.4 Xác định độ ẩm

* Nguyên tắc: Việc xác định độ ẩm được thực hiện theo phương pháp khối

lượng Cân khối lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy, khối lượng mất sau khi sấy

đi được xem là khối lượng nước tự do có trong mẫu, từ đó tính độ ẩm của mẫu

* Tiến hành: Sấy bì đựng mẫu thử trong tủ sấy ở áp suất thường trong thời gian

30 phút Cân xác định khối lượng bì là m0 (g)

Cân khoảng 1 g bột dược liệu, dàn mỏng, sấy ở nhiệt độ 100°C đến khối lượng không đổi Sau khi sấy làm nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân ngay Xác định khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy là m’ (g) Xác định thời gian làm khô và giới hạn độ ẩm của nấm Linh chi Xác định độ ẩm tương đối của nguyên liệu theo công thức sau:

Độ ẩm (%) = m – m’ 100%

m – m0Trong đó:

m0: khối lượng cốc cân đã sấy khô đến khối lượng không đổi m: khối lượng cốc và bột nấm Linh chi trước khi sấy

m’: khối lượng cốc và bột nấm Linh chi sau khi sấy đến khối lượng không đổi

2.4.5 Định tính nấm Linh chi bằng phương pháp TLC

Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký lớp mỏng như sau:

1 Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel GF254

2 Pha động: Khảo sát 3 hệ dung môi khai triển như sau:

+ Hệ A: Dichloromethan – methanol (9:1) + Hệ B: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (15:5:1)

+ Hệ C: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1)

3 Chuẩn bị mẫu:

- Dung dịch thử: Cân khoảng 2 g bột thô dược liệu, thêm 30 ml methanol, đun hồi lưu 30 phút, lọc Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cạn Hòa cắn trong 2 ml methanol

- Dung dịch đối chiếu:

+ Dung dịch 1: Cân khoảng 2 g bột thô Linh chi (mẫu nấm đối chiếu) tiến hành chiết như mẫu thử

+ Dung dịch 2: Dung dịch acid ganoderic A chuẩn nồng độ khoảng 0,1 mg/ml