PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHÁNG SINH ĐỒ CÁC VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS COAGULASE ÂM TỪ MẪU BỆNH PHẨM CỦA PHÒNG VI KHUẨN HÔ HẤP VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2009

DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc của kháng sinh thuộc nhóm penicillin 17 Hình 2.3: Cấu trúc chung của kháng sinh nhóm aminoglycoside 20Hình 2.4: Cấu trúc của các kháng sinh n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHÁNG SINH ĐỒ CÁC

VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS COAGULASE ÂM

TỪ MẪU BỆNH PHẨM CỦA PHÒNG VI KHUẨN HÔ HẤP

VIỆN PASTEUR TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2009

Họ và tên sinh viên: TRƯƠNG THỊ LỆ TRÂM

Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2006 - 2010

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHÁNG SINH ĐỒ CÁC VI KHUẨN

STAPHYLOCOCCUS COAGULASE ÂM TỪ MẪU BỆNH PHẨM CỦA

PHÒNG VI KHUẨN HÔ HẤP VIỆN PASTEUR TP HỒ CHÍ MINH

NĂM 2009

Tác giả

Trương Thị Lệ Trâm

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành

Bảo Quản Chế Biến Nông Sản và Vi Sinh Thực Phẩm

Giáo viên hướng dẫn

BS NGUYỄN THỊ KIM HOÀNG THS UÔNG NGUYỄN ĐỨC NINH

Tháng 8 năm 2010

Xin khắc ghi công ơn ba mẹ - người đã sinh thành, dưỡng dục, dìu dắt tôi những bước đi đầu đời, tạo cho tôi hành trang vững chắc bước vào cuộc sống

Cuối cùng xin dành cho các bạn bè tôi, những người đã gần gũi, chia sẻ, giúp

đỡ, và đồng hành với tôi trong suốt quãng đời Đại học

Xin chân thành cảm ơn

Trương Thị Lệ Trâm

TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập và khảo sát kháng sinh đồ các vi khuẩn Staphylococcus

coagulase âm từ cấy máu dương tính của labo vi khuẩn hô hấp, Viện Pasteur Tp

Hồ Chí Minh năm 2009” được tiến hành tại phòng vi khuẩn hô hấp, Khoa Vi sinh

miễn dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh từ ngày 15/3 đến ngày 15/6 năm

2010 Đề tài được thực hiện với mục đích định danh các chủng Staphylococcus

coagulase âm được phân lập từ cấy máu dương tính, đồng thời khảo sát mức độ kháng kháng sinh của chủng này để phân tích dịch tễ học kháng thuốc của chủng

Staphylococcus coagulase âm ở các tỉnh thành phía Nam

Qua quá trình phân lập và thử sinh hóa trên 74 chủng vi khuẩn từ cấy máu dương tính của các bệnh nhân bị viêm màng não và viêm phổi nặng ở bệnh viện Cù

Lao Minh, Bến Tre, kết quả phân lập được 39 chủng Staphylococcus coagulase âm Tỉ

lệ Staphylococcus coagulase âm chiếm 62,9% trong tổng sổ 62 vi khuẩn Gram dương

phân lập được

Đề tài đã sử dụng phương pháp Kirby Bauer để khảo sát sự nhạy cảm của

Staphylococcus coagulase âm với các kháng sinh amikacin, oxacillin,

amoxicillin/clavulanic, azithromycin, chloramphenicol, cefoperazone, clindamycin, doxycycline, cefepime, gentamicin, ofloxacin, teicoplanin, vancomycin Nghiên cứu

độ nhạy cảm với kháng sinh của 39 chủng Staphylococcus coagulase âm phân lập

được, kết quả cho thấy: 97,44% số chủng nhạy cảm với vancomycin, 94,87% nhạy cảm với teicoplanin; 92,31% nhạy cảm với amikacin và 79,49% nhạy cảm với gentamicin, doxycycline là 76,92 % và 58,97%, 53,85% lần lượt là số chủng nhạy cảm với ofloxacin và cefoperazone Nhìn chung tỉ lệ nhạy cảm trung gian thấp, cao nhất là cefoperazone với tỉ lệ 28,20%, tiếp đó là doxycycline và ofloxacin cùng với tỉ lệ

10,26% Một số kháng sinh có tỷ lệ chủng Staphylococcus coagulase âm kháng cao:

oxacillin: 100% và azithromycin: 76,92%

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách các chữ viết tắt vii

2.1 Tổng quan về Staphylococcus coagulase âm (SCA) 13

2.1.1 Phân loại, phân bố và hình thái của SCA 13

2.1.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 14

2.3.2.7 Nhóm kháng sinh lincosamide 23

2.3.2.9 Nhóm kháng sinh sulfonamide và diaminopyrimidine 24

2.4.3 Phương pháp định lượng 31

2.5 Một số nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực đề tài 32

2.5.1 Trong nước 32

2.5.2 Ngoài nước 32

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 34

3.2 Nội dung nghiên cứu 34

3.4.1 Kiểm tra chất lượng 36

3.4.1.1 Kiểm tra chủng vi khuẩn chuẩn 36

3.4.1.2 Kiểm tra chất lượng đĩa kháng sinh 36

3.4.1.3 Kiểm tra chất lượng môi trường nuôi cấy 37

3.4.2 Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn 38

4.1 Kết quả kiểm tra môi trường 46

4.3 Kết quả khảo sát mức độ kháng kháng sinh của SCA với các kháng sinh thử

nghiệm 47

5.1 Kết luận 58 5.2 Đề nghị 58

BA Blood Agar: thạch máu

BHI Brain Heart Infusion Broth

C chloramphenicol

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

MBC Minimal Bacteriocidal Concentration

MHA Mueller Hinton Agar

MIC Minimal Inhibitory Concentration

MRSA Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus

NNIS National Nosocomial Infections Surveillance

OX oxacillin

PBP Penicillin binding protein

Pr Productivity ratio

SCA Staphylococcus coagulase âm

TEC teicoplanin

TSA Tryptone Soy Agar

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cấu trúc của kháng sinh thuộc nhóm penicillin 17

Hình 2.3: Cấu trúc chung của kháng sinh nhóm aminoglycoside 20Hình 2.4: Cấu trúc của các kháng sinh nhóm glycopeptide 21Hình 2.5: Cấu trúc chung của kháng sinh nhóm tetracyclin 21

Hình 2.7: Cấu trúc các kháng sinh nhóm macrolide 23Hình 2.8: Cấu trúc kháng sinh nhóm lincosamide 23Hình 2.9: Cấu trúc của kháng sinh nhóm fluoroquinolone 24Hình 2.10: Cấu trúc hóa học của diaminopyrimidine 24

Hình 3.3: Kết quả phản ứng coagulase âm và dương 42Hình 3.4: Thao tác ép và trải vi khuẩn với tăm bông 43Hình 3.5: Các điểm đặt kháng sinh trên đĩa thạch 44Hình 3.6: Đặt kháng sinh trên đĩa thạch 44Hình 4.1: Đĩa kháng sinh sau khi ủ 24 giờ 48Hình 4.2: Đo kích thước vòng vô khuẩn 48Hình 4.3: Tính nhạy cảm của SCA đối với từng loại kháng sinh 50Hình 4.4: Tính nhạy cảm trung gian của SCA đối với từng loại kháng sinh 53Hình 4.5: Tính đề kháng của SCA đối với từng loại kháng sinh 54

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Các vi khuẩn SCA được phân lập trên người 15

Bảng 3.1: 13 loại kháng sinh sử dụng trong thí nghiệm 35

Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra chất lượng môi trường ở nồng độ pha loãng 10-6 46

Bảng 4.2: Kết quả kháng sinh đồ của chủng S aureus ATCC 25923 47

Bảng 4.3: Kết quả kháng sinh đồ của 39 chủng SCA 49

Bảng 4.4: Tỉ lệ nhạy cảm với kháng sinh của SCA ở các vùng trên thế giới (1998 –

1999) 52

Bảng 4.5: Tỉ lệ kháng kháng sinh của SCA ở các vùng trên thế giới (1998 – 1999) 56

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Tụ cầu khuẩn Staphylococcus là hệ vi khuẩn sống cộng sinh trên da và niêm

mạc của người, động vật và trong thực phẩm Tụ cầu khuẩn được chia làm hai nhóm chính là tụ cầu có men coagulase và tụ cầu không có men coagulase Trong khi,

Staphylococcus aureus - tụ cầu có men coagulase - từ lâu đã được biết đến là nguyên

nhân gây bệnh cho người và động vật cũng như gây ngộ độc thực phẩm, thì tụ cầu

không có men coagulase – Staphylococcus coagulalse âm (SCA) - chiếm phần lớn trong các loài Staphylococcus được xem là hiếm khi gây bệnh Tuy nhiên, những

nghiên cứu trong một vài thập niên gần đây đã cho thấy các SCA có khả năng gây bệnh khá cao Số liệu của hệ thống theo dõi nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia Hoa Kỳ gọi tắt là NNIS cho thấy rằng từ năm 1980 - 1989, tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do SCA tăng từ 9 - 27% và trở thành nguyên nhân phổ biến nhất gây ra các bệnh nhiễm trùng Hơn nữa, trong cùng thời gian này tỷ lệ SCA kháng methicillin, oxacillin, hoặc nafcillin tăng 20 - 60% và hầu hết các SCA kháng methicillin đều đa đề kháng kháng sinh Sử dụng kháng sinh là một biện pháp chính khi bị nhiễm khuẩn, tuy nhiên tỉ lệ kháng thuốc của vi khuẩn SCA ngày càng tăng và có nhiều thay đổi là một nguyên nhân khiến việc sử dụng thuốc kháng sinh còn nhiều lo ngại và chưa hiệu quả Để có

cơ sở lựa chọn kháng sinh và đề ra chiến lược sử dụng kháng sinh hợp lý, hạn chế sự

kháng thuốc chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Phân lập và khảo sát kháng sinh

đồ các vi khuẩn Staphylococcus coagulase âm từ mẫu bệnh phẩm của phòng vi

khuẩn hô hấp, viện Pasteur tp Hồ Chí Minh năm 2009” dưới sự hướng dẫn của Bs

Nguyễn Thị Kim Hoàng và Ths Uông Nguyễn Đức Ninh Kết quả những nghiên cứu này góp phần phân tích dịch tễ học kháng thuốc của SCA và đem lại hiệu quả điều trị cao cho bệnh nhân

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về Staphylococcus coagulase âm (SCA)

2.1.1 Phân loại, phân bố và hình thái của SCA

 Phân loại: SCA thuộc [28]:

- Loài: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus,…

 Phân bố: SCA có ở khắp nơi, trong không khí, trong đất, nước và là thành phần

hệ vi khuẩn sống trên da và màng nhầy của con người Ngoài ra, người ta còn tìm thấy

chúng trong xác động vật cũng như trong thực phẩm [6]

 Hình thái: SCA là những vi khuẩn hình cầu, bắt màu Gram dương, không di động, sắp xếp theo mọi hướng và thường xếp thành từng đám giống chùm nho, không hình thành bào tử [3] Khuẩn lạc vi khuẩn SCA sinh ra trên môi trường nuôi cấy thạch máu (BA), sau 18 – 24 h, ở 35 – 37 oC có dạng tròn, hơi vun, bờ rõ, đường kính 0,5 –

2 mm, bóng láng, óng ánh, màu trắng vì do vi khuẩn không có enzyme coagulase nên trên BA (có bổ sung 5 % máu cừu) khuẩn lạc có màu trắng hoặc có thể hơi vàng trông giống như màu bơ Ngoài thể điển hình là thể S (Smooth: trơn nhẵn), SCA còn có dạng khuẩn lạc thể R (Rough: xù xì) [31] Vi khuẩn thường không gây tan huyết trên

BA (ngoại trừ một số vi khuẩn SCA như Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus hominis và Staphylococcus schleiferi) vì không

có yếu tố gây tan máu hemolysine [10], [46]

2.1.2 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Các vi khuẩn SCA có nhu cầu về không khí khác nhau, đa số SCA phát triển tốt

trong điều kiện hiếu khí Như Staphylococcus hominis hầu như chỉ mọc hiếu khí, Staphylococcus saccharolyticus chỉ mọc trong điều kiện kỵ khí, còn Staphylococcus hemolyticus và Staphylococcus capitis mọc được cả hiếu khí và kỵ khí [10] Nhiệt độ

thích hợp cho sự phát triển là 30 – 37 oC, pH thích hợp 7 – 7,5

2.1.3 Đặc điểm sinh hóa

Vi khuẩn SCA lên men đa số các loại đường glucose, fructose, maltose, treholose, saccharose nhưng không sinh hơi Vi khuẩn này lên men rất ít các đường

xylitol, melibiose, raffinose, xylose và methy – αD - glucopyranoside Các phản ứng

sinh hóa khác như khử nitrat thành nitrit, khử (-COOH) của arginine và khử ure thành ammonia [11]

2.1.4 Sức đề kháng

Một số vi khuẩn SCA có sức đề kháng cao với sự khô hạn và nồng độ muối

cao (như Staphylococcus epidermidis) Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được

men penicillinase (β - lactamase) Men này phá hủy vòng β - lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, ampicilline và ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng Ngoài ra, SCA cũng là loại vi khuẩn thường đa đề kháng với kháng sinh do đó gây khó khăn cho việc điều trị [12], [60]

Dựa vào sự nhạy cảm với kháng sinh novobiocin mà SCA được phân vào hai nhóm được thể hiện ở bảng 2.1, và trên cơ sở đó ta có thể định danh SCA [47]

Bảng 2.1: Các vi khuẩn SCA được phân lập trên người [47]

Nhạy cảm với novobiocin Kháng novobiocin

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus haemolyticus

Staphylococcus hominis subsp hominis

Staphylococcus capitis subsp urealyticus

Staphylococcus schleiferi subsp schleiferi

Staphylococcus schleiferi subsp urealyticus

2.2 Khả năng và cơ chế gây bệnh của SCA

2.2.1 Khả năng gây bệnh

SCA bao gồm 41 loại và phân loại [53], [54] trong đó chỉ có 21 loại là tác nhân

gây bệnh cho con người [54] chủ yếu là Staphylococcus epidermidis SCA là nguyên

nhân gây ra 31,9% số ca nhiễm trùng máu ở bệnh viện [48]

Các nhiễm trùng do SCA:

- Nhiễm trùng do các vật thể, dụng cụ đưa vào cơ thể, khớp giả, van tim giả,…

- Viêm nội nhãn sau khi phẩu thuật mắt

- Viêm xương, tủy xương

- Viêm nội tâm mạc

- Nhiễm trùng tiểu

- Nhiễm trùng ở người suy giảm miễn dịch

Khả năng gây bệnh của một số vi khuẩn SCA:

- Staphylococcus epidermidis: là tác nhân gây nhiễm trùng ở những bệnh nhân

có dụng cụ đưa vào mạch máu, khớp, van tim, can thiệp thông dịch não tủy, hoặc viêm phúc mạc, suy giảm miễn dịch [52]

- Staphylococcus saprophyticus: gây nhiễm trùng tiểu thường gặp ở phụ nữ trẻ

và không có tiền căn nằm viện, chiếm tỉ lệ 5 – 10% nhiễm trùng tiểu Vi khuẩn có khuynh hướng kết dính lên các tế bào biểu mô tiết niệu

- Các chủng SCA khác: khả năng gây bệnh cơ hội còn đang bàn cãi Để khẳng định là tác nhân gây nhiễm trùng cần phải phân lập được chủng lặp đi lặp lại qua nhiều lần lấy bệnh phẩm nuôi cấy và vắng mặt một số tác nhân vi khuẩn có khả năng gây bệnh khác [10]

2.2.2 Cơ chế gây bệnh [6]

Cơ chế gây bệnh của SCA rất phức tạp và chưa rõ ràng

- Các vi khuẩn SCA có khả năng tạo nên một lớp màng nhầy Dưới lớp màng nhầy nầy, vi khuẩn phát triển tạo thành các khuẩn lạc nhỏ bám vào các catheter bằng chất dẻo Lớp nhầy này cũng bảo vệ vi khuẩn không bị tấn công bởi các tế bào có thẩm quyền miễn dịch của cơ thể và không bị tác động bởi kháng sinh

- Vi khuẩn nhân lên trong các tế bào bạch cầu và phá hủy tế bào bạch cầu; đồng thời có nhiều cơ chế thêm vào gồm sinh protein A, chống hiện tượng đại thực bào, α hemolysin và phản ứng quá mẫn muộn đối với protein góp phần gây hoại tử vùng viêm, cơ chế miễn dịch dịch thể Cơ chế sinh bệnh bị ảnh hưởng bỡi nhiều yếu tố, trong đó các toxin, các enzyme hoạt động sinh học và miễn dịch, kháng nguyên và phản ứng miễn dịch có vai trò khác nhau trong các trường hợp khác nhau

2.3 Tổng quan về kháng sinh

2.3.1 Khái niệm

Chất kháng sinh được hiểu là các chất hoá học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ vi sinh vật), với đặc tính là ngay ở nồng độ thấp (hoặc rất thấp) đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo an toàn cho người hay động vật được điều trị [7]

Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường được biểu thị bằng một trong các đơn vị là : mg/ml, g/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml (hay UI/g)

Lúc đầu, các kháng sinh đều được chiết từ môi trường nuôi cấy nấm mốc hoặc

của kháng sinh để thu được kháng sinh mới Hiện nay, kháng sinh được xem như là những hợp chất hóa học có tác dụng ức chế vi khuẩn hoặc diệt khuẩn với cơ chế tác động ở mức phân tử, chúng có tác dụng ở liều lượng thấp và sử dụng để điều trị bệnh nhiễm trùng

Các kháng sinh có tác dụng đặc hiệu đối với một loại vi khuẩn hoặc một nhóm

vi khuẩn nhất định Các kháng sinh có hoạt tính khác nhau, có loại có phổ kháng khuẩn rộng, có loại có phổ kháng khuẩn hẹp [39]

2.3.2 Phân loại kháng sinh

Tùy theo công dụng, cấu trúc hóa học, … mà có những cách phân loại khác nhau Dưới đây là các phân loại theo cấu trúc hóa học:

2.3.2.1 Nhóm kháng sinh beta – lactam [2]

Các thuốc này trong công thức hóa học có chứa vòng β - lactam bao gồm các penicillin và các cephalosporin

 Các penicillin

Các penicillin có nhân chung là acid 6 amino - penicillanic hợp bởi một vòng thiazolidin và một vòng β - lactam

Hình 2.1: Cấu trúc của kháng sinh thuộc nhóm penicillin [61]

Các penicillin dùng trong điều trị thuộc 3 nhóm chính :

- Các penicillin có hoạt tính cao đối với vi khuẩn Gram dương, bị phá hủy bởi enzyme penicillinase: penicillin G, penicillin V (phenoxy methylpenicillin), benzathin penicillin

- Các penicillin có hoạt tính đối với vi khuẩn Gram dương, đề kháng đối với enzyme penicillinase: methicillin, nafcillin, oxacillin, dicloxacillin

- Các penicillin có hoạt tính rộng đối với cả vi khuẩn Gram duơng và vi khuẩn Gram âm, bị phá hủy bởi enzyme penicillinase Các penicillin nhóm này bao gồm:

+ Các aminopenicillin: ampicillin, amoxicillin, becampicillin, metampicillin

+ Các carboxy penicillin: carbenicillin, ticarcillin

+ Các ureidopenicillin: azlocillin, mezlocillin, piperacillin

Ngoài 3 nhóm chính trên hiện nay người ta còn có các penicillin phối hợp trong

đó người ta kết hợp các penicillin khác nhau với những chất ức chế enzyme β lactamase dùng để điều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn đề kháng sản xuất enzyme β lactamase Hai chất ức chế enzyme này được dùng để phối hợp với các penicillin là acid clavulanic và sulbactam, các thuốc của sự kết hợp này như: timentin (gồm ticarcillin và acid lavulanic), augmentin (gồm amoxicillin và acid clavulanic), unasyn (gồm ampicillin và sulbactam)

Cơ chế tác động: các penicillin ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn bằng cách can thiệp vào enzyme transpeptidase có vai trò trong sự tạo thành các liên kết của chuỗi peptidoglycan Các enzyme này liên kết với một nhóm protein gọi là PBP (penicillin binding protein) nằm ở bên ngoài màng nguyên sinh chất Như vậy, điểm tác động của các kháng sinh nhóm beta – lactam chính là PBP Mức độ mẫn cảm của

vi khuẩn với một kháng sinh trong nhóm này tùy thuộc vào mức độ gắn kết với PBP, khả năng xâm nhập vào tế bào (pH môi trường hơi acid làm gia tăng khả năng này) và khả năng kháng được các enzyme β – lactamase Vi khuẩn Gram âm ít mẫn cảm với penicillin hơn vi khuẩn Gram dương [33]

Các penicillin khác nhau tác động lên các enzyme khác nhau của quá trình tổng hợp thành tế bào Đó là lí do mà một số penicillin có tác động kháng khuẩn đến một nhóm vi khuẩn trong khi một số penicillin khác không hoặc ít có khả năng này

 Các cephalosporin

Các cephalosporin có một nhân chung là acid faminocephalo - sporanic hình thành bởi một vòng β lactam kết hợp với một vòng dihydrotiazin, thay thế hydro của nhóm amin bằng các gốc R khác nhau thu được các cephalosporin bán tổng hợp Các cephaloporin có hoạt tính với cả vi khuẩn Gram dương và với cả vi khuẩn Gram âm

Hình 2.2: Cấu trúc chung của cephalosporin [62]

Dựa vào tính kháng khuẩn các cephalosporin được chia các thế hệ:

- Các cephalosporin thế hệ thứ nhất: bao gồm cephalothin, cephazolin, cephalein, cefaclor Các kháng sinh này có hoạt tính đối với tụ cầu, liên cầu nhóm A,

phế cầu, Escherichia coli, Klebsiella, Proteus

- Cephalosporin thế hệ thứ hai: các kháng sinh nhóm này có hoạt tính tốt hơn

các thuốc cephalosporin thế hệ thứ nhất chống lại Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, … Các kháng sinh nhóm cephalosporin gồm:

cefamandol, cefuroxime, cefonicid, cefoxitin,

- Cephalosporin thế hệ thứ ba: có phổ tác dụng kháng khuẩn bao trùm toàn bộ

vi khuẩn đường tiêu hóa, tuy nhiên có tác dụng kém với vi khuẩn Gram dương, kháng

sinh nhóm này có thể chia 2 nhóm: nhóm có tác dụng chống Pseudononas aeruginosa

gồm ceftazidime và cefoperazone, và các nhóm không có tác dụng chống

Pseudomonas aeruginosa bao gồm cefotaxim, ceftazidime, ceftizoxime, moxalactam

Nhiều kháng sinh nhóm này thấm vào màng não tốt nên được dùng để điều trị viêm màng não do vi khuẩn Gram âm

- Cephalosporin thế hệ thứ tư: bao gồm cefepime và cefpirom hoạt phổ rộng Cefepime tác dụng trên vi khuẩn ái khí Gram (+) và (-), cầu khuẩn Gram (+), tụ cầu

khuẩn (nhưng không tác dụng với S aureus đã kháng methicillin), liên cầu khuẩn Enterococcus kể cả chủng tiết ra β – lactamase Kháng sinh này dùng cho các bệnh

nhiễm khuẩn tiết niệu, hô hấp, ngoài da Cefpirom bền vững với β - lactamase, tác dụng mạnh hơn với tụ cầu khuẩn Dùng cho các bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu, hô hấp, ngoài da và nhiễm trùng máu Cephalosporin thế hệ 4 có tác dụng mạnh hơn và an toàn hơn penicilin rất nhiều, nhưng chỉ dùng khi nhóm 3 mất hiệu lực Thuốc thường dùng là cefepime

Cephalosporin có cơ chế tác động tương tự penicillin Do có cấu trúc vòng β – lactam, một số cephalosporin có thể bị vô hoạt bởi nhóm enzyme β – lactamase Ngoài

ra, kháng sinh nhóm này còn có thể bị vô hoạt bởi các cephalosporinase – enzyme không tác động đến penicillin

2.3.2.2 Nhóm kháng sinh aminoglycoside [2]

Đây là họ kháng sinh thường sử dụng trong lâm sàng bao gồm streptomycin, neomycin, gentamycin, tobramycin, amikacin, kanamycin Các kháng sinh nhóm này

có tác dụng diệt khuẩn bao gồm cả vi khuẩn Gram dương và nhiều vi khuẩn Gram âm

Aminoglycoside có cấu trúc vòng aminocyclitol nối với một hay nhiều phân tử đường

amin

Hình 2.3: Cấu trúc chung của kháng sinh nhóm aminoglycoside [63]

Cơ chế tác động: aminoglycoside có tác động sát khuẩn nhanh và phụ thuộc vào

nồng độ Aminoglycoside trước hết xâm nhập mô bào Tiến trình này là quá trình vận

chuyển tích cực cần năng lượng và oxy Sau khi vào trong tế bào, aminoglycoside gắn

kết chủ yếu với tiểu thể 30S của ribosome, chúng có thể gây ngừng tiến trình tổng hợp

protein hoặc gây nên việc đọc sai mã di truyền và tạo những protein không hoàn chỉnh

hoặc protein không có chức năng [49]

2.3.2.3 Nhóm kháng sinh glycopeptide [2]

Đây là nhóm kháng sinh có nhiều kháng sinh có vai trò quan trọng, là kháng

sinh dự phòng của nhân y như vancomycin, teicoplanin Là nhóm kháng sinh có tác

dụng diệt khuẩn bằng cách ức chế quá trình sinh tổng hợp vỏ tế bào vi khuẩn, ở giai

đoạn sớm hơn so với các kháng sinh nhóm β - lactam Ngoài ra, một số kháng sinh của

nhóm này như vancomycin còn tác động đến tính thấm màng tế bào và quá trình tổng

hợp RNA của vi khuẩn

có tác dụng tĩnh khuẩn với vi khuẩn Gram dương và Gram âm, các tetracyclin có hiệu quả với Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma pneumoniae và Leptospira

Các tetracyclin có tác động tĩnh khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn Sau khi khuếch tán qua màng ngoài vi khuẩn, một hệ thống vận chuyển tích cực sẽ đưa thuốc vào trong nguyên sinh chất Tại đây, các tetracyclin gắn kết với tiểu đơn vị 30S của ribosome, sau đó chúng cản trở RNA vận chuyển mang aminoacyl gắn với điểm tiếp nhận trên phức hợp ribosome – RNA thông tin Đây là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram dương và âm

Hình 2.5: Cấu trúc chung của kháng sinh nhóm tetracyclin [64]

2.3.2.5 Nhóm kháng sinh phenicol [2]

Thiaphenicol và florfenicol là dẫn xuất tổng hợp của chloramphenicol, một kháng sinh quan trọng trong nhóm phenicol Nhận biết kháng sinh nhóm này qua tiếp

vị ngữ phenicol trong tên hoạt chất của chúng

Chloramphenicol có 3 nhóm chức quan trọng liên quan đến đặc tính sinh học của chúng Nhóm para – nitrophenicol, nhóm dichloro acetyl, nhóm alcoholic ở carbon thứ 3 của chuỗi propanediol

Hình 2.6: Cấu trúc của chloramphenicol [65]

Phenicol có tác dụng tĩnh khuẩn do ức chế tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn Chúng gắn kết với tiểu đơn vị 50S của ribosome tế bào vi khuẩn và cản trở tiến trình hình thành các chuỗi peptide do phong bế tác động của enzyme peptidyltransferase Kháng sinh nhóm này có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram dương và Gram âm

Hình 2.8: Cấu trúc kháng sinh nhóm lincosamide [67]

2.3.2.8 Nhóm kháng sinh fluoroquinolone [2]

Hợp chất quinolone tổng hợp đầu tiên là acid nalidixic chủ yếu dùng để điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu Các quinolone có nhân quinolem, nhóm ceton ở vị trí

para so với phân tử nitrogen nội vòng, nhóm – COOH ở vị trí C3 Các cacboxy - fluoroquinolon là các dẫn chất từ acid nalidixic, các thuốc này có tác dụng diệt khuẩn đối nhiều vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm kể cả tụ cầu đề kháng với

methicillin và Pseudomonas aeruginosa, chúng còn có tác dụng chống Mycoplasma và Chlamydia Một số fluoroquinolone thường dùng hiện nay gồm ciprofloxacin,

enoxacin, norfloxacin, pefloxacin

Hình 2.9: Cấu trúc của kháng sinh nhóm fluoroquinolone [68]

2.3.2.9 Nhóm kháng sinh sulfonamide và diaminopyrimidine [2]

Sulfonamide là chất kháng chuyển hóa, chúng chỉ tác động đến những vi khuẩn

tự tổng hợp acid folic Kháng sinh nhóm này gây nên sự thay thế sai lầm trong quá trình biến dưỡng của vi khuẩn, từ đó tác động ức chế vi khuẩn sinh sôi Hoạt tính của các sulfonamide khác nhau, chúng thường có phổ kháng khuẩn rộng, tác động lên vi khuẩn Gram dương và Gram âm

Nhóm diaminopyrimicine can thiệp đến sự tổng hợp tetrahydrofolic acid từ dihydrofolate bằng cách gắn với enzyme dihydrofolate reductase Từ đây ngăn cản vi khuẩn tổng hợp purine và DNA Tác động của kháng sinh nhóm này chỉ là tĩnh khuẩn khi dùng một mình Chúng có phổ kháng khuẩn rộng chống vi khuẩn Gram dương và Gram âm hiếu khí Kháng sinh nhóm diaminopyrimicine có tác động sát khuẩn khi kết

hợp với kháng sinh nhóm sulfonamide

Hình 2.10: Cấu trúc hóa học của diaminopyrimidine [62]

2.3.3 Cơ chế tác động của kháng sinh [4]

Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh (hay các đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó; trong đó, những kiểu tác động thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein, rối loạn quá trình tái bản ADN, hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển hóa trao đổi chất,…

2.3.3.1 Ức chế tổng hợp vách tế bào

Loại bỏ vách hoặc ngăn cản sự tạo thành vách đều làm tan tế bào vi khuẩn Vách tế bào vi khuẩn chứa mucopeptit còn gọi là murein hay peptidoglycan Các penicilline và cephalosporin tác động lên các phân tử protein chọn lọc đặc hiệu nên ức chế sự liên kết ngang cuối cùng của cấu trúc mucopeptit của vách tế bào, vi khuẩn dễ dàng tiêu diệt Các kháng sinh khác như bacitracin, vancomycin, novobiocin, D-cycloserin cũng ức chế sự tạo vách của vi khuẩn bằng ức chế sự hình thành mucopeptit của vách

2.3.3.2 Ức chế chức năng của màng nguyên tương

Màng nguyên tương hoạt động như một màng bán thấm Màng này thẩm thấu các chất chọn lọc và nhờ vậy kiểm soát được các thành phần bên trong của các tế bào Nếu sự toàn vẹn của màng nguyên tương bị phá vỡ thì các thành phần nội bào thoát ra khỏi tế bào và tế bào chết Màng tế bào của một số vi khuẩn và nấm dễ bị phá vỡ bởi một số thuốc kháng sinh hơn tế bào động vật do hoạt tính tác dụng chọn lọc của các kháng sinh này lên các nhóm cấu trúc hóa học đặc biệt có ở màng của vi khuẩn hoặc của nấm mà không có ở tế bào động vật

2.3.3.3 Ức chế tổng hợp protein

Nhiều thuốc kháng sinh ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn:

 Chloramphenicol và các dẫn chất thuộc nhóm này ngăn cản sự kết hợp acid amin vào chuỗi peptit mới sinh ở đơn vị 50S của ribosome của vi khuẩn thông qua việc cản trở tác động của enzyme peptidyl – transferase

 Các tetracyclin: tetracyclin và các thuốc kháng sinh nhóm này ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách ngăn cản sự gắn liền của amino acyl - RNA vận chuyển vào đơn vị 30S của ribosome

 Các macrolide và lincomycin: Các kháng sinh nhóm này ngăn cản sự tổng hợp protein bằng cạnh tranh vị trí kết hợp của acid amin ở ribosome và bằng cách phong bế phản ứng dây chuyền aminoacyl

 Các aminoglycoside: các thuốc kháng sinh nhóm aminoglycoside ức chế tổng hợp protein bằng cách gắn vào protein tiếp nhận trên đơn vị 30S của ribosome dẫn đến đọc sai thông tin của RNA thông tin, làm hình thành các protein không có hoạt tính, ngoài ra còn làm tách các ribosome ở trạng thái polymer thành monomer

2.3.3.4 Tác dụng ức chế sự hình thành acid nucleic

 Các sulfonamid và trimethoprim: Đối với nhiều vi sinh vật, acid para aminobenzoic (viết tắt là PABA) là một chất chuyển hóa cần thiết trong quá trình tổng hợp acid folic cần thiết để tổng hợp purin và DNA Sulfonamid do có cấu trúc tương tự như PABA nên có thể đi vào phản ứng thay cho PABA, hậu quả là một chất tương tự như acid folic nhưng không có hoạt tính được tạo thành và ngăn cản sự phát triển của

-vi khuẩn Trimethoprim ức chế enzyme dihydro folic reductase, enzyme này biến đổi acid dihydro folic thành acid tetrahydro folic, một giai đoạn trong chuỗi phản ứng tổng hợp purin và DNA Sự phối hợp một trong các sulfonamid với trimethoprim, hai chất tác động ở hai khâu khác nhau của một quá trình tổng hợp làm tăng hoạt tính của thuốc, cotrimoxazol (sulfamethoxazol và trimethoprim) là chế phẩm phối hợp sử dụng hiệu quả trong điều trị các bệnh nhiễm trùng cũng dựa vào cơ chế tác động như ở trên

 Rifampin: Rifampin và các dẫn chất kết hợp với RNA polymerase phụ thuộc DNA và như thế ức chế sự tổng hợp RNA ở vi khuẩn

 Các quinolone: Các quinolon và cacboxy fluoroquinolon kết hợp vào DNA gyrase nên ức chế tổng hợp DNA

2.3.4 Sự đề kháng kháng sinh [36]

Hiện tượng kháng thuốc: Hiện tượng mầm bệnh vẫn còn sống sót sau khi đã điều trị kháng sinh được gọi là hiện tượng kháng thuốc (trên phương diện kiểm nghiệm, vi sinh vật gây bệnh được coi là kháng thuốc nếu nồng độ MIC của chất

kháng sinh kiểm nghiệm in vitro trên đối tượng này cao hơn nồng độ điều trị tối đa cho phép đối với bệnh nhân

Có hai dạng kháng thuốc:

- Khả năng đề kháng sinh học: Khả năng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh

có thể được hình thành ngẫu nhiên trong quần thể, nghĩa là khả năng này đã được hình thành ở mầm bệnh ngay khi chúng chưa tiếp xúc với môi trường chứa chất kháng sinh Dạng kháng thuốc này được gọi là khả năng đề kháng sinh học Nguyên nhân của hiện tượng này có thể do đột biến ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể làm trong quần thể vi sinh vật gây bệnh xuất hiện các tế bào (hay thậm chí chỉ cần một vài tế bào) có khả năng kháng thuốc Do đó, khi bệnh nhân được điều trị kháng sinh trong một thời gian nhất định thì chỉ có các tế bào thường bị tiêu diệt, còn các tế bào kháng thuốc này vẫn còn sống sót, tiếp tục sinh trưởng phát triển dần bù đắp cho cả số tế bào đã bị tiêu diệt Kết quả làm thay đổi hoàn toàn bản chất vi sinh của bệnh và vô hiệu hóa tác dụng điều trị của thuốc kháng sinh đó

- Khả năng đề kháng điều trị: Khả năng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh thường xuất hiện phổ biến hơn nhiều sau khi chúng đã tiếp xúc với kháng sinh, vì vậy trường hợp này còn được gọi là khả năng đề kháng điều trị Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong tế bào vi sinh vật có chứa các yếu tố kháng thuốc R tiềm ẩn (Resistance Factor) Yếu tố kháng thuốc R có bản chất plasmid Khi vi sinh vật sống trong môi trường có kháng sinh, các plasmid kháng thuốc của chúng sẽ được hoạt hoá, tự sao chép tổng hợp ra vô số plasmid mới Chính hoạt tính của các plasmid này

sẽ làm tăng sức đề kháng cho tế bào chủ, nhờ vậy chúng vẫn có thể tồn tại và phát triển trong môi trường có kháng sinh Do có bản chất plasmid nên các yếu tố kháng thuốc R này rất dễ dàng vận chuyển qua lại giữa các loài gần gũi nhau qua biến nạp, tải nạp hay tiếp hợp

Nguyên nhân hiện tượng kháng thuốc [2]:

- Việc sử dụng cùng loại kháng sinh kéo dài hoặc lạm dụng thuốc kháng sinh (tùy tiện sử dụng thuốc không đúng liều lượng, không đúng chỉ định và không đủ thời gian cần thiết) đã vô tình tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh cho các chủng vi sinh vật

có khả năng kháng thuốc, đồng thời trở thành liệu pháp kích thích các chủng kháng thuốc này tổng hợp ra vô số plasmid mới

- Xu thế sử dụng tuỳ tiện chất kháng sinh trong chăn nuôi, đặc biệt là bổ sung vào khi chế biến thức ăn gia súc, gia cầm nuôi lấy thịt, trứng, sữa, Khi đó, ngoài các tác dụng có lợi dự kiến, chính chất kháng sinh bổ sung sẽ tạo ra môi trường phát triển chọn lọc cho các chủng mang yếu tố kháng thuốc R trên động vật nuôi Khi sử dụng thịt, trứng, sữa, của chúng làm nguyên liệu chế biến, các chủng kháng thuốc này sẽ kéo theo vào trong các sản phẩm thực phẩm Kết quả là khi người tiêu dùng sử dụng các thực phẩm này, một mặt họ phải tiếp nhận phần dư lượng kháng sinh trong sản phẩm; nhưng mặt khác, nguy hiểm hơn là các loại vi sinh vật kháng thuốc trong các sản phẩm thực phẩm thuộc nhóm này có ưu thế tồn tại, phát triển cao hơn và các plasmid kháng thuốc của chúng lại đang ở trong trạng thái hoạt hóa

Cơ chế của sự kháng thuốc: Cơ chế của sự kháng thuốc rất đa dạng và thường

khác nhau đối với từng chủng vi sinh vật:

- Một số loài vi sinh vật có khả năng kháng thuốc tự nhiên với một số kháng sinh nhất định, do thuốc này không tác động lên chúng (thí dụ như: nấm, virus, nguyên sinh động vật, do trên thành tế bào không có lớp peptidoglucan nên không chịu tác động của các kháng sinh β – lactam)

- Một số chủng vốn nhạy cảm với chất kháng sinh trở nên kháng thuốc khi chúng thu nhận được một trong các đặc tính mới như:

+ Có khả năng vô hoạt hay phá hủy chất kháng sinh (bằng cách tổng hợp ra các enzym ngoại bào làm phá vỡ cấu trúc của chất kháng sinh hay liên kết với chất kháng sinh để tạo ra dạng kém hiệu lực kháng sinh hơn) hoặc tạo ra enzyme thay thế cho enzyme mà kháng sinh tác động vào

+ Có thể tự điều chỉnh khả năng hấp thụ của màng tế bào chất làm giảm hoặc ngăn ngừa chất kháng sinh xâm nhập vào tế bào chất

+ Có khả năng làm biến đổi cấu trúc phân tử của nơi hoặc vị trí mà chất kháng sinh tác dụng vào

+ Có khả năng đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào giảm

+ Tự điều chỉnh thay đổi đường hướng trao đổi chất để vô hiệu hóa tác dụng của chất kháng sinh đó, …

Dường như chúng ta không thể hoàn toàn loại bỏ được hiện tượng đề kháng với kháng sinh một khi chúng đã xuất hiện Ngoài sự linh hoạt do đặc tính sinh học, vi khuẩn còn có khả năng bảo tồn sự đề kháng ở gen khi kháng thuốc nằm trên nhiễm sắc thể của nó Ngược lại, khi yếu tố di truyền liên quan đến đề kháng nằm trên plasmid tiếp hợp, vi khuẩn sẽ có khả năng truyền sự đề kháng này cho vi khuẩn khác kia cùng loài hay khác loài Từ đó, sự kháng kháng sinh tăng dần lên trong quần thể vi khuẩn [31]

Hiện tượng kháng chéo: Bên cạnh hai hiện tượng kháng thuốc nêu trên, trong thực tiễn còn tồn tại hiện tượng kháng chéo (hay kháng nhóm), nghĩa là một chủng khi

đã kháng lại chất kháng sinh nhất định thì chúng cũng có khả năng kháng luôn một số chất kháng sinh khác cùng nhóm cấu trúc hay có các đặc tính tương đồng với chất kháng sinh ấy, thí dụ như một số chủng vi sinh vật gây bệnh đã kháng được penicillin thì cũng có trường hợp kháng luôn nhiều kháng sinh  - lactam khác

Khắc phục hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh: giải pháp trực

quan và đơn giản là sử dụng các dạng kháng sinh mới Tuy nhiên, việc tìm kiếm, phát hiện và sản xuất một kháng sinh mới là cả một khối lượng công việc khổng lồ, tiêu tốn rất nhiều thời gian, nhân lực và tiền bạc

Trước hết cần triệt để tôn trọng ba nguyên tắc sử dụng thuốc kháng sinh là:

- Chỉ định điều trị kháng sinh đúng (làm kháng sinh đồ để chọn đúng kháng sinh thích hợp để chỉ định điều trị; dùng thuốc đúng liều, đúng phác đồ, đủ thời gian điều trị; chú ý phát hiện sớm dấu hiệu kháng thuốc) [4];

- Không lạm dụng kháng sinh khi chưa cần thiết (không lạm dụng "điều trị phòng ngừa" bằng thuốc kháng sinh, nghiêm cấm bệnh nhân tự chỉ định điều trị thuốc kháng sinh thay bác sĩ);

- Nghiêm cấm sử dụng tràn lan chất kháng sinh trong chăn nuôi và giám sát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh trong thú y

Ngoài ra cần phải thông tin về lượng kháng sinh sử dụng, số liệu về nhạy cảm kháng sinh, tần suất về đề kháng của vi khuẩn phải được công bố và cập nhập trên các phương tiện thông tin chuyên ngành [2]

2.4 Kháng sinh đồ

2.4.1 Định nghĩa

Kháng sinh đồ là kỹ thuật xác định độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn, giúp thầy thuốc chọn được kháng sinh và liều lượng thích hợp dùng trong điều trị Có hai kỹ thuật kháng sinh đồ là: kỹ thuật kháng sinh khuếch tán (khuếch tán trên đĩa thạch) và kháng sinh pha loãng trong môi trường [2]

2.4.2 Phương pháp định tính khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh

Có một vài phương pháp trong phòng thí nghiệm đo lường sự mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh, tuy nhiên phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch được sử dụng nhiều nhất Đây cũng là phương pháp được đề nghị bởi Clinical and Laboratory Standards Intitute (CLSI) [56]

2.4.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng

Phương pháp khuếch tán kháng sinh trên đĩa thạch yêu cầu phải trải đều vi khuẩn kiểm tra trên bề mặt đĩa thạch và đặt các đĩa kháng sinh với nồng độ qui định lên mặt thạch trước khi đem ủ đĩa Nếu vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh thì một vòng vô khuẩn sẽ xuất hiện xung quanh đĩa giấy sau khi ủ ấm Một trong những lý do cho việc tiêu chuẩn hóa chặt chẽ các bước tiến hành phản ứng là do có rất nhiều yếu tố

có thể ảnh hưởng lớn đến kích thước của vòng vô khuẩn Các yếu tố đó bao gồm:

 Đọc sai khi đo đường kính vòng vô khuẩn,

 Ngoại nhiễm, hay có những thay đổi khác trong chủng vi khuẩn kiểm tra,

 Mật độ nuôi cấy: quá dày hoặc thưa quá yếu,

 Không tuân theo độ đục chuẩn,

 Nhiệt độ, khí trường ủ không đúng Đĩa thạch không nên ủ trong điều kiện gia tăng CO2 vì điều đó sẽ làm thay đổi có ý nghĩa vòng vô khuẩn của một số kháng sinh [56],

 Kháng sinh: nồng độ kháng sinh trong từng đĩa kháng sinh, tốc độ khuếch tán kháng sinh,

 Môi trường thử: thành phần nồng độ các chất, độ pH, độ dày thạch trong đĩa petri

 Thời gian trước ủ: thời gian cho kháng sinh khuếch tán trong thạch trước khi vi khuẩn kịp phát triển không đúng,

 Thời gian ủ: Thời gian từ khi đặt trong tủ ấm đến khi lấy ra đọc kết quả (quá ngắn hoặc quá dài) [6]

2.4.2.2 Chọn lựa đĩa kháng sinh [26]

Việc lựa chọn các đĩa kháng sinh thông thường dựa vào các nghiên cứu đi trước Trong thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn theo đề nghị của CLSI

Kháng sinh sử dụng cho vi khuẩn SCA: amikacin, amoxicillin – clavulanic acid, azithromycin, cefepime, cefoperazone, chloramphenicol, clindamycin, doxycycline, gentamicin, ofloxacin, oxacillin, teicoplanin, vancomycin

2.4.3 Phương pháp định lượng

Có thể xác định tính nhạy cảm với kháng sinh bằng cách dựa vào nồng độ ức chế tối thiểu MIC (minimal inhibitory concentration) để biết vi khuẩn đó có nhạy cảm hay đề kháng với kháng sinh Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ thấp nhất của kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn có thể nhìn thấy sau 18 – 24 giờ được nuôi cấy Đối chiếu MIC với nồng độ huyết tương của kháng sinh: vi khuẩn nhạy cảm huyết tương của kháng sinh, có thể gặp 3 trường hợp:

 Nếu MIC < nồng độ huyết tương của kháng sinh: vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh Trong thực tế, một vi sinh vật được cho là nhạy cảm với kháng sinh khi MIC ≤ ¼ nồng độ huyết tương an toàn của kháng sinh đó

 Nếu MIC > nồng độ huyết an toàn: vi khuẩn đề kháng với kháng sinh

 Nếu MIC ở khoảng giữa hai trường hợp trên: vi khuẩn nhạy cảm trung gian với kháng sinh Nghĩa là vi khuẩn không bị tiêu diệt nếu dùng liều điều trị thông thường, nhưng nếu dùng liều cao bằng đường toàn thân hoặc bất cứ đường nào miễn là kháng sinh tập trung vào ổ nhiễm khuẩn (chẳng hạn đào thải qua nước tiểu thì trị được nhiễm khuẩn đường tiểu) thì kháng sinh có tác dụng trên vi khuẩn

Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC (minimal bacteriocidal concentration) là nồng độ thấp nhất làm giảm 99,9% số lượng vi khuẩn Sự xác định MBC chỉ được thực hiện khi biết rất chính xác một kháng sinh có thể diệt được một vi khuẩn chuyên biệt đã được cô lập như trị viêm màng tim do vi khuẩn Thường MBC = 2 – 8 lần MIC Đối với các kháng sinh có MBC gần với MIC và dễ dàng đạt nồng độ bằng

MBC trong huyết tương, đó là các kháng sinh diệt khuẩn như penicillin, cephalosporin, aminoglycoside, polymycin Trái lại, các kháng sinh có MBC < MIC và khó đạt được nồng độ bằng MBC trong huyết tương, đó là các kháng sinh kiềm khuẩn như tetracycline, chloramphenicol, macrolide [8]

2.5 Một số nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực đề tài

2.5.1 Trong nước

- Nguyễn Thanh Liêm và Lâm Thị Mỹ (2005) nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng, huyết học, tại bệnh viện Nhi Đồng I từ tháng 1/1999 đến tháng 1/2004 Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn gây nhiễm trùng máu chủ yếu là do vi khuẩn Gram âm

chiếm 61,3 %, vi khuẩn Gram dương chiếm tỉ lệ nhỏ hơn nhưng cao nhất là SCA

(97,3%) Tỉ lệ kháng kháng sinh của các loại vi khuẩn khác nhau tuy nhiên hầu hết đều rất cao, nhất là với ampicillin, kế đến là các loại cephalosporin, gentamycin, [13]

-Lâm Huyền Trân và Võ Hiếu Bình (2009) nghiên cứu sự hiện của vi khuẩn ái khí trong khe mũi giữa ở người khỏe mạnh và sự nhạy cảm với kháng sinh của vi

khuẩn phân lập được Nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn được phân lập nhiều nhất là S aureus (33,33%), kế đến là SCA (29,16%), vi khuẩn Gram âm cũng được phân lập

chiếm 21,86% trường hợp Các vi khuẩn Gram dương có tỉ lệ nhạy cảm kháng sinh cao Đáng chú ý là các vi khuẩn SCA có tỉ lệ nhạy cảm với kháng sinh gentamicin, ciprofloxacin và levofloxacin khá cao lần lượt là 64,28%, 78,57% và 92,75% [17]

2.5.2 Ngoài nước

- SCA là nguyên nhân gây bệnh ngày càng tăng tại bệnh viện đặc biệt là nhiễm trùng bệnh viện Nghiên cứu của Shailen (1991) cho thấy SCA là nguyên nhân gây nhiễm trùng máu tăng từ 9 – 27% và trở thành nguyên nhân phổ biến nhất gây nhiễm trùng Hơn nữa, nghiên cứu cũng cho thấy trong cùng một thời điểm tỉ lệ SCA gây nhiễm trùng bệnh viện kháng methicillin, oxacillin, nafcillin tăng từ 20 – 60% Hầu hết các SCA kháng methicillin kháng nhiều kháng sinh khác [57]

- 137 chủng SCA phân lập từ các mẫu máu ở Đan Mạch trong 4 tháng đã được Charlotte và ctv (1996) nghiên cứu và kết luận rằng các chủng đó kháng aminoglycoside với các tỉ lệ là 5%, 46%, 57% và 63% tương ứng với các kháng sinh trong nhóm aminoglycoside là netilmicin, amikacin, gentamicin và tobramycin,

- Từ năm 1981 – 1999, Kristensen (1998) đã nghiên cứu về sự đề kháng của vi khuẩn của một vùng ở Bắc Jutland, Đan Mạch Nghiên cứu đã nghi nhận có 14% SCA kháng với penicillin, 38% SCA kháng methicillin và 26% kháng gentamicin Nghiên cứu cũng đã khẳng định có đến 20% SCA đa đề kháng với kháng sinh [44]

- Để xác định sự phân bố và kháng kháng sinh của các mầm bệnh vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, dữ liệu khảo sát về tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện từ năm

1981 - 1999 tại Bệnh viện Đại học Quốc gia Đài Loan đã được Po-Ren Hsueh và ctv (2002) phân tích Kết quả là có 35.580 mầm bệnh vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện được định danh trong đó nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm trùng bệnh viện vẫn là

Candida, S aureus, và Pseudomonas aeruginosa đáng chú ý là các vi khuẩn loài SCA

– tác nhân mà ít khi được chú ý đến, với tỉ lệ phân lập được tăng từ 2,8 – 5,1% và tỉ lệ kháng kháng sinh methicillin tăng từ 72,2 – 90,6% (từ năm 1981 – 1999) [55]

- Nghiên cứu của Edmond và ctv (1999) về bệnh nhiễm trùng máu tại 49 bệnh

viện trong 3 năm đã phát hiện hơn 10.000 trường hợp nhiễm Trong đó SCA là tác nhân gây bệnh chủ yếu nhất với tỷ lệ phân lập chiếm 32% so với các vi khuẩn phân lập được Điều đáng lo ngại là có đến 80% SCA kháng với kháng sinh methicillin [32]

- Nghiên cứu của Von Eiff C và ctv (2001) về vai trò của SCA trong nhiễm trùng bệnh viện Nghiên cứu cho thấy S epidermidis và các SCA khác nhạy cảm với

novobiocin là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện đặc biệt ở những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch [59]

- Arjun Srinivasanj và ctv (2002) đã nghiên cứu về đặc tính kháng thuốc của S

aureus và SCA đối với vancomycin, họ đã kết luận rằng đặc tính kháng thuốc của các

vi khuẩn này đối vancomycin là không tăng nhiều kể từ khi có những nghiên cứu đầu tiên về đặc tính kháng thuốc của các loài này [22]

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 15/03/2010 đến ngày 15/06/2010

Đề tài được thực hiện tại phòng Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn dịch, viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Nội dung nghiên cứu

Tiến hành phân lập và định danh các vi khuẩn SCA

Thực hiện phản ứng kháng sinh đồ để khảo sát sự nhạy cảm của vi khuẩn SCA đối với một số loại kháng sinh

3.3 Vật liệu

3.3.1 Đối tượng khảo sát

74 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân viêm phổi nặng và viêm màng não tại bệnh viện Cù Lao Minh trong năm 2009

 Thước đo chiều dài có đơn vị là mm

 Tăm bông vô trùng

 Kẹp gắp bằng inox

 Pipet pasteur, pipetman

 Đèn cồn, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy vòng

 Bảng tiêu chuẩn quốc tế về tiêu chuẩn kích thước vòng ức chế vi khuẩn của các

3.3.3 Môi trường, hóa chất (của hãng Bio - Rad)

 Môi trường thạch Mueller Hinton (MHA) để thực hiện kháng sinh đồ

 Thạch dinh dưỡng Nutrient Agar (NA) để nuôi cấy vi khuẩn

 Thạch BA: là môi trường dinh dưỡng cao để nuôi cấy, phân lập liên cầu, tụ cầu

khuẩn, Moraxella và một số trực khuẩn Gram âm

 Môi trường Brain heart infusion (BHI broth): môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi khuẩn

 Môi trường Lactose broth (LB): môi trường dinh dưỡng để giữ giống

 Môi trường Tryptone Soy Agar (TSA): môi trường không chọn lọc để kiểm tra chất lượng môi trường

Bảng 3.1: 13 loại kháng sinh sử dụng trong thí nghiệm

Loại kháng sinh Nồng độ (µg) Loại kháng sinh Nồng độ (µg)

Amoxicillin – clavulanic

Gentamicin (GM)

10

Cefoperazone (CFP) 75 Teicoplanin (TEC) 30

Chloramphenicol (C) 30 Vancomycin (VA) 30

3.4 Phương pháp tiến hành

3.4.1 Kiểm tra chất lượng

3.4.1.1 Kiểm tra chủng vi khuẩn chuẩn

Chủng vi khuẩn chuẩn của ATCC (American Type Culture Collection) được giữ trong 0,5 ml môi trường LB + 20% glycerol, được bảo quản tủ giữ giống ở -70 oC Chủng chuẩn này được định kỳ cấy truyền 3 tháng 1 lần Khi thực hiện phản ứng, chủng chuẩn ATCC sẽ được cấy sang một đĩa thạch để lấy những khuẩn lạc rời [56] Các chủng chuẩn này dùng để kiểm tra chất lượng môi trường, đĩa kháng sinh, các

phản ứng sinh hóa,…

3.4.1.2 Kiểm tra chất lượng đĩa kháng sinh

Mục đích: Kiểm tra chất lượng các đĩa kháng sinh dùng cho việc khảo sát tính nhạy

cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp khuếch tán đĩa kháng sinh trên thạch (phương pháp Kirby - Bauer)

Nguyên tắc: các đĩa kháng sinh lúc mới nhận về và trong quá trình sử dụng phải kiểm

tra chất lượng

Quy trình:

● Chuẩn bị chủng chuẩn và môi trường thử kháng sinh MHA

- Chủng S aureus ATCC 25923 được nuôi cấy trên môi trường NA, ủ 16- 18 giờ ở 35

± 20C Lấy trực tiếp các khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn này, trong ống nghiệm chứa nước muối sinh lý tạo độ đục Mc Farland 0,5 tương đương 108 CFU/ml

- Môi trường MHA thường và môi trường MHA có bổ sung 2% NaCl để thử kháng sinh oxacillin, methicillin và nafcillin

- Các đĩa kháng sinh được lấy ra đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng, trước khi sử dụng khoảng 30 phút

● Thao tác thực hiện:

- Dùng que tăm bông vô trùng trải huyền dịch vi khuẩn vào các đĩa thạch MHA

- Đặt các đĩa kháng sinh vào hộp thạch đã trải vi khuẩn Đối với đĩa kháng sinh oxacillin phải đặt vào thạch MHA có bổ sung 2% NaCl

- Ủ các đĩa này vào tủ ấm ở 35 ± 20C/ 16 - 18 giờ Đối với các hộp thạch có đĩa kháng sinh oxacillin, vancomycin phải ủ trong 24 giờ và nhiệt độ không vượt quá 350C

● Đọc kết quả

- Dùng thước đo đường kính vòng tròn ức chế của vi khuẩn trên thạch

- Đối chiếu tiêu chuẩn của CLSI được thể hiện ở phụ lục 8, nếu kết quả thử nghiệm kháng sinh nằm trong giới hạn của CLSI khuyến cáo, thì coi như kháng sinh đó đạt chất lượng

3.4.1.3 Kiểm tra chất lượng môi trường nuôi cấy

Mục đích: Kiểm tra chất lượng môi trường nuôi cấy, bao gồm: sự vô khuẩn và khả

năng tăng trưởng của vi sinh vật với môi trường đó Trước khi những môi trường này được đưa vào sử dụng cho việc định danh, phân lập và nuôi cấy vi khuẩn

- Sự nhiễm khuẩn trong quá trình pha chế (kiểm tra vô khuẩn)

- Khả năng phát triển của vi sinh vật trên từng loại môi trường (kiểm tra chất

lượng môi trường)

● Kiểm tra vô khuẩn

Đặt môi trường cần kiểm tra vào tủ an toàn sinh học (ủ ở điều kiện thường) Sau 18 - 24 giờ, đem ra kiểm tra, loại những ống, đĩa nào có khuẩn lạc mọc trên bề mặt

● Kiểm tra chất lượng môi trường

Các bước thực hiện:

- Chuẩn bị các đĩa môi trường cần kiểm tra và các đĩa môi trường tham chiếu (TSA)

- Chủng chuẩn tăng sinh qua đêm bằng môi trường BHI broth Vi khuẩn dùng

để kiểm tra môi trường NA, MHA và BA là S aureus ATCC 25923