Đánh giá đa dạng trình tự ADN ITS của loài muồng ở việt nam

LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin phép gửi lời cảm ơn chân thành tới : TS Phùng Thanh Hương Ths Hà Thị Thu Những người Thày trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt, giúp đỡ đặc biệt truyền nhiệt huyết cho em suốt trình thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn Thày, Cô giáo, chị kỹ thuật viên - mơn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành đề tài Xin cảm ơn anh, chị công tác Phòng Vi sinh phân tử - Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam hết lòng giúp đỡ em trình thực đề tài tốt nghiệp Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln động lực, nguồn cổ vũ, động viên giúp em hồn thành chương trình đại học khóa luận tốt nghiệp Sinh viên Phạm Việt Cường Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan vùng phiên mã nội ADN ribosom (ITS-rADN) 1.1.1.Cấu trúc ITS-rADN 1.1.2.Vai trò ITS-rADN 1.1.3.Ứng dụng ITS-rADN nghiên cứu thuốc 1.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền thuốc giới Việt Nam 1.2.1.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền thuốc giới 1.2.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền thuốc Việt Nam 1.3.Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) 10 1.3.1.Giới thiệu họ Cam (Rutaceae) chi Xuyên tiêu (Zanthoxylum) 10 1.3.2.Loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) 11 1.3.3.Tình hình nghiên cứu sử dụng loài Muồng truổng 13 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1.Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu 15 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2.Hóa chất, sinh phẩm 15 2.1.3.Trang thiết bị 17 2.2.Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1.Phương pháp tách chiết ADN tổng số 19 2.2.2.Phương pháp khuếch đại ADN PCR 19 2.2.3.Phương pháp điện di ADN gel agarose 21 2.2.4.Phương pháp tách dòng 21 2.2.5.Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli 22 2.2.6.Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn 24 2.2.7.Phương pháp cắt ADN enzym giới hạn 24 2.2.8.Phương pháp tinh ADN plasmid 25 2.2.9.Phương pháp giải trình tự ADN 26 2.2.10.Phương pháp so sánh trình tự ADN 27 Chương THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28 3.1.Kết tách chiết ADN tổng số từ Muồng truổng …………………….……28 3.2.Kết khuếch đại ADN PCR 29 3.3.Kết chọn dòng gen ITS-rADN 30 3.4.Kết tinh plasmid tái tổ hợp 32 3.5 Kết giải trình tự vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng 33 3.6.Kết so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN 35 3.6.1.Kết so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng.35 3.6.2.Kết so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng với trình tự chi Zanthoxylum công bố ngân hàng gen giới 37 3.6.3.Kết phân loại trình tự ITS-rADN mẫu Muồng truổng 38 Chương BÀN LUẬN 40 4.1 Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN loài Muồng truổng 40 4.2 Về đa dạng di truyền loài Muồng truổng Việt Nam 41 KẾT LUẬN 44 ĐỀ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A,T,G,C Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin ADN Acid deoxyribonucleic rADN ADN mã hóa cho ARN ribosom AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi ATCC American Type Culture Collection bp Base pair DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethylsulfoxid dNTP Deoxyribonucleotid triphosphat E.coli Escherichia coli EDTA Ethylen Diamin Tetra acetic Acid EtBr Ethidium Bromid HA22T Tế bào ung thư biểu mô gan IGS Intergenic spacer IPTG Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranosid ISSR Inter-Simple Sequence Repeat ITS Internal Transcribed Spacer (Vùng phiên mã nội) ITS-rADN Internal Transcribed Spacer – ribosomal AND (Trình tự ADN ribosom đoạn ITS) K-562 Tế bào ung thư bạch cầu người KHTN Khoa học tự nhiên LB Luria-Bertani OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PP2A Protein phosphatase 2A RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SAMPL Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci SDS Sodium Dodecyl Sulphat TAE Tris - Acetic acid – EDTA Taq Thermus aquaticus X-gal 5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Kích thước phần trăm G+C vùng ITS1 ITS2 số lồi thực vật hạt kín Bảng 2.1 Danh sách địa điểm thu hái mẫu Muồng truổng 15 Bảng 2.2 Cặp mồi dùng phản ứng PCR 15 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 20 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng tạo vertor tái tổ hợp 22 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid 25 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng giải trình tự gen 26 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt phản ứng đọc trình tự 27 Bảng 3.1 Kết kiểm tra độ tinh nồng độ ADN tổng số 29 Bảng 3.2 Tỉ lệ %(G+C) vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng 35 Bảng 3.3 Hệ số tương đồngtrình tự vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng37 Bảng 3.4 Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN mẫu ZA1-ZA5 mẫu ZAK, ZSK 38 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc tổng thể vùng ADN ribosom thực vật Hình 1.2 Cầu trúc vùng phiên mã nội ITS-rADN Hình 1.3 Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) 12 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 18 Hình 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 28 Hình 3.2 Sản phẩm PCR mẫu Muồng truổng 29 Hình 3.3 Ảnh điện di thể plasmid tách từ tế bào E.coli sau biến nạp mẫu ZA1 ZA2 30 Hình 3.4 Ảnh điện di thể plasmid tách từ tế bào E.coli sau biến nạp mẫu ZA3, ZA4, ZA5 31 Hình 3.5 Sản phẩm cắt plasmid enzym giới hạn EcoRI 32 Hình 3.6 Sản phẩm tinh plasmid mang gen ITS-rADN 33 Hình 3.7 Trình tự nucleotid đoạn ITS-rADN mẫu Muồng truổng 35 Hình 3.8 Kết so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng 37 Hình 3.9 Cây phân loại mẫu Muồng truổng dựa so sánh trình tự ITS-rADN 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam đánh giá quốc gia có nguồn thuốc tự nhiên phong phú đa dạng chủng loại lẫn công dụng làm thuốc Tuy nhiên có khoảng 5% số lồi có cơng dụng làm thuốc giới thiệu đưa vào khai thác, số loài chưa nghiên cứu đánh giá lớn [3] Cùng với nhu cầu sử dụng thuốc hàng năm nước ngày tăng, nguồn thuốc tự nhiên lại chưa quản lý khai thác chặt chẽ dẫn đến cạn kiệt số lượng dần tính đa dạng Trong bối cảnh cần nhanh chóng thực biện pháp nhằm bảo vệ, sử dụng phát triển nguồn thuốc cách hợp lý Trong số biện pháp cần thiết nay, đánh giá đa dạng di truyền nguồn thuốc có vai trò đặc biệt quan trọng Việc làm có nhiều ý nghĩa nghiên cứu, khai thác sử dụng nguồn thuốc, như: xây dựng bảo tồn nguồn gen; chọn tạo giống cho suất cao, chất lượng tốt; xác định nguồn gốc, quan hệ tiến hóa; nhận diện dược liệu cách xác Ngồi liệu cấu trúc gen quần thể thuốc cần thiết cho chiến lược khai thác sử dụng hiệu nguồn tài nguyên thuốc [14], [30] Để đánh giá đa dạng di truyền thuốc, giới có nhiều loại thị ADN marker phân tử sử dụng RAPD-PCR, AFLP, ITS-rADN, ADN lạp thể… Trong số trình tự vùng phiên mã nội ADN ribosom (ITS-rADN) biết đến marker phân tử có nhiều ưu điểm trội đánh giá đa dạng di truyền tính chất vừa bảo thủ, vừa siêu biến giúp xác định nguồn gốc quan hệ tiến hóa lồi cá thể lồi, hay có độ lặp lại cao ADN nhân giúp thực kĩ thuật khuếch đại, giải trình tự dễ dàng [16], [40] Mặc dù ứng dụng rộng rãi nghiên cứu di truyền thực vật giới trình tự vùng phiên mã nội ADN ribosom lại chưa sử dụng đánh giá đa dạng di truyền thuốc Việt Nam Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) vị thuốc từ lâu dân gian sử dụng để chữa bệnh mẩn ngứa, lở loét [10] Gần đây, số nghiên cứu giới cho thấy tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư, tác dụng kháng khuẩn dịch chiết từ Muồng truổng [21], [43] Bên cạnh rễ, Muồng truổng chứa nhiều hợp chất thuộc nhóm: alkaloid (chiếm phần lớn berberin), terpenoid (tinh dầu), flavanoid coumarin [5] Có thể thấy Muồng truổng thuốc có nhiều tiềm nghiên cứu sản xuất dược phẩm Tuy nhiên nước ta chưa có nhiều nghiên cứu lồi Muồng truổng, nghiên cứu Muồng truổng dừng lại việc xác định thành phần hóa học Do cần đẩy mạnh nhiều nghiên cứu loài Muồng truổng nữa, bao gồm nghiên cứu di truyền, bảo tồn gen Xuất phát từ lý đề tài “Đánh giá đa dạng trình tự ADN ITS loài Muồng truổng Việt Nam” thực hiên với hai mục tiêu sau: Xác định trình tự vùng ITS-rADN mẫu lồi Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) thu hái vùng khác Việt Nam So sánh trình tự vùng ITS-rADN cá thể loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) Việt Nam với với trình tự công bố ngân hàng gen giới, qua đánh giá đa dạng di truyền lồi Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) Việt Nam Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Chương TỔNG QUAN  Tổng quan vùng phiên mã nội ADN ribosom (ITS-rADN)  Cấu trúc ITS-rADN Trong chuỗi ADN nhân tế bào thực vật, khu vực nghiên cứu nhiều vùng ADN ribosom 18S-26S hai vùng phiên mã nội (ITS1, ITS2) với nhiều đoạn lặp trình tự nucleotid [15] Dưới sơ đồ thể cấu trúc tổng thể ADN ribosom Hình 1.1 Cấu trúc tổng thể vùng ADN ribosom thực vật [33]  Vị trí ADN ribosom nhiễm sắc thể  Các đoạn gen (18S-5,8S-26S) xếp liên tiếp ADN ribosom ADN ribosom gồm đoạn gen (18S-5,8S-26S) xếp liên tiếp nhau, chia cắt đoạn gen vùng liên kết IGS (intergenic spacer) có kích thước thay đổi quần thể khác nhau, có cá thể [33] Trong đoạn gen (18S-5,8S-26S) vùng ITS nằm đơn vị 18S 26S Vùng ITS có phần: ITS1; 5,8S ITS2, tiểu đơn vị 5,8S vùng có trình tự bảo tồn tiến hóa cao Vùng ITS chứng minh trình tự ADN mang đặc tính hữu ích cho việc nghiên cứu phát sinh loài thực vật hạt kín [16] Hình 1.2 Cấu trúc vùng phiên mã nội ITS-rADN [16] Trong nghiên cứu thống kê cho thấy số lồi thực vật có hoa, kích thước vùng ITS1 ITS2 thường nhỏ 300bp (ITS1: 187-298 bp; ITS2: 187-252 bp), ngược lại, số sinh vật nhân thật khác kích thước vùng lớn nhiều, ví dụ lồi động vật có xương sống Vùng tiểu phân 5,8S có kích thước khơng đổi 163-164 bp Ở thực vật, kích thước tồn vùng ITS xấp xỉ 500-750 bp thực vật hạt kín xấp xỉ 15003700 bp thực vật hạt trần Ví dụ: nghiên cứu cho thấy kích thước vùng ITS chi Phyllanthus dao động từ 571-597 bp, loài Breynia fruticosa có kích thước vùng ITS 608 bp lồi Euphorbia milii 649 bp Kích thước vùng ITS nấm xấp xỉ 600-800 bp [15], [16], [29] Vùng ITS1 thường có kích thước lớn vùng ITS2, ví dụ số loài sau: Adoxaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Canellaceae, Malvaceae, Onagraceae, Polemoniaceae Ngược lại, số loài vùng ITS2 có kích thước lớn vùng ITS1 như: Betulaceae, Cucurbitaceae, Scrophulariaceae Viscaceae Ở loài Solanaceae, hai vùng có kích thước gần Đối với họ lớn như: Fabaceae, Poaceae Rosaceae, vùng ITS1 có kích thước dài ngắn vùng ITS2 Vùng ITS1 ITS2 khác kích thuớc % (G+C) Sau ví dụ kích thước % (G+C) vùng ITS1 ITS2 số Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi loài [16] Bảng 1.1 Kích thước phần trăm G+C vùng ITS1 ITS2 số lồi thực vật hạt kín [16] ITS1 Nhóm Kích thước ITS2 %(G+C) (bp) Kích thước %(G+C) (bp) Adoxaceae, Viburnum, 28 loài 224-231 59-69 215-227 59-69 Betulaceae, Alnu, loài 215-216 58-64 228-229 53-65 Canellaceae, Canella, loài 272 63 209 63 Fabaceae, Galegeae, 31 loài 221-231 55-60 207-217 50-54 Poaceae, Pooideae,10 loài 217-223 55-64 213-221 59-67  Vai trò ITS-rADN Giống sinh vật nhân thật khác, hệ gen thực vật bậc cao bao gồm ADN nhân ADN nhân ADN nhân gồm có ADN lạp thể ADN ti thể ADN ti thể mang nguồn gốc từ “mẹ”, không đánh giá xác chất di truyền nên dùng nghiên cứu phát sinh lồi ADN lạp thể thực vật có tính bảo thủ cao có tần số đột biến thấp dùng làm tìm hiểu nguồn gốc lồi lồi Tuy nhiên để tìm hiểu nguồn gốc bậc phân loại thấp ADN nhân tỏ có nhiều ưu ADN nhân có mức độ tiến hóa nhanh hơn, cho phép phân tích khác biệt di truyền loài chi hay cá thể lồi Bên cạnh có nhiều chứng chứng minh tái cấu trúc loài có quan hệ di truyền việc sử dụng ADN ngồi nhân làm sai lệch lớn đến phân loại [15], [17] Vùng phiên mã nội ADN ribosom (ITS-rADN) vùng gen vừa mang tính bảo thủ (đoạn 5,8S) vừa mang tính siêu biến (vùng ITS1 ITS2) có khả phản ánh quan hệ tiến hóa đánh giá đa dạng di truyền mức độ chi, lồi lồi Trái lại, trình tự nucleotid vùng 18S ADN lạp thể có mức độ bảo thủ q cao nên khơng đủ chi tiết để phân định cá thể lồi [16], [40] Song song với đặc tính hữu ích nói trên, trình tự vùng phiên mã nội ADN ribosom có số ưu điểm bật khẳng định ưu nghiên cứu phát sinh loài đánh giá đa dạng di truyền thực vật hạt kín, là: thứ nhất, vùng ITS mang đặc tính di truyền “bố” “mẹ”, khác với marker ADN lạp thể hay ADN ti thể mang đặc tính di truyền phản ứng giải trình tự ADN Quá trình giải trình tự thực máy giải trình tự tự động ABI 3100 (Applied Biosystems) Sau giải trình tự ADN ribosom vùng ITS mẫu Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.), trình tự phân tích phần mềm PC/Gene Kết thể hình 3.7  Trình tự nucleotid ITS-rADN mẫu ZA1 GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC ATTGTCGAAA CCTCTGCAAG AGCAGAACGA CCCGCGAACT CGTGATCGCA CTCGCGGGGG GCGCGCTTCG CGGCCGCTCC CCCACGTCTC CGCGGGTGCG GGACTCCTCC CGTTCCCCGC GGGGGCCATA ACGAACCCCC GGCGCGGACT GCGCCAAGGA AATCTAACGA GAGAGCACGC GCCCGGGGCC CCGGACACGG TGCGCTCCGG GACGCGGCGC CTTCTTTCAC TCTATCTGAA ACGACTCTCG GCAACGGATA TCTCGGCTCT CGCATCGATG AAGAACGTAG CGAAATGCGA TACTTGGTGT GAATTGCAGA ATCCCGTGAA CCATCGAGTC TTTGAACGCA AGTTGCGCCC CAAGCCTTTA GGCCGAGGGC ACGTCTGCCT GGGTGTCACG CATCGTTGCC CCGCCCCGCC CCCGCCCGGG GGCCTGGCGG CGAGGGCGGA TAATGGCCTC CCGTGCGCTC CCCGCTCGCG GTTGGCCCAA ATCCGAGTCC ACGGCGACCG GAGCCGCGAC GATCGGTGGT GAAAACATGC CTCTCGAGCT CACGTCGCGT GCCCGGCTCT CCGTTCCGAG ACTCAGGGAC CCCGACGCTC CGCGCGAGCG GCGCTCGCAT CGCGACCCCA GGTCAGGCGG GGATTACCCG CTGTGTTTAA GCATATCAAT AAGCGGAGGA  Trình tự nucleotid ITS-rADN mẫu ZA2 GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC ATTGTCGAAA CCTCTGCAAG AGCAGAACGA CCCGCGAACT CGTGATCGCA CTCGCGGGGG GCGCGCTTCG CGGCCGCTCC CCCACGTCTC CGCGGGTGCG GGACTCCTCC CGTTCCCCGC GGGGGCCATA ACGAACCCCC GGCGCGGACT GCGCCAAGGA AATCTAACGA GAGAGCACGC GCCCGGGGCC CCGGACACGG TGCGCTCCGG GACGCGGCGC CTTCTTTCAC TCTATCTGAA ACGACTCTCG GCAACGGATA TCTCGGCTCT CGCATCGATG AAGAACGTAA CGAAATGCGA TACTTGGTGT GAATTGCAGA ATCCCGTGAA CCATCGAGTC TTTGAACGCA AGTTGCGCCC CAAGCCTTTA GGCCGAGGGC ACGTCTGCCT GGGTGTCACG CATCGTTGCC CCGCCCCGCC CCCGCCCGGG GGCCTGGCGG CGAGGGCGGA TAATGGCCTC CCGTGCGCTC CCCGCTCGCG GTTGGCCCAA ATCCGAGTCC ACGGCGACCG GAGCCGCGAC GATCGGTGGT GAAAACATGC CTCTCGAGCT CACGTCGCGT GCCCGGCTCT CCGTTCCGAG ACTCAGGGAC CCCGACGCTC CGCGCGAGCG GCGCTCGCAT CGCGACCCCA GGTCAGGCGG GATTACCCGC TGAGTTTAAG CATATCAATA AAGCGGAGGA  Trình tự nucleotid ITS-rADN mẫu ZA3 GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC ATTGTCGAAA CCTCTGCAAG AGCAGAACGA CCCGCGAACT CGTGATCGCA CTCGCGGGGG GCGCGCTTCG CGGCCGCTCC CCCACGTCTC CGCGGGTGCG GGACTCCTCC CGTTCCCCGC GGGGGCCATA TCGAACCCCC GGCGCGGACT GCGCCAAGGA AATCTAACGA GAGAGCACGC GCCCGGGGCC CCGGACACGG TGCGCTCCGG GACGCGGCGC CTTCTTTCAC TCTATCTGAA ACGACTCTCG GCAACGGATA TCTCGGCTCT CGCATCGATG AAGAACGTAG CGAAATGCGA TACTTGGTGT GAATTGCAGA ATCCCGTGAA CCATCGAGTC TTTGAACGCA AGTTGCGCCC CAAGCCTTTA GGCCGAGGGC ACGTCTGCCT GGGTGTCACG CATCGTTGCC CCGCCCCGCC CCCGCCCGGG GGCCTGGCGG CGAGGGCGGA TAATGGCCTC CCGTGCGCTC CCCGCTCGCG GTTGGCCCAA ATCCGAGTCC ACGGCGACCG GAGCCGCGAC GATCGGTGGT GAAAACATGC CTCTCGAGCT CACGTCGCGT GCCCGGCTCT CCGTTCCGAG ACTCAGGGAC CCCGACGCTC CGCGCGAGCG GCGCTCGCAT CGCGACCCCA GGTCAGGCGG GATTACCCGC TGAGTTTAAG CATATCAATA AGCGGAGGA  Trình tự nucleotid ITS-rADN mẫu ZA4 GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC ATTGTCGAAA CCTCTGCAAG AGCAGAACGA CTCGCGAACT CGTGATCGCA CTCGCGGGGG GCGCGCTTCG CGGCCGCTCC CCCACGTCTC CGCGGGTGCG GGACTCCTCC CGTTCCCCGC GGGGGCCATA TCGAACCCCC GGCGCGGACT GCGCCAAGGA AATCTAACGA GAGAGCACGC GCCCGGGGCC CCGGACACGG TGCGCTCCGG GACGCGGCGC CTTCTTTCAC TCTATCTGAA ACGACTCTCG GCAACGGATA TCTCGGCTCT CGCATCGATG AAGAACGTAG CGAAATGCGA TACTTGGTGT GAATTGCAGA ATCCCGTGAA CCATCGAGTC TTTGAACGCA AGTTGCGCCC CAAGCCTTTA GGCCGAGGGC ACGTCTGCCT GGGTGTCACG CATCGTTGCC CCGCCCCGCC CCCGCCCGGG Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi AGCCTGGCGG CGAGGGCGGA TAATGGCCTC CCGTGCGCTC CCCGCTCGCG GTTGGCCCAA ATCCGAGTCC ACGGCGACCG GAGCCGCGAC GATCGGTGGT GAAAACATGC CTCTCGAGCT CACGTCGCGT GCCCGGCTCT CCGTTCCGAG ACTCAGGGAC CCCGACGCTC CGCGCGAGCG GCGCTCGCAT CGCGACCCCA GGTCAGGCGG GATTACCCGC TGAGTTTAAG CATATCAATA AGCGGAGGA  Trình tự nucleotid ITS-rADN mẫu ZA5 GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC ATTGTCGAAA CCTCTGCAAG AGCAGAACGA CCCGCGAACT CGTGATCGCA CTCGCGGGGG GCGCGCTTCG CGGCCGCTCC CCCACGTCTC CGCGGGTGCG GGACTCCTCC CGTTCCCCGC GGGGGCCATA ACGAACCCCC GGCGCGGACT GCGCCAAGGA AATCTAACGA GAGAGCACGC GCCCGGGGCC CCGGACACGG TGCGCTCCGG GACGCGGCGC CTTCTTTCAC TCTATCTGAA ACGACTCTCG GCAACGGATA TCTCGGCTCT CGCATCGATG AAGAACGTAG CGAAATGCGA TACTTGGTGT GAATTGCAGA ATCCCGTGAA CCATCGAGTC TTTGAACGCA AGTTGCGCCC CAAGCCTTTA GGCCGAGGGC ACGTCTGCCT GGGTGTCACG CATCGTTGCC CCGCCCCGCC CCCGCCCGGG GGCCTGGCGG CGAGGGCGGA TAATGGCCTC CCGTGCGCTC CCCGCTCGCG GTTGGCCCAA ATCCGAGTCC ACGGCGACCG GAGCCGCGAC GATCGGTGGT GAAAACATGC CTCTCGAGCT CACGTCGCGT GCCCGGCTCT CCGTTCCGAG ACTCAGGGAC CCCGACGCTC CGCGCGAGCG GCGCTCGCAT CGCGACCCCA GGTCAGGCGG GGATTACCCG CTGAGTTTAA GCATATCAAT AGCGGAGGA Hình 3.7 Trình tự nucleotid đoạn ITS-rADN mẫu Muồng truổng Nhận xét: Kích thước vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng dao động từ 729-730bp Sau xác định trình tự vùng phiên mã nội ITS-rADN mẫu Muồng truổng, sử dụng phần mềm BIOEDIT 7.2.0 để xác định tỉ lệ phần trăm thành phần (G+C) có trình tự Kết tỉ lệ phần trăm (G+C) kích thước vùng ITS-rADN thể bảng 3.2 đưới Bảng 3.2 Tỉ lệ %(G+C) vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng Mẫu % (G+C) Kích thước (bp) ZA1 64,66 730 ZA2 64,66 730 ZA3 64,47 729 ZA4 64,61 729 ZA5 64,33 729  Kết so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN 3.6.1 Kết so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng Trình tự đoạn ITS-rADN mẫu Muồng truổng sau xác định, đem so sánh với Phép so sánh gióng hàng thực phần mềm ClustalX2 Kết thể hình 3.8 ZA1 GGAAGTAAAA GTCGTAACAA GGTTTCCGTA GGTGAACCTG CGGAAGGATC ATTGTCGAAA ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZA1 CCTCTGCAAG AGCAGAACGA CCCGCGAACT CGTGATCGCA CTCGCGGGGG GCGCGCTTCG ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 T ZA1 CGGCCGCTCC CCCACGTCTC CGCGGGTGCG GGACTCCTCC CGTTCCCCGC GGGGGCCATA ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZA1 ACGAACCCCC GGCGCGGACT GCGCCAAGGA AATCTAACGA GAGAGCACGC GCCCGGGGCC ZA2 ZA3 ZA4 T ZA5 T ZA1 CCGGACACGG TGCGCTCCGG GACGCGGCGC CTTCTTTCAC TCTATCTGAA ACGACTCTCG ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZA1 GCAACGGATA TCTCGGCTCT CGCATCGATG AAGAACGTAG CGAAATGCGA TACTTGGTGT ZA2 ZA3 .A ZA4 ZA5 ZA1 GAATTGCAGA ATCCCGTGAA CCATCGAGTC TTTGAACGCA AGTTGCGCCC CAAGCCTTTA ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZA1 GGCCGAGGGC ACGTCTGCCT GGGTGTCACG CATCGTTGCC CCGCCCCGCC CCCGCCCGGG ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZA1 GGCCTGGCGG CGAGGGCGGA TAATGGCCTC CCGTGCGCTC CCCGCTCGCG GTTGGCCCAA ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 A ZA1 ATCCGAGTCC ACGGCGACCG GAGCCGCGAC GATCGGTGGT GAAAACATGC CTCTCGAGCT ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZA1 CACGTCGCGT GCCCGGCTCT CCGTTCCGAG ACTCAGGGAC CCCGACGCTC CGCGCGAGCG ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZA1 GCGCTCGCAT CGCGACCCCA GGTCAGGCGG GGATTACCCG CTGAGTTTAA GCATATCAAT ZA2 .T ZA3 .- ZA4 .- Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi ZA5 .- ZA1 AAGCGGAGGA ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 Hình 3.8 Kết so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng Nhận xét: Phép so sánh gióng hàng rõ khác trình tự nucleotid tập trung phía đầu vùng ITS1 Số nucleotid khác dao động từ 1-3 nucleotid Thực so sánh cặp công cụ BLAST, thu hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN mẫu Kết hệ số tương đồng thể bảng 3.3 : Bảng 3.3 Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng ZA1 ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZA1 ZA2 99,8 ZA3 99,7 99,6 ZA4 99,7 99,6 99,7 ZA5 99,5 99,3 99,5 99,7 Nhận xét: Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 99,3-99,8 %  Kết so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng với trình tự chi Zanthoxylum công bố ngân hàng gen giới Trình tự đoạn ITS-rADN mẫu Muồng truổng sau xác định, đem so sánh với trình tự ITS- rADN cơng bố ngân hàng gen giới Đó là: trình tự ITSrADN Zanthoxylum avicennae (kí hiệu ZAK) (mã số HM851487) Zanthoxylum schinifolium (kí hiệu ZSK) (mã số JN226786) Kết so sánh nhờ sử dụng công cụ BLAST thể hệ số tương đồng thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN mẫu ZA1-ZA5 mẫu ZAK, ZSK ZA1 ZA2 ZA3 ZA4 ZA5 ZAK 99,8 99,8 99,7 99,7 99,4 ZSK 96,9 96,7 96,9 96,9 96,6 Nhận xét: Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN mẫu ZA1-ZA5 với mẫu ZAK dao động từ 99,4-99,8% Trong hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN mẫu ZA1-ZA5 với mẫu ZSK thấp hơn, dao động từ 96,6-96,9%  Kết phân loại trình tự ITS-rADN mẫu Muồng truổng Sau xác định trình tự nucleotid vùng ITS-rADN tiến hành dựng phân loại phần mềm ClustalX2 Kết thể hình 3.9 Hình 3.9 Cây phân loại mẫu Muồng truổng dựa so sánh trình tự ITS-rADN Ghi chú: Tỉ lệ % lặp lại từ 100 phép thử độc lập (hệ số bootstrap) thể nhánh Nhận xét: Cây phân loại cho thấy trình tự vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng chia thành nhóm riêng biệt sau:  Nhóm gồm trình tự vùng ITS-rADN mẫu ZA4 ZA5 (có mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN 99,7%) Có hệ số bootstrap 87  Nhóm gồm trình tự vùng ITS-rADN mẫu ZA1 ZA2 (có mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN 99,8%) Có hệ số bootstrap 77  Nhóm gồm trình tự vùng ITS-rADN mẫu ZA3 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Chương BÀN LUẬN 4.1 Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN lồi Muồng truổng Để khuếch đại đoạn ITS-rADN từ sản phẩm ADN tổng số chiết tách được, đề tài sử dụng cặp mồi ITS4 – ITS5, cặp mồi sử dụng phổ biến giới nghiên cứu phân tử liên quan đến trình tự ITS-rADN (universal primers) Kết phản ứng PCR cho thấy sản phẩm thu có kích thước gần 750 bp (Hình 3.2), tức tương đương với kích thước đoạn ITS-rADN thường gặp (650 – 750 bp) nhiều lồi thực vật hạt kín Ví dụ: đậu Lens sp (650 bp)…[44] Để thuận lợi cho phản ứng phân tích trình tự nhằm bảo quản nguồn gen dùng cho mục đích nghiên cứu sau này, sản phẩm PCR đưa vào vector tái tổ hợp tiến hành chọn dòng plasmid mang đoạn gen mục tiêu Vector tách dòng lựa chọn plasmid pCR2.1 Plasmid pCR2.1 có gen kháng ampicillin nên E.coli có chứa vector phát triển mơi trường có ampicillin Mặt khác, vector pCR2.1 có gen lac-Z mã hóa cho enzym galactosidase chuyển hóa X-gal thành hợp chất có màu xanh Trong trường hợp đoạn gen ITSrADN tích hợp vào vector pCR2.1 gen lac-Z khơng biểu nên khơng chuyển hóa X-gal thành màu xanh Do vậy, mơi trường LB đặc có bổ sung ampicillin X-gal, khuẩn lạc màu xanh khuẩn lạc E.coli có plasmid pCR2.1 khơng tích hợp gen ITSrADN khuẩn lạc màu trắng khuẩn lạc E.coli có khả chứa plasmid pCR2.1 tích hợp gen ITS-rADN Tuy nhiên tất khuẩn lạc trắng mang gen ITS-rADN mà chúng khuẩn lạc mang gen LacZ khả tổng hợp enzym -galactosidase chuyển hóa X-gal thành hợp chất có màu xanh Mặc dù việc lựa chọn khuẩn lạc trắng để tiến hành tách chiết plasmid loại bỏ phần lớn trường hợp không mong muốn Tiếp tục lựa chọn dựa vào đặc điểm vector pCR2.1 tích hợp gen ITS-rADN có kích thước trọng lượng lớn nên di chuyển chậm điện trường so với vector pCR2.1 khơng tích hợp gen ITS-rADN Những nguyên tắc lựa chọn dòng plasmid tái tổ hợp nêu sử dụng phổ biến nghiên cứu sinh học phân tử ngồi nước [4], [34] Với ngun tắc trên, chúng tơi lựa chọn dòng E.coli mang plasmid tái tổ hợp khuẩn lạc trắng tương ứng với đường chạy số 1, 3, 4, 5, 7, 8, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 (Hình 3.3 3.4) Tuy nhiên, để khẳng định chắn dòng vi khuẩn mang đoạn gen mục tiêu (gen ITS-rADN), plasmid từ dòng tế bào chọn tách cắt kiểm tra enzym giới hạn EcoRI Kết phản ứng cắt enzym giới hạn thể hình 3.5, theo đó, plasmid tái tổ hợp tách đoạn ADN có kích thước tương đương kích thước sản phẩm PCR ban đầu (gần 750bp) Như khẳng định biến nạp thành cơng plasmid mang gen ITS-rADN vào dòng tế bào E.coli tương ứng Dòng tế bào E.coli ni cấy nhằm cung cấp nguồn gen ITS-rADN chuẩn bị cho phản ứng xác định trình tự ADN nguồn dự trữ plasmid mang đoạn gen mục tiêu để bảo quản lâu dài 4.2 Về đa dạng di truyền loài Muồng truổng Việt Nam Kết nghiên cứu xác định trình tự nucleotid vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng Kích thước vùng ITS (729-730 bp) tỉ lệ thành phần (G+C) (64,33-64,66%) thu tương tự kích thước tỉ lệ thành phần (G+C) vùng ITS nhiều lồi thực vật hạt kín cơng bố Trong kích thước tỉ lệ thành phần (G+C) mẫu ZA1, ZA2 (64,66%) lớn mẫu ZA3, ZA4, ZA5 (64,33-64,61%) Việc xác định trình tự sử dụng trình tự nucleotid đoạn ITS-rADN để so sánh nhằm tìm mối quan hệ tiến hóa lồi đa dạng di truyền cá thể loài sử dụng phổ biến từ lâu giới Theo nghiên cứu quan hệ tiến hóa mẫu Mimulus guttatus (cây hoa Khỉ) thu hái Mỹ C E Ritland, K Ritland N A Straus thu mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN mẫu Mimulus guttatus dao động từ 99,2-100% [18] Một nghiên cứu khác cho kết mức độ Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi tương đồng 15 mẫu Zanthoxylum schinifolium thu hái từ vùng khác (ecotypes) Hàn Quốc dao động từ 99-100% [37] Trong nghiên cứu này, mẫu Muồng truổng thu hái vùng khác Việt Nam (ZA1-ZA5) có mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 99,3- 99,8%, kết thể gần gũi mặt di truyền mẫu Tiếp tục tiến hành so sánh trình tự vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng ZA1-ZA5 với trình tự vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng thu hái Hàn Quốc (ZAK, mã số ngân hàng gen HM851487) cho thấy gần khơng có nhiều thay đổi, mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN ZAK mẫu ZA1ZA5 dao động từ 99,4-99,8% Như không mẫu Muồng truổng thu hái Việt Nam (ZA1-ZA5) có mức độ tương đồng trình tự ITS-rADN cao mà mẫu ZAK cho kết tương tự Từ kết nghiên cứu giới cho thấy mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN loài khác khác Trong phạm vi loài Muồng truổng dù mẫu nghiên cứu thu hái vùng hay vùng, quốc gia khác mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN cao Qua thấy sử dụng trình tự vùng ITS-rADN khơng phản ánh rõ đa dạng di truyền quần thể Muồng truổng vùng khác Tuy nhiên từ phép so sánh gióng hàng thể hình 3.8 thấy khác nucleotid vùng ITS-rADN mẫu ZA1-ZA5 hầu hết tập trung phía vùng ITS1 Điều gợi ý cho việc tập trung vào nghiên cứu vùng ITS1 ADN ribosom (thay tồn vùng ITS) nghiên cứu tiến hóa, chọn tạo giống, đánh giá đa dạng di truyền quy mơ lớn hơn… lồi Muồng truổng Sử dụng công cụ BLAST với nguồn sở liệu phong phú từ ngân hàng gen giới chúng tơi tiến hành tìm kiếm trình tự nucleotid có mức độ tương đồng cao với trình tự ITS-rADN mẫu ZA1 (đại diện cho mẫu ZA1-ZA5) Kết cho thấy, ngồi trình tự mẫu Muồng truổng Hàn Quốc (ZAK), trình tự có mức độ tương đồng cao trình tự vùng ITS-rADN lồi Zanthoxylum schinifolium (kí hiệu ZSK, mã số Genbank JN226786) Thực so sánh trình tự vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng ZA1-ZA5 với trình tự ITSrADN mẫu ZSK Kết cho thấy mức độ tương đồng di truyền thay đổi đáng kể, dao động từ 96,6-96,9% (Bảng 3.4) Sự thay đổi phản ánh quan hệ tiến hóa chuyển từ quan hệ gần gũi lồi lên quan hệ tiến hóa xa loài chi Đây ví dụ minh chứng cho vai trò trình tự ITS-rADN việc phân loại mối quan hệ tiến hóa bậc phân loại khác Để khai thác phát triển nguồn dược liệu từ Muồng truổng Việt Nam cách có hiệu song song với đánh giá đa dạng di truyền cần tiến hành thực nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học, tách chiết chất có hoạt tính dược học từ Muồng truổng Trên sở kết hợp với kết đa dạng gen vùng ITS chọn tạo giống có suất cao chất lượng tốt nhằm phát triển tiêu chuẩn hóa nguồn dược liệu Muồng truổng tương lai KẾT LUẬN  Đã xác định trình tự nucleotid vùng phiên mã nội ADN ribosom mẫu Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) thu hái vùng khác Việt Nam  Đã so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN mẫu Muồng truổng với nhau, mẫu Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) với trình tự khác chi Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Zanthoxylum công bố ngân hàng gen giới Kết cho thấy mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) tương đối cao, phản ánh đa dạng thấp trình tự gen ADN ITS lồi Muồng truổng Cụ thể sau:  Mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 99,3-99,8% mẫu Muồng truổng thu hái vùng khác Việt Nam  Mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 99,4-99,8% mẫu Muồng truổng thu hái Việt Nam với mẫu Muồng truổng thu hái Hàn Quốc  Mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 96,6-96,9% mẫu Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) với mẫu Zanthoxylum schinifolium thu hái Hàn Quốc ĐỀ XUẤT  Tiếp tục triển khai nghiên cứu tác dụng sinh học kết hợp nghiên cứu hóa học nhằm chọn tạo giống Muồng truổng cho suất cao, chất lượng tốt để phát triển ứng dụng nguồn thảo dược Muồng truổng  Tiếp tục tiến hành nghiên cứu sử dụng marker phân tử vùng ITS1 ADN ribosom để đánh giá đa dạng di truyền lồi Muồng truổng quy mơ lớn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt  Bộ môn Thực vật (2005), Thực vật học, Trường đại học Dược Hà Nội  Võ Văn Chi (1996), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh  Cục quản lý dược (2012), Đề án “Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu giai đoạn từ đến năm 2020 tầm nhìn đến năm 2030”, Bộ Y Tế  Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học Phân tử, NXB Giáo Dục, Hà Nội  Lê Văn Hạc, Trương Thị Thu, Trần Đình Thắng, Nguyễn Xuân Dũng (2005), “Tách xác định cấu trúc số hợp chất từ rễ Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC) Hà Tĩnh”, Hội nghị khoa học cơng nghệ hóa học hữu tồn quốc lần thứ IV  Đặng Ngọc Hoa (2011), Bước đầu nghiên cứu tính đa dạng di truyền quần thể lồi thuốc sa nhân tím (Amomum longiligulare T L Wu) Việt Nam thị RAPDPCR, Đại học KHTN – ĐHQG Hà Nội  Hồng Thị Hòa (2005), Sử dụng số hệ IZOZYM để nghiên cứu đa dạng di truyền số loài dược liệu địa Việt Nam, Đại học KHTN – ĐHQG Hà Nội  Hồng Văn Lâm, Trần Văn Ơn (2008), “Tính đa dạng sinh học chi Gynostemhi ma Blume tỉnh Cao Bằng”, Tạp chí thơng tin Y Dược học, 6/2008, tr 36-40  Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa (2004), Sử dụng thị RAPD ADN lục lạp nghiên cứu quan hệ di truyền số xuất xứ lim xanh (Erythropheleum fordii Oliv.), Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2004, 23/9/2004, tr 464-468  Đỗ Tất Lợi (1995), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội  Nguyễn Hoàn Nghĩa cộng (2007), “ Kết phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) thị phân tử RAPD”, Tạp chí Nơng nghiệp &PTNT, 14/2007, tr 44-48  Lê Duy Thành (2007), Đánh giá tính đa dạng di truyền nhờ thị phân tử RAPD - PCR khả sinh tổng hợp sinensetin lồi thuốc có tiềm xuất Việt Nam Orthosiphon stamineus Benth, Đề tài NCKH QG.04.28, Đại học KHTN-ĐHQG Hà Nội  Khuất Hữu Thanh (2006), Kĩ thuật gen - Nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội Tiếng Anh  Altukhov, Yuri Petrovich (2003), Intraspecific Genetic Diversity, PTC Academkniga, Russia  Alvarez I, Wendel J.F (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29(3), pp 417– 434 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi  Baldwin B.G, Sanderson M.J, Porter J.M, Wojciechowski M.F, Campbell C.S, DonoghueM.J (1995), “The ITS region of nuclear ribosomal DNA: A valuable source of evidence on angiosperm phylogeny”, Ann Missouri Bot Gard, 82(2), pp 247 – 277  Baldwin BG (1992), “Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the compositae”, Mol Phylogenet Evol, 1(1), pp 3-16  C E Ritland, K Ritland and N A Straus (1993), “Variation in the ribosomal internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) among eight taxa of the Mimulus guttatus species complex.”, Mol Biol Evol, 10 (6), pp 1273-1288  Chen S et al (2010), “Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species”, PLos one, 5(1), pp.e8613   Dapeng Bai, J Brandle, R Reeleder (1997), “Genetic diversity in North American ginseng (Panax quinquefolius L.) grown in Ontario detected by RAPD analysis”, Genome , 40(1), pp 111-115  Dung TD, Chang HC, Chen CY, Peng WH, Tsai CH, Tsai FJ, Kuo WW, Chen LM, Huang CY (2011), “Zanthoxylum avicennae extracts induce cell apoptosis through protein phosphatase 2A activation in HA22T human hepatocellular carcinoma cells and block tumor growth in xenografted nude mice”, Int J Mol Med, 28(6), pp 927-36  F.M El-Domyati, Rania A.A Younis, S Edris, A Mansour, J Sabi and A Bahieldin (2011), “Molecular markers associated with genetic diversity of some medicinal plants in Sinai”, Journal of Medicinal Plants Research, 5(10), pp 1918–1929  Ghadaa B, Olfaa S (2008), “Sequence analysis of the internal transcribed spacers (ITSs) region of the nuclear ribosomal DNA (nrDNA) in fig cultivars (Ficus carica L.)”, Scientia Horticulturae, 120(1), pp 34 – 40  Helmut Ripperger, Trinh Thi Thuy, Andrea Porzel, Tran Van Sung and Guenter Adam (1999), Bishordebibyl terpene alkaloids from Zanthoxylum avicennae, Phytochemistry, 50, pp 903  Jin Q, Yi S, Yong HD (2009), “Internal Transcribed Spacer Region of rDNA in Common Wheat and Its Genome Origins”, Acta Agron Sin, 35(6), pp 1021–1029  Kitani Y, Zhu S, Batkhuu J, Sanchir C, Komatsu K (2011), “Genetic diversity of Ephedra plants in mongolia inferred from internal transcribed spacer sequence of nuclear ribosomal DNA”, Biol Pharm Bull, 34(5), pp 717-26  Kornkven AB, Watson LE, Estes JR (1998), “Phylogenetic analysis of Artemisia section Tridentatae (Asteraceae) based on sequences from the internal transcribed spacers (ITS) of nuclear ribosomal DNA”, Am J Bot, 85(12), pp 1787-95   L Oscar Javier Patiño, R Juliet Angélica Prieto and S Luis Enrique Cuca (2012), “Zanthoxylum Genus as Potential Source of Bioactive Compounds”, Bioactive Compounds in Phytomedicine, 10, pp 186-218  Lee S.K (2006), DNA phylogenetic and chemical studies of phyllanthus spp and effects of various components on liver fibrosis model, PhD thesis, City university of Hongkong  Mahmut Caliskan (2012), The Molecular Basis of Plant Genetic Diversity, InTech, Croatia  Maryam Sarwat, S Das, P S Srivastava (2008), “Analysis of genetic diversity through AFLP, SAMPL, ISSR and RAPD markers in Tribulus terrestris, a medicinal herb”, Plant Cell Reports, 27(3), pp 519-528  Masoumi SM, Kahrizi D, Rostami-Ahmadvandi H, Soorni J, Kiani S, Mostafaie A, Yari K (2012), “Genetic diversity study of some medicinal plant accessions belong to Apiaceae family based on seed storage proteins patterns”, Mol Biol Rep, 39(12), pp 10361-5  Poczai P, Hyvönen J (2010), “Nuclear ribosomal spacer regions in plant phylogenetics: problems and prospects”, Mol Biol Rep, 37(4), pp 1897-912  Sambrook J, Fritsch E.F, Maniatis (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press & Cold Spring Harbor  Schlötterer C, Hauser MT, von Haeseler A, Tautz D (1994), “Comparative evolutionary analysis of rDNA ITS regions in Drosophila”, Mol Biol Evol, 11(3), pp 513-22 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi  Shiafa Cheng et al (1990), “ Studies on essential oil from Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC and its antimildew activites”, Zhiwu Xuebao, 32(1), pp 49  Sun Yan-Lin, Park Wan-Geun, Kwon Oh-Woung, Hong Soon-Kwan (2010), “Ribosomal DNA internal transcribed spacer and internal transcribed spacer regions as targets for molecular identification of medically important Zanthoxylum schinifolium”, African Journal of Biotechnology, 9(30), pp 4661-4673   Sun Yan-Lin, Park Wan-Geun, Kwon Oh-Woung, Hong Soon-Kwan (2010), “The internal transcribed spacer rDNA specific markers for identification of Zanthoxylum piperitum”, African Journal Of Biotechnology, 9(37), pp 6027-6039  Wang Y, Li DH, Zhang YT (2007), “Analysis of ITS sequences of some medicinal plants and their related species in Salvia”, Acta pharmaceutica Sinica, 42(12), pp 1309-13  Wen L, Zimmer E.A (1996), “Inference from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA”, Mol Phylogen Evol, 6, pp 166 – 177  Wenshu and Zonghong zhu (1992), “Study on the chemical constituents of Leidang (from Zanthoxylum avicennae) “, Zhongcaoyao, 23(3), pp.115  Yan-Lin S, Wan-Geun P, Oh-Woung K, Soon-Kwan H (2010), “The internal transcribed spacer rDNA specific markers for identification of Zanthoxylum piperitum “, African Journal of Biotechnology, 9(37), pp 6027- 6039  Zhang DS, Zhong QX, Song XM, Liu WJ, Wang J, Zhang QY (2012), “Study on the chemical components, antimicrobial and antitumor activities of the essential oil from the leaves of Zanthoxylum avicennae”, Journal of Chinese medicinal materials, 35(8), pp.1263-7  Zindand A, Sonnance G (2003), “ITS sequence analysis and phylogenetic inference in the genus Lens Mill”, Annal of Botany, 91, pp.49-54 ... định trình tự vùng ITS1 để đánh giá đa dạng di truyền chi Ephedra xác định nguốn gốc lai loài phân loại lồi Ephedra tìm thấy [26]  Một nghiên cứu khác sử dụng trình tự vùng ITS để đánh giá đa dạng. .. giải trình tự vùng ITS- rADN mẫu Muồng truổng 33 3.6.Kết so sánh trình tự nucleotid vùng ITS- rADN 35 3.6.1.Kết so sánh trình tự nucleotid vùng ITS- rADN mẫu Muồng. .. cứu đa dạng di truyền thuốc giới Việt Nam  Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền thuốc giới Nghiên cứu đa dạng di truyền thuốc giới thực từ trước xuất thị phân tử ADN Khi sở để đánh giá đa dạng