BƯỚC ĐẦU NUÔI CẤY LEPTOSPIRA DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN HUYẾT THANH HỌC LEPTOSPIROSIS

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y KHĨA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NI CẤY LEPTOSPIRA DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN HUYẾT THANH HỌC LEPTOSPIROSIS Sinh viên thực hiện: NGÔ NGỌC ANH THƯ Lớp: DH05TY Ngành: Thú Y Niên khóa: 2005 – 2010 THÁNG 08/2010     BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y *********************** NGÔ NGỌC ANH THƯ BƯỚC ĐẦU NUÔI CẤY LEPTOSPIRA DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN HUYẾT THANH HỌC LEPTOSPIROSIS Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Bác sỹ thú y Giáo viên hướng dẫn PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI ThS NGUYỄN THỊ KIM LOAN THÁNG 08/2010 ii    LỜI CẢM TẠ Thành kính ghi ơn Cha Mẹ sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ hy sinh có ngày hôm Chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi - Thú y, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, tồn thể Thầy Cơ Khoa Chăn ni - Thú y Lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải ThS Nguyễn Thị Kim Loan BSTY Lê Thị Hà Đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực tập tốt nghiệp Ngơ Ngọc Anh Thư iii    TĨM TẮT LUẬN VĂN Đề tài nghiên cứu “Bước đầu nuôi cấy Leptospira dùng chẩn đoán huyết học Leptospirosis” tiến hành Phòng Vi sinh, Bộ mơn Vi sinh - Truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường đại học Nông Lâm Tp HCM thời gian từ tháng 03/2010 đến 07/2010 Kết thu được: Từ hai kháng nguyên Leptospira viện Pasteur TP HCM gồm 12 serovars, đề tài nuôi cấy thử nghiệm thành công Leptospira môi trường EMJH Bộ kháng nguyên thứ nuôi cấy thành công serovars với tỷ lệ nhiễm cấy chuyển lần 75 %; lần 12,5 % Bộ kháng nguyên thứ hai nuôi cấy thành công 10 serovars với tỷ lệ nhiễm cấy giống lần 58,33 %; lần 30 % Canh cấy đạt mật độ 4+ khoảng – ngày sau ni cấy Xét nghiệm MAT định tính mẫu huyết chuột thu từ thực địa, tỷ lệ dương tính kháng nguyên Leptospira viện Pasteur TP HCM kháng nguyên Leptospira nuôi cấy thử nghiệm 40 % Xét nghiệm MAT định lượng, tỷ lệ dương tính kháng nguyên Leptospira viện Pasteur 36,67 %, tỷ lệ dương tính kháng nguyên Leptospira nuôi cấy 40 % iv    MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm tả ii Tóm tắt luận văn iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình viii Chương I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu Chương II: TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược Leptospira 2.1.1 Đặc điểm vi khuẩn học 2.1.2 Sự phân bố tự nhiên 2.1.3 Loài cảm thụ 2.2 Các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm Leptospira 10 2.2.1 Chẩn đoán vi khuẩn học 10 2.2.2 Chẩn đoán huyết học 12 Chương III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm thực thí nghiệm 14 3.1.1 Thời gian 14 3.1.2 Nơi thực thí nghiệm 14 3.2 Vật liệu 14 3.2.1 Thiết bị hóa chất dùng thí nghiệm 14 3.2.2 Môi trường nuôi cấy 14 3.2.3 Giống Leptospira 14 v    3.2.4 Huyết dùng thí nghiệm 15 3.3 Nội dung nghiên cứu 15 3.4 Phương pháp thực 15 3.4.1 Nuôi cấy thử nghiệm kháng nguyên Leptospira điều kiện có phòng thí nghiệm 15 3.4.1.1 Đánh giá tình trạng giống xử lý giống bị vấy nhiễm vi khuẩn trước ni cấy (theo tài liệu chẩn đốn Leptospira - Viện Pasteur Paris) 15 3.4.1.2 Nuôi cấy đánh giá phát triển kháng nguyên Leptospira 16 3.4.2 Đánh giá hiệu kháng nguyên nuôi cấy thử nghiệm kỹ thuật vi ngưng kết MAT 17 3.4.2.1 Cách tiến hành 17 3.4.2.2 Tiến hành phản ứng vi ngưng kết MAT 17 3.5 Các tiêu theo dõi thí nghiệm 21 3.6 Phương pháp xử lý số liệu 21 Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết đánh giá tình trạng giống trước ni cấy 22 4.2 Thời gian xuất vẩn đục, mật độ xoắn thể đạt tương ứng vấy nhiễm vi khuẩn canh cấy 24 4.3 Hiệu kháng nguyên nuôi cấy điều kiện có phòng thí nghiệm 30 Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 Tồn 33 5.3 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 vi    DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT EMJH Ellinghausen - McCullough cải tiến Johnson Harris MAT Microscopic Agglutination Test PCR Polymerase Chain Reaction ADN Acid Deoxyribonucleic PBS Phosphate Buffer Saline KN Kháng nguyên HT Huyết KN Kháng nguyên SLNK Số lần ngưng kết TSLNK Tổng số lần ngưng kết OIE The World Organisation for Animal Health vii    DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các serogroups serovars tương ứng với loài giống Leptospira Bảng 2.2: Các đặc tính dùng phân biệt L interrogans L biflexa Bảng 2.4: Sự phân bố số serogroups L interrogans giới Bảng 2.5: Tính mẫn cảm loài ký chủ với serovars Bảng 2.6: Các serogroups đại diện cho chủng Leptospira dùng sản xuất kháng 3  Bảng 3.1: Các tiêu đánh giá tình trạng giống xử lý giống bị vấy nhiễm vi khuẩn 15 Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm tiêu theo dõi 17 Bảng 4.1 : Đánh giá mật độ vấy nhiễm hai kháng nguyên Leptospira viện Pasteur Tp HCM trước cấy chuyển 22  Bảng 4.2: Kết theo dõi mật độ xoắn khuẩn vấy nhiễm canh cấy trong  10 ngày kháng nguyên 24 Bảng 4.3: Kết theo dõi mật độ vấy nhiễm canh cấy 10 ngày sau   cấy chuyển lần kháng nguyên 26 Bảng 4.4: Kết theo dõi mật độ vấy nhiễm canh cấy 10 ngày kháng   nguyên 27 Bảng 4.5: Kết theo dõi mật độ vấy nhiễm 10 ngày sau cấy chuyển lần kháng nguyên 29  Bảng 4.6: Kết mẫu dương tính thực MAT 30 Bảng 4.7: So sánh hiệu giá kháng thể hai kháng nguyên 31 viii    DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Mơ tả hình thái Leptospira Hình 2.2: Leptospira kính hiển vi điện tử (độ phóng đại 6000 lần) Hình 3.1: Sơ đồ thực kỹ thuật MAT định tính 19 Hình 4.1: Tiêu nhuộm canh trùng trước cấy chuyển 23 Hình 4.2: Leptospira nuôi cấy môi trường EMJH ngày thứ 28 Hình 4.3: Tiêu nhuộm canh trùng nuôi cấy 28 Hình 4.4: Kết phản ứng vi ngưng kết MAT kính hiển vi đen 32 ix    Chương I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Leptospirosis bệnh chung người thú xoắn thể (spirochete) thuộc giống Leptospira gây Dựa vào đặc tính huyết học, tác nhân gây bệnh chung người thú, Leptospira interrogans, chia thành 220 serovars với 23 serogroups Nhiễm trùng Leptospira người thường chiếm tỷ lệ cao nước nhiệt đới nước ôn đới điều kiện môi trường, hoạt động nghề nghiệp thường xuyên tiếp xúc yếu tố có nguy tồn trữ Leptospira (nông nghiệp, thú y, công nhân giết mổ, công nhân vét cống rãnh, ) Chẩn đoán nhiễm trùng Leptospira chủ yếu dựa vào vi khuẩn học huyết học Tuy nhiên, xét nghiệm huyết học xem phương pháp thơng dụng chẩn đốn Leptospirosis, kỹ thuật MAT (Microscopic Agglutination Test) sử dụng nhiều tính đặc hiệu, độ nhạy cho kết nhanh MAT cho phép phát nhanh kháng thể IgG huyết nên kỹ thuật xem công cụ cho điều tra bệnh Leptospira người, thú nguồn lưu trữ xoắn thể tự nhiên (Ajay R.B et al, 2003; Ganière J.P et al, 2001) Ngoài ra, việc phát hiện, loại thải thú mang trùng serogroups Leptospira nghiên cứu gây bệnh thú thí nghiệm với chủng Leptospira có hỗ trợ MAT (Tucunduva de Faria M et al, 2008) Theo tài liệu Viện Pasteur Paris (2000), kỹ thuật MAT ln đòi hỏi nguồn kháng nguyên sống Leptospira nuôi cấy ngày thứ đến ngày thứ 10, việc sản xuất bảo quản kháng nguyên công việc bắt buộc phòng thí nghiệm chẩn đốn Leptospirosis Vấn đề đặt cho việc sản xuất kháng nguyên sống yêu cầu tiêu vi sinh (không tạp nhiễm serogroups Leptospira, không vấy nhiễm vi sinh vật khác, nồng độ xoắn thể đạt tiêu chuẩn 108 Leptospira/ml) 1    Việc đánh giá mức độ ngưng kết kháng nguyên thực tương tự kỹ thuật MAT phần định tính Tuy nhiên, hiệu giá kháng thể huyết xác định dựa vào độ pha loãng cao huyết mà 50 - 75 % xoắn thể bị ngưng kết 3.5 Các tiêu theo dõi thí nghiệm Đánh giá tình trạng giống trước ni cấy; Xác định ngày canh cấy xuất vẩn đục, mật độ xoắn thể đạt tương ứng vấy nhiễm vi khuẩn canh cấy; So sánh kết MAT kháng nguyên: (1) kháng nguyên sống thương mại Leptospira Viện Pasteur Tp HCM cung cấp (2) kháng nguyên nuôi cấy thử nghiệm 3.6 Phương pháp xử lí số liệu Dùng EXCELL để xử lý số liệu 21    Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết đánh giá tình trạng giống trước nuôi cấy Chúng tiến hành kiểm tra giống trước ni cấy cho đợt thí nghiệm mật độ xoắn thể có canh trùng vấy nhiễm vi khuẩn Kết thu lần thí nghiệm trình bày qua bảng 4.1 hình 4.1 Bảng 4.1 : Đánh giá mật độ vấy nhiễm hai kháng nguyên viện Pasteur trước cấy chuyển Serovars 1.autumnalis Bộ Bộ Mật độ Nhiễm khuẩn Mật độ Nhiễm khuẩn  4+ 4+ 2.hebdomadis 4+ 4+ 3.pyrogenes 4+ 4+ 4.hustbridge 4+ 4+ 5.canicola 4+ 4+ 6.semaranga 4+  4+ 7.icterohaemorrhagiae 4+  4+ 8.sejroe 4+  4+ 9.bataviae 4+  4+ 10.cynopterie 4+  4+ 11.australis 4+  4+ 12.panama Tổng số mẫu nhiễm Tỷ lệ (%) 4+  4+ 58,33 22      25 Quan sát kính hiển vi đen đánh giá tình trạnh canh trùng gốc ban đầu kháng nguyên thứ nhất, cho thấy có canh trùng gốc ban đầu khơng có vấy nhiễm vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 41,67%), serovars autumnalis, hebdomadis, pyrogenes, hustbridge, canicola; có canh trùng gốc ban đầu tạp nhiễm (chiếm 58,33%), serovars semaranga, icterohaemorrhagiae, sejroe, bataviae, cynopterie, australis, panama Ở kháng nguyên thứ 2, sau kiểm tra kính hiển vi đen, cho thấy có canh trùng gốc không bị tạp nhiễm (chiếm tỷ lệ 75%), serovars pyrogenes, hustbridge, canicola, semaranga, icterohaemorrhagiae, bataviae, cynopterie, australis, panama; có canh trùng bị nhiễm khuẩn (chiếm tỷ lệ 25%), serovars autumnalis, hebdomadis, sejroe Qua hai kháng nguyên, tỷ lệ vấy nhiễm cao (25 – 58,33%) Bộ có tỷ lệ vấy nhiễm cao hai nhiễm với serovars khác Tất giống đạt mật độ 4+, mật độ đủ điều kiện thực phản ứng vi ngưng kết MAT Những giống gốc không bị tạp nhiễm, cấy trực tiếp Với gốc bị tạp nhiễm, xử lý cách lọc qua màng lọc 0,45 μm Vì leptospira có tính di động tồn thân, đường kính tế bào nhỏ mềm dẻo cho phép xoắn thể qua lọc có đường kính lổ lọc từ 0,45 μm dễ dàng giữ lại vi khuẩn vấy nhiễm (a) Serovars: panama (b) Serovars: sejroe Hình 4.1: Tiêu nhuộm canh trùng trước cấy chuyển 23    4.2 Thời gian xuất vẩn đục, mật độ xoắn thể đạt tương ứng vấy nhiễm vi khuẩn canh cấy Sau kiểm tra tình trạng ban đầu xử lý trường hợp giống bị vấy nhiễm vi khuẩn, 12 serovars Leptospira cấy chuyển vào môi trường EMJH theo dõi phát triển xoắn thể canh cấy, kết thu sau: Bảng 4.2: Kết theo dõi mật độ xoắn khuẩn vấy nhiễm canh cấy 10 ngày kháng nguyên Ngày Ngày đạt vẩn đục mật độ 4+ 1.autumnalis 2.hebdomadis Serovars Nhiễm khuẩn 10       3.pyrogenes 4.hustbridge     5.canicola 6.semaranga      7.icterohaemorrhagiae 8.sejroe      9.bataviae      10.cynopterie    11.australis    12.panama      Tổng số canh cấy bị nhiễm 9/12 Tỷ lệ (%) 75 Những canh cấy từ giống gốc khơng bị tạp nhiễm vẩn đục sớm canh cấy từ giống gốc bị tạp nhiễm Tuy tỷ lệ cấy giống 10 %, giống bị tạp nhiễm phải xử lý qua lọc làm cho tỷ lệ cấy giống giảm so với 24    giống cấy trực tiếp Chính số lượng xoắn khuẩn ban đầu canh cấy trực tiếp nhiều canh cấy qua lọc Hầu hết canh cấy bắt đầu xuất hiển vẩn đục vào ngày thứ sau ni cấy, có canh cấy (icterohaemorrhagiae, cynopterie, panama) xuất vẩn đục vào ngày thứ Trong đó, có canh cấy (gồm serovars semaranga, sejroe, bataviae, australis) đục hẳn so với canh cấy vẩn đục vào ngày thứ Kiểm tra kính hiển vi đen, cho thấy có nhiễm khuẩn canh cấy diện xoắn thể vi trường Chúng lọc canh cấy qua màng lọc 0,45 μm vào ống nghiệm vô trùng khác Tuy nhiên, ngày theo dõi tiếp theo, canh cấy bị tạp nhiễm xoắn thể diện vi trường vài Chúng loại thải canh cấy khơng xử lý tạp nhiễm Bên cạnh đó, có canh cấy từ giống ban đầu bị tạp nhiễm (serovars icterohaemorrhagiae) loại thải tạp nhiễm đạt mật độ 4+ vào khoảng ngày thứ sau nuôi cấy, canh cấy từ giống ban đầu bị tạp nhiễm (là serovars cynopterie panama) ban đầu xử lý tạp nhiễm bị nhiễm khuẩn lại q trình ni cấy đạt mật độ 4+ vào khoảng – ngày sau ni cấy Trong q trình ni cấy có thêm canh cấy (gồm serovars autumnalis, hebdomadis, hustbridge) bị vấy nhiễm đạt mật độ 4+ vào khoảng ngày thứ – sau ni cấy Chỉ có canh cấy từ giống gốc ban đầu tốt không bị nhiễm khuẩn q trình ni cấy đạt mật độ 4+ vào ngày thứ sau nuôi cấy Ở cấy chuyển lần này, tỷ lệ vấy nhiễm cao (75 %) tăng dần theo thời gian khảo sát Các canh cấy bắt đầu đạt mật độ 4+ từ ngày thứ đến ngày thứ sau nuôi cấy Do giống gốc ban đầu không tốt dẫn đến số canh cấy khảo sát lại số canh cấy bị tạp nhiễm Bên cạnh đó, canh cấy từ giống khơng bị tạp nhiễm lại bị vấy nhiễm q trình ni cấy làm tăng tỷ lệ nhiễm từ 58,33 % lên 75 % Do lần nuôi cấy cách vặn nắp ống canh cấy lỏng, cộng thêm điều kiện có phòng thí nghiệm làm tăng tỷ lệ vấy nhiễm Môi trường nuôi cấy EMJH môi trường giàu dinh dưỡng nên bị vấy nhiễm vi khuẩn khác phát triển nhanh, cạnh tranh 25    dinh dưỡng với xoắn thể Vì nhiễm nhiều vi khuẩn làm cho xoắn thể không phát triển Sau 10 ngày, cấy chuyển lần 2, với tỷ lệ cấy giống 10 % qua màng lọc 0,45 μm Kết trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3: Kết theo dõi mật độ vấy nhiễm canh cấy 10 ngày sau cấy chuyển lần kháng nguyên Ngày Ngày đạt vẩn đục mật độ 4+ 1.autumnalis 2.hebdomadis 3.pyrogenes 4.hustbridge 5.canicola 6.icterohaemorrhagiae 7.cynopterie 8.panama Serovars Nhiễm khuẩn 10     Tổng số canh cấy bị nhiễm 1/8 Tỷ lệ (%) 12,5 Ở canh cấy chuyển lần đến ngày thứ sau nuôi cấy, canh cấy bắt đầu xuất vẩn đục Tỷ lệ vấy nhiễm thấp cấy chuyển lần 12,5 %, với serovars vấy nhiễm hustbridge Đến ngày thứ - sau nuôi cấy, canh cấy đạt mật độ 4+ Ở lần cấy chuyển này, cách vặn nắp ống canh cấy có phần kín lần trước khơng kín hồn tồn giúp cho tỷ lệ vấy nhiễm giảm đáng kể 26    Sau kết theo dõi cấy chuyển lần kháng nguyên thứ qua bảng 4.4 Bảng 4.4: Kết theo dõi mật độ vấy nhiễm canh cấy 10 ngày kháng nguyên Serovars Ngày Ngày đạt vẩn đục mật độ 4+ Nhiễm khuẩn 10 1.autumnalis      2.hebdomadis      3.pyrogenes    4.hustbridge 5.canicola 6.semaranga 7.icterohaemorrhagiae 8.sejroe    9.bataviae    10.cynopterie    11.australis 12.panama      Tổng số canh cấy bị nhiễm 7/12 Tỷ lệ (%) 58,33 Sau ngày cấy chuyển, quan sát mắt thường thấy canh cấy bắt đầu xuất vẩn đục, có canh cấy (serovars autumnalis hebdomadis) đục hẳn canh cấy vẩn đục ngày Kiểm tra kính hiển vi đen, cho thấy có nhiễm khuẩn canh cấy diện xoắn thể vi trường Chúng lọc canh cấy qua màng lọc 0,45 μm vào ống nghiệm vô trùng khác Tuy nhiên, ngày theo dõi tiếp theo, canh cấy bị tạp nhiễm xoắn thể diện vi trường vài Chúng loại thải canh cấy khơng xử lý tạp nhiễm Với canh cấy serovars sejroe từ giống gốc bị tạp nhiễm, sau cấy chuyển 27    tiếp tục nhiễm, số lượng vi khuẩn nhiễm quan sát kính hiển vi đen nên xoắn thể phát triển đạt mật độ 4+ vào ngày thứ Trong trình ni cấy, có thêm canh cấy (gồm serovars pyrogenes, bataviae, cynopterie, panama) bị vấy nhiễm làm cho tỷ lệ nhiễm tăng (58,33 %) Các canh cấy đạt mật độ 4+ rơi vào khoảng - ngày sau ni cấy ĐC(-) ĐC(-) Hình 4.2: Leptospira ni cấy môi trường EMJH ngày thứ (a) Serovars semaranga (b) Serovars cynopterie Hình 4.3: Tiêu nhuộm canh trùng nuôi cấy 28    Bảng 4.5: Kết theo dõi mật độ vấy nhiễm 10 ngày sau cấy chuyển lần kháng nguyên Ngày Ngày đạt vẩn đục mật độ 4+ 1.pyrogenes 2.hustbridge 3.canicola 4.semaranga 5.icterohaemorrhagiae 6.sejroe 10 7.bataviae 8.cynopterie 10 9.australis 10.panama Serovars Nhiễm khuẩn 10          Tổng số canh cấy bị nhiễm 3/10 Tỷ lệ (%) 30 Các canh cấy bắt đầu vẩn đục vào ngày thứ Mật độ xoắn khuẩn tăng dần ngày thứ có serovars đạt mật độ 4+ (pyrogenes, semaranga, bataviae), ngày thứ thêm serovars đạt mật độ 4+ (hustbridge, canicola, icterohaemorrhagiae, australis, panama) Hai serovars sejroe cynopterie đến ngày thứ 10 đạt mật độ 4+ Đến ngày thứ xuất vấy nhiễm canh cấy serovars hustbridge, australis, panama với tỷ lệ vấy nhiễm giảm 30 % Qua lần cấy chuyển cho thấy, giống ban đầu quan trọng Với giống bị tạp nhiễm qua lọc nhiều lần loại bỏ tạp nhiễm, với giống tạp nhiễm nặng khó mà xử lý hết tạp nhiễm Trong q trình ni cấy, với điều kiện khơng vơ trùng có phòng thí nghiệm làm tăng thêm vấy nhiễm vào canh cấy với giống ban đầu tốt Tỷ lệ vấy nhiễm cao làm tốn thời gian loại thải vi 29    khuẩn qua lọc, kéo dài thời gian phát triển xoắn khuẩn Nhiệt độ dao động từ 30 – 32 OC, chưa phải nhiệt độ thích hợp cho phát triển xoắn khuẩn, nằm giới hạn cho phép để xoắn khuẩn phát triển 4.3 Hiệu kháng nguyên nuôi cấy điều kiện có phòng thí nghiệm Các mẫu huyết chuột dương tính với kháng nguyên viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh cung cấp kháng nguyên ni cấy, kết trình bày bảng 4.6 Bảng 4.6: Kết mẫu dương tính thực MAT Ký hiệu Serovars mẫu Kết MAT Bộ KN Pasteur Kết MAT Bộ KN nuôi cấy Định tính Định lượng Định tính Định lượng icterohaemorrhagiae + 1/160 + 1/320 panama + 1/160 + 1/80 pyrogenes + 1/40 + 1/160 semaranga + 1/320 + 1/80 12 hustbridge + 1/40 + 1/40 14 icterohaemorrhagiae + 1/40 + 1/40 16 icterohaemorrhagiae + 1/40 + 1/80 19 icterohaemorrhagiae + 1/40 + 1/160 20 icterohaemorrhagiae + 1/320 + 1/320 31 canicola + 1/160 + 1/80 35 icterohaemorrhagiae + 1/40 + 1/40 37 semaranga + 1/80 + 1/80 icterohaemorrhagiae + 1/40 + 1/160 39 semaranga + 1/320 + 1/80 41 bataviae + - + 1/40 panama + - + 1/80 Số mẫu dương tính 12 11 12 12 Tỷ lệ (%) 40 36,67 40 40 (chú thích: KN: kháng nguyên) 30    Bảng 4.7: So sánh hiệu giá kháng thể hai kháng nguyên Serovars SLNK KN Pasteur 1/40 1/80 1/160 1/320 1/40 1/80 1/160 1/320 pyrogenes hustbridge 1 1 canicola semaranga icterohaemorrhagiae SLNK KN nuôi cấy 1 2 sejroe bataviae cynopterie australis panama TSLNK 3 (chú thích: SLNK: số lần ngưng kết; TSLNK: tổng số lần ngưng kết) Trong q trình ni cấy kháng ngun 2, hai serovars autumnalis hebdomadis không xử lý tạp nhiễm, không đạt mật độ 4+ nên phản ứng MAT thực 10 serovars lại Với kháng nguyên viện Pasteur cho kết 11 mẫu dương tính tổng số 30 mẫu huyết chuột, chiếm tỷ lệ 36,67 %, có mẫu cho hiệu giá kháng thể cao 1/320 serovars semaranga icterohaemorrhagiae; mẫu hiệu giá kháng thể 1/160 serovars canicola, icterohaemorrhagiae panama; mẫu hiệu giá kháng thể 1/80 serovars semaranga; mẫu có hiệu giá kháng thể 1/40 serovars pyrogenes, hustbridge icterohaemorrhagiae Với kháng nguyên nuôi cấy từ thí nghiệm lần cấy chuyển thứ 1, cho kết 12 mẫu dương tính tổng số 30 mẫu huyết chuột, chiếm tỷ lệ 40 %, có mẫu cho hiệu giá kháng thể cao 1/320 serovars icterohaemorrhagiae; mẫu hiệu giá kháng thể 1/160 serovars pyrogenes, icterohaemorrhagiae và; mẫu hiệu giá 31    kháng thể 1/80 serovars canicola, semaranga, icterohaemorrhagiae, panama; mẫu có hiệu giá kháng thể 1/40 serovars hustbridge, icterohaemorrhagiae panama Theo kết phản ứng MAT hai kháng nguyên, cho thấy tỷ lệ dương tính gần tương đương Ở MAT định tính hai kháng nguyên cho kết giống nhau, MAT định lượng kết khác biệt mẫu huyết (a) Dương tính (b) Âm tính Hình 4.4: Kết phản ứng vi ngưng kết MAT kính hiển vi đen 32    Chương V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian tiến hành nuôi cấy thử nghiệm từ 12 serovars kháng nguyên viện Pasteur cung cấp, rút số kết luận sau - Tình trạng giống ban đầu chưa tốt, tỷ lệ canh trùng gốc vấy nhiễm chiếm tỷ lệ cao (58,33 – 25 %) Sự vấy nhiễm serovars có thay đổi hai kháng nguyên Các serovars đạt mật độ 4+ đủ điều kiện để thực phản ứng vi ngưng kết MAT - Trong q trình ni cấy, tỷ lệ canh trùng vấy nhiễm tăng lên, tỷ lệ nhiễm chuyển giống lần 58,33 – 75 %, lần chuyển giống lần 12,5 – 30 % Các canh cấy đạt mật độ 4+ khoảng – ngày sau ni cấy - Ở phần MAT định tính tỷ lệ dương tính kháng nguyên 40 %, MAT định lượng, tỷ lệ dương tính kháng nguyên viện Pasteur 36,67 %, tỷ lệ dương tính kháng ngun ni cấy 40 % Tồn - Số lần ni cấy ít, thử nghiệm nuôi cấy kháng ngun - Điều kiện có phòng thí nghiệm chưa tốt - Khơng có huyết chuẩn để làm đối chứng - Vẫn phụ thuộc mơi trường ni cấy Leptospira, cung cấp phòng thí nghiệm Axcel – Pháp 5.3 Đề nghị Nên có trang thiết bị hỗ trợ buồng cấy vô trùng để tránh làm vấy nhiễm vào canh cấy Cần có tủ ấm để ổn định nhiệt độ tối ưu giúp cho xoắn khuẩn phát triển tối đa Có huyết chuẩn để làm đối chứng 33    Nghiên cứu môi trường tự tạo để nuôi cấy Leptospira TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Tô Minh Châu – Trần Thị Bích Liên, 2001 Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Trần Thanh Phong, 1996 Một số bệnh truyền nhiễm chó, mèo Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Nguyễn Phước Ninh, 2004 Bài giảng truyền nhiễm chung Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Nguyễn Việt Lan, 1996 Vi khuẩn học Tủ sách Đại học Y – Dược Tp.HCM Nguyễn Quang Thông, 2004 Điều tra tình hình nhiễm Leptospira chó khám điều trị Bệnh Xá Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Luận văn tốt nghiệp Trường Đại Học Nơng Lamt Tp.HCM Tiếng nước ngồi Quinn P.J, 1998 Clinical Veterinary Microbiology – London P.L McDonough, 2001 Leptospira in Dogs – Current Status International Veterinary Information Service (www.ivis.org), Ithaca, New York, USA Cumberland P, Everarad CO, Levett PN, Assessment of the efficacy of an IgM – Elisa and microscopic aggulination test (MAT) in the diagnostic of acute leptospira Am I Trop Med Hyg 1999; 61:731 – 37 Cole JR Jr., Sulzer CR, Pursell AR, Improved microtechnique for the Leptospira microscopic aggulutination test Appl Microbial 1973; 25:976 – 80 10 D.Postic – F Merien – P.Perolat – G.Baranton, 2000 Diagnostic biologique leptospirose – borreliose de Lyme Intstitut Pasteur 11 Hathaway S.C., Little T.W.A & Pritchard D.G (1986) Problems associated with the diagnosis of Leptospira interrogans serovars hardjo infection in bovine populations Vet Rec., 119, Pages 84-86 34    12 National Veterinary Services Laboratories (1987) Microtitre technique for detection of Leptospira antibodies Proc U.S Anim Health Assoc., 91, Pages 65-73 13 Stefan Schreier, Wannapong Triampo, Galayanee Doungchawee, Darapond Triampo, Sudarat Chadsuthi, 2009 Leptospirosis research: fast, easy and reliable enumeration of mobile leptospires, Biological Research versión impresa, ISSN 0716-9760; Biol Res 42, Pages 5-12, 2009 14 A.Bharti, J.Nally, J.Ricaldi, M.Matthias, M.Diaz, M.Lovett, P.Levett, R.Gilman, M.Willig, E.Gotuzzo, 2003, Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance, The Lancet Infectious Diseases, Volume 3, Issue 12, Pages 757771 15 Marcos Tucunduva de Faria, Michael S Calderwood, Daniel A Athanazio, McBride JA Alan, Rudy A Hartskeerl, Martha Maria Pereira, Albert Tôi Ko, Mitermayer G Reis, 2008, Carriage of Leptospira interrogans among domestic rats from an urban setting highly endemic for leptospirosis in Brazil, Acta Tropica Volume 108, Issue , October 2008, Pages 1-5 16 Quinn P.J, Carter M.E, Markey B.K and Carter G.R, 1994 The spirochaetes Clinical Veterinary Microbiology Mosby – Year Book Europe Limited P: 292 – 299   35    ... thường): lắc canh cấy so sánh canh cấy với môi trường chưa nuôi cấy, ghi nhận ngày canh khuẩn xuất vẩn đục Mật độ Leptospira canh cấy (kiểm tra kính hiển vi đen vật kính x10) ngày canh cấy xuất... điều kiện nuôi cấy tĩnh Canh cấy kết luận âm tính sau tháng theo dõi môi trường nuôi cấy mà khơng bắt gặp xoắn thể có canh cấy  Kỹ thu t PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thu t PCR dựa việc khuếch... chẩn đốn Leptospirosis, kỹ thu t MAT (Microscopic Agglutination Test) sử dụng nhiều tính đặc hiệu, độ nhạy cho kết nhanh MAT cho phép phát nhanh kháng thể IgG huyết nên kỹ thu t xem công cụ cho điều