NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT VÀI CÂY DƯỢC LIỆU VIỆT NAM TRÊN VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ PHỔI HEO BỆNH

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y  LÊ THANH NHẠN NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT VÀI CÂY DƯỢC LIỆU VIỆT NAM TRÊN VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ PHỔI HEO BỆNH Khố luận đệ trình để đáp ứng nhu cầu cấp Bác sỹ thú y Giáo viên hướng dẫn TS NGUYỄN NGỌC HẢI Tháng 07/2010 i ii LỜI CẢM TẠ Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến với gia đình thân thương tôi, nơi sinh ra, lớn lên trưởng thành có hội để thực đề tài Đặc biệt, xin cảm ơn người mẹ thân yêu tôi, người luôn dõi theo tôi, cho lời khuyên hữu hiệu Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến : - Hiệp hội đại học Pháp ngữ (AUF : Agence Universitaire de la Francophone), tạo điều kiện cho học chương trình tiếng Pháp cho việc thực hiệc đề tài - Giáo sư Claude Chevrier, trng khoa Productions Animales ca trng i hc Franỗois Rabelais, Tours, Cộng hoà Pháp, đồng ý Chủ tịch Hội đồng Báo cáo tốt nghiệp khoá 2005 – 2010 - Cô Trần Thị Quỳnh Lan, thầy Nguyễn Văn Khanh, thầy Trần Thanh Phong, Thầy Lê Quang Thông thầy Nguyễn Kiên Cường, tham gia Hội đồng Báo cáo tốt nghiệp khoá 2005 – 2010 chúng tơi Tơi muốn bày tỏ lòng biết ơn đến TS Nguyễn Ngọc Hải, môn Vi sinh truyền nhiễm, người hướng dẫn, theo sát đề tài tơi, người giải thích mối liên hệ lý thuyết thực hành truyền đạt cho kinh nghiệm thực tế quý giá cách tận tuỵ Tôi xin gởi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Kim Loan thầy Trương Đình Bảo, mơn vi sinh truyền nhiễm, bác sỹ thú y công tác Bệnh viện thú y Đại học Nơng lâm góp ý, giúp đỡ tơi nhiệt tình suốt q trình tơi thực tập phòng Vi sinh Bộ mơn Đồng gởi lời cảm ơn đến Thạc sỹ Phạm Thị Minh Tâm, trưởng khoa Vi sinh, dược sỹ Huỳnh Hoa Phượng dược sỹ Đoàn Ngọc Long, nhân viên Viện kiểm nghiệm thuốc iii thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tơi việc tìm tài liệu, truyền đạt cho nhiều kinh nghiệm lĩnh vực thực hành vi sinh lĩnh vực dược liệu Cuối cùng, không quên cảm ơn người bạn quanh tôi, người giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần, luôn ủng hộ suốt năm năm giảng đường Đại học iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu "Nghiên cứu tác dụng kháng sinh số dược liệu Việt Nam Pasteurella multocida phân lập từ phổi heo bệnh " tiến hành năm tháng (từ tháng năm 2010 đến tháng năm 2010) nhằm mục đích đánh giá hiệu kháng sinh chất chiết từ dược liệu vi khuẩn Pasteurella multocida, để tìm phương pháp thay kháng sinh tổng hợp thuốc kháng sinh tự nhiên dược liệu Phương pháp nghiên cứu Phân lập Pasteurella multocida Chuẩn bị chất dược liệu nghiên cứu: Lonicera japonica, Stemona tuberosa Allium sativum Plectranthus amboinicus Phương pháp khuếch tán thạch Kết Các trường hợp đề kháng kháng sinh P.multocida ghi nhận: colistin (20%) streptomycin (30%) Dịch chiết cồn Lonicera japonica, Stemona tuberosa, Allium sativum dịch ép A.sativum thể rõ khả kháng gốc P.multocida phân lập Ngược lại, dịch ép Plectranthus amboinicus dịch chiết nước Stemona tuberosa không ức chế vi khuẩn Hỗn hợp dịch chiết L japonica – dịch ép A sativum hỗn hợp dịch chiết S tuberora – dịch ép A sativum có tác dụng cộng hưởng việc ức chế gốc P.multocida phân lập Tác dụng kháng khuẩn nước ép A.sativum tương đương với tác dụng norfloxacin với nồng độ ban đầu 200 g/ml tỷ lệ pha loãng 1/8, 1/4 1/2 v RESUME The statement about "Studying the effect of some antibiotics on plants vietnamese pharmacopoeias Pasteurella multocida isolated from swine lungs lésionels " was conducted during five months (February 2010 - June 2010) for aim to assess the effect of antibiotic plant extract on Vietnamese pharmacopoeias Pasteurella multocida, and finally arrived to replace antibiotics synthéthiques by natural antibiotics such as plants pharmacopoeias Method applied: Isolation and identification of Pasteurella multocida Preparation of plant extracts pharmacopoeias Susceptibility by the agar diffusion Results: 1) The antibiotic resistance has been sought from P.multocida colistin (20%) and streptomycin (30%) 2) The extracts of Lonicera japonica, Stemona tuberosa and Allium sativum expressed ability antibacterial strains isolated P.multocida now 3) The interactive effect exists in the mixed extract of L japonica and juice A sativum and much clearer than in the extract of S tuberora and juice of A sativum 4) The antibacterial effect of juice A sativum costs was equivalent to that of norfloxacin solution with initial concentration of 200 mg / ml and the proportion of dilution eighth, quarter or half vi MỤC LỤC TRANG Trang tựa .i Phiếu xác nhận giáo viên hướng dẫn ii Lời cảm tạ .iii Tóm tắt v Mục lục vii Danh sách chữ viết tắt x Danh sách bảng .xi Danh sách hình .xiii Danh sách biểu đồ xiv Chương ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan Pasteurella multocida 2.1.1 Lịch sử 2.1.2 Phân loại .2 2.1.3 Phân bố 2.1.4 Đặc điểm .3 2.2 2.1.4.1 Đặc điểm hình thái 2.1.4.2 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.4.3 Khu trú khả gây bệnh 2.1.4.4 Sức đề kháng .5 2.1.4.5 Điều trị phòng bệnh Tổng quan dược liệu nghiên cứu 2.2.1 Allium sativum vii 2.2.1.1 Phân loại đặc điểm nhận biết 2.2.1.2 Phân bố, thu hái sơ chế .8 2.2.1.3 Thành phần hoá học 2.2.1.4 Tác dụng dược lý .8 2.2.2 Lonicera japonica 2.2.2.1 Phân loại đặc điểm nhận biết 2.2.2.2 Phân bố, thu hái sơ chế .10 2.2.2.3 Thành phần hoá học 10 2.2.2.4 Tác dụng dược lý .10 2.2.3 Plectranthus amboinicu 10 2.2.3.1 Phân loại đặc điểm nhận biết 10 2.2.3.2 Phân bố, thu hái sơ chế .11 2.2.3.3 Thành phần hoá học 11 2.2.3.4 Tác dụng dược lý .11 2.2.4 Stemona tuberosa 12 2.2.4.1 Phân loại đặc điểm nhận biết 12 2.2.4.2 Phân bố, thu hái sơ chế .13 2.2.4.3 Thành phần hoá học 13 2.2.4.4 Tác dụng dược lý .13 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 3.1 Thời gian địa điểm 14 3.1.1 Thời gian .14 3.1.2 Địa điểm 14 3.2 Đối tượng nghiên cứu 14 3.3 Nội dung nghiên cứu 14 3.4 Trang thiết bị dụng cụ 14 3.4.1 Môi trường nuôi cấy 14 viii 3.4.2 Môi trường sinh hố 15 3.4.3 Mơi trường tăng sinh 15 3.4.4 Môi trường giữ gốc 15 3.4.5 Môi trường dụng cụ cho kháng sinh đồ 15 3.4.6 Hoá chất 15 3.5 Phương pháp thí nghiệm 15 3.5.1 Phân lập Pasteurella multocida 15 3.5.2 Chiết xuất dược liệu khảo sát 18 3.5.3 Đĩa giấy dược liệu 19 3.5.4 Kháng sinh đồ .20 3.5.5 Đánh giá tác dụng kháng sinh dược liệu gốc P.multocida phân lập 21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Phân lập Pasteurella multocida 26 4.2 Kháng sinh đồ 29 4.3 Kết thí nghiệm để đánh giá hiệu kháng sinh dịch chiết dược liệu lên P.multocida 30 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .46 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghị .47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 50 I Thành phần môi trường nuôi cấy 50 II Bộ INDS14 GNR .51 III Phương pháp nhuộm Gram 53 IV Độ đục chuẩnMac Farland .53 V Phân tích thống kê 55 ix BẢNG VIẾT TẮT BAB : Blood Agar Base BHI : Beef Heart Infusion d : Đường kính trung bình vòng vơ khuẩn LDC : Lysin Decarboxylase MHA : Mueller – Hinton Agar MOB: Mobilité ONPG : Otho- Nitrophenyl- β - galactoside PAD : Phenyl Alanin Deaminase TSA : Tryptone Soya Agar UFC : Unité de Forme Colonie, đơn vị tế bào x III Phương pháp nhuộm Gram - Sau vi khuẩn cố định lame (hai phương pháp cố định: cố định cồn 90o cách lia phiến lame qua lửa), vết bôi vi khuẩn nhuộm màu đầu tiên, phút Rửa nước - Sau đó, tiếp tục cho Lugol iốt - phút để tăng cường độ bám crystal violet tế bào chất vi khuẩn vi khuẩn gram dương Rửa nước - Nhúng lame vào dd cồn acid để tẩy màu tím Bước quan trọng định đâu vi khuẩn Gram dương âm Nguyên tắc sau: vi khuẩn Gram dương có tường đầy đủ peptidoglycan, thành phần ngăn chặn cồn lấy màu tím vi khuẩn Gram âm khơng có thành phần nên màu tím bị cồn rửa trơi - Nhuộm vết bôi chất nhuộm màu thứ hai, fushine (1 phút) Vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng fushin - Và sau lame rửa để khô tự nhiên - Cuối cùng, lame quan sát kính hiển vi quang học, thơng thường độ phóng đại 1000 lần với giọt dầu soi kính IV Độ đục chuẩn Mac Farland Để tiêu chuẩn hoá huyễn dịch vi khuẩn phục vụ cho nghiên cứu khoa học, người ta dùng chuẩn độ đục Mac Farland Dung dịch dựa vào nguyên tắc hoá học để tạo độ đục H2SO4 + BaCl2  Ba SO4 + HCl Pha huyễn dịch vi khuẩn có độ đục tương đương 108 UFC/ml - Lấy lượng vi khuẩn pha vào nước muối sinh lý tiệt trùng - Đánh tan trộn với máy vortex để có dung dịch đồng 53 - So sánh độ đục huyễn dịch với ống chuẩn Mac Farland 0,5 Pha dung dịch Mac Farland (Nguồn : theo Biomérieux) 54 V Phân tích thống kê Expérience 1: Évaluer la capacité antibiotique des extraits bruts des plantes pharmaceutiques sur la gélose Anova: Single Factor : L'effet antibactérienne des extraits des plantes pharmaceutiques sur Pasteurella multocida SUMMARY Groups L.jap S.tub A.sat A.sat Count 10 10 10 10 ANOVA : Variance de d Source of Variation SS Between groups 1028.31041 Within groups 70.91878 Total 1099.22919 Sum 228.68 150 293.17 224.93 df Average 22.868 15 29.317 22.493 Variance 2.69164 0.931244444 3.331934444 0.925045556 MS F 342.770137 173.9979864 36 1.96996611 39 55 P-value F crit 1.776E-21 2.8662656 Comparaison entre les résultats des extraits pharmaceutiques t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances Mean Variance Observations Pooled Variance Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T