KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CARBAPENEM Ở KLEBSIELLA PNEUMONIAE TRONG NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NGUYỄN TRI PHƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CARBAPENEM Ở KLEBSIELLA P

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH

CARBAPENEM Ở KLEBSIELLA PNEUMONIAE

TRONG NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NGUYỄN TRI PHƯƠNG

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN XUÂN TRUNG Niên khóa : 2006 – 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH

CARBAPENEM Ở KLEBSIELLA PNEUMONIAE

TRONG NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NGUYỄN TRI PHƯƠNG

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

Tháng 07/2010

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Trần Nhật Phương, người thầy đã dẫn dạy tận tình, giúp đỡ tạo mọi điều kiện cho tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Công ty Nam Khoa Biotek đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực tập tại quý công ty, đặt biệt là sự quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện của TS.BS Phạm Hùng Vân, ThS Phạm Thái Bình

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Ngân, chị Thủy và các anh chị tại công ty Nam Khoa Biotek đã chỉ dẫn, giúp đỡ nhiệt tình khi tôi thực tập tại đây

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập trong suốt thời gian tôi học tập tại trường

Tôi xin cảm ơn thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, người đã trực tiếp chỉ dạy những kiến thức quý báu nhất

Và con xin gửi đến cha mẹ kính yêu cùng các anh chị trong gia đình lòng cảm

ơn và yêu mến nhất, gia đình đã luôn bên con trong mỗi bước con đi trong cuộc sống

Cuối cùng tôi cũng xin cảm ơn các bạn tập thể lớp DH06SH đã quan tâm, động viên và gắn bó với tôi trong bốn năm đại học

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7/2010

TÓM TẮT

Nhiễm khuẩn bệnh viện gây ra những thiệt hại to lớn về kinh tế và cả con

người, tác nhân chính là nhóm trực khuẩn Gram (-), đặc biệt là K pneumoniae kháng

thuốc kháng sinh trong điều trị là rất phổ biến cơ chế quan trọng ở nhóm vi khuẩn này

là tiết ESBL(Expanded Spectrum β – lactamase) đề kháng với kháng sinh

β – lactamas Kháng sinh carbapenem được chỉ định điều trị trực khuẩn gram âm tiết

ESBL mang lại hiệu quả cao do quá trình chọn lọc tự nhiên đã làm xuất hiện các

chủng kháng Đề tài: “khảo sát tình hình đề kháng thuốc kháng sinh carbapenm trên

K pneumoniae trong nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương” nhằm

nghiên cứu vấn đề này và đưa ra khuyến cáo hỗ trợ điều trị

Thực hiện kháng sinh đồ phát hiện K pneumoniae tiết ESBL bằng phương pháp

đĩa đôi và đĩa kết hợp, thực hiện kháng sinh đồ bằng phương pháp đĩa khuếch tán với

kháng sinh carbapenem Từ những chủng ESBL (+) xác định nồng độ ức chế tối thiểu

MIC nhằm đánh giá mức độ nhạy cảm của K pneumoniae với kháng sinh carbapenem

và phát hiện sự tiết enzyme tạo tính kháng với kháng sinh carbapenem, enzyme KPC

(Klebsiella pneumoniae carbapenemase), bằng kỹ thuật Etest

Kết quả xác định K pneumoniae vẫn còn rất nhạy cảm với kháng sinh

imipenem và meropenem của nhóm carbapenem, chưa có chủng K pneumoniae tiết

enzyme KPC Nên ưu tiên chọn meropenem trong điều trị khi phát hiện tác nhân

nhiễm trùng là K pneumoniae tiết ESBL tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương

SUMMARY

Surveillance Antibiotic resistance to carbapenem of K pneumoniae in

mosocomial infections at Nguyen Tri Phuong hospital Nosocomial infections is great damage both economic and human factors, the

main cause is the bacteria gram-negative rods, especially K pneumoniae, the antibiotic

resistance in treatment is a common, important mechanism ESBL - producing (Expanded Spectrum β - lactamase) resistance to antibiotics β – lactamas Carbapenems antibiotics are used therapeutics to bacteria gram - negative rods ESBL - producing efficiency because the natural selection is appearing resistant strains The aim of this study is studied this issue to give a primary recommendations in treatment

The study selected K pneumoniae ESBL – producing by using double disk and

combined disk methods, the antibiotic susceptibility tested by disk diffusion method and of minimum inhibitory concentration MIC by Etest method to test carbapenems

resistance of K pneumoniae

The results show that K pneumoniae remained susceptibility to imipenem and meropenem of group carbapenems, K pneumoniae did not producted KPC The study

recommended that it should be use a meropenem priority in the treatment of infectious

agents a K pneumoiae ESBL – prodcing at Nguyen Tri Phuong Hospital

Key words: Nosocomial infections, K pneumoniae, imipenem, meropenem,

carbapenem, KPC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ac Amoxcillin/Clavulanic acid

ASTS Antibiotic Susceptibility Test Surveillance Susceptible

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institutte

MRSA Methicillin - Resistant Staphylococcus aureus

NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện

KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase

R Resistant

SMART Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends

WHO World Health Organization

Zc Ceftazidime/Clavulanic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả kháng sinh đồ với K pneumoniae 31

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cấu trúc phân tử kháng sinh imipenem và meropenem 7

Hình 3.1 Vị trí đặt các đĩa giấy kháng sinh trong thí nghiệm 23

Hình 4.1 Chủng K pneumoniae 536 trên môi trường MC 26

Hình 4.2 Chủng 2231 trên môi trường MC 27

Hình 4.3Chủng 2231 nhuộm gram 27

Hình 4.4 Kết quả định danh IDS 14 GNR® chủng 2231 28

Hình 4.5 Kháng sinh đồ phát hiện ESBL (+) chỉ một trong hai phương pháp 29

Hình 4.6 Kháng sinh đồ phát hiện ESBL (+) cả hai phương pháp 30

Hình 4.7 Giá trị MIC của K pneumoniae với imipenem và meropenm 34

Hình 4.8 Kết quả Etest hai chủng gia tăng MIC với imipenem 35

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

MỤC LỤC vi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Kháng sinh 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Sự đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn 4

1.1.4 Nhóm kháng sinh carbapenem 5

2.2 Nhiễm khuẩn bệnh viện 8

2.2.1 Nhiễm khuẩn bệnh viện là gì 8

2.2.2 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện 9

2.2.3 Tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện 9

2.2.4 Vi khuẩn tiết ESBL 10

2.3 Vi khuẩn K pneumoniae và sự đề kháng kháng sinh 11

2.3.1 Đặc điểm vi sinh vật 11

2.3.2 Sự đề kháng thuốc kháng sinh của K pneumoniae 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 15

3.2 Vật Liệu 15

3.3 Phương Pháp 16

3.3.1 Phương pháp xử lý mẫu 16

3.3.1.1 Phương pháp cấy chuyền mẫu 16

3.3.1.2 Phương pháp định danh K pneumoniae 17

3.3.2 Phương pháp kháng sinh đồ 19

3.3.2.1 Phương pháp kháng sinh đồ bằng đĩa khuếch tán 20

3.3.2.2 Phương pháp kháng sinh đồ bằng xác định MIC 23

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả xử lý mẫu 26

4.2 Kết quả kháng sinh đồ 29

4.2.1 Kết quả kháng sinh đồ bằng phương pháp đặt đĩa khuếch tán 29

4.2.2 Kết quả phương pháp Etest 34

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 

trực khuẩn gram âm gây NKBV, đặt biệt trên K pneumoniae và E coli, làm cho

NKBV trở nên nguy hiểm và khó điều trị

Nhóm kháng sinh carbapenem cho kết quả điều trị rất tốt đối với các vi khuẩn tiết ESBL, thế nhưng những báo cáo gần đây cho thấy một nhóm trực khuẩn Gram âm,

chủ yếu là K pneumoniae và E coli nổi lên đề kháng với kháng sinh nhóm carbapenem Cơ chế của sự đề kháng này là enzyeme KPC (Klebsiella pneumoniae

carbapenemase) có khả năng thủy phân carbapenem do gene đột biến blaKPC nằm trên plasmid quy định

Vi khuẩn tiết KPC được báo cáo đầu tiên ở Mỹ và đã tạo thành những ổ dịch và gây tỷ lệ tử vong cao với những bệnh nhân NKBV và những báo cáo gần đây cho thấy

sự lan rộng vi khuẩn tiết KPC trên nhiều nước trên thế giới và gây ra nhiều khó khăn trong ngăn chặn và điều trị NKBV

Nhằm đánh giá tình hình đề kháng với kháng sinh carbapenem và tiết KPC của

trực khuẩn K pneumoniae trong NKBV đề tài: “Khảo sát tình hình kháng thuốc kháng sinh carbapenem trên K pneumoniae trong nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện

Nguyễn Tri Phương” được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS Trần Nhật Phương

1.2 Yêu cầu đề tài

Đánh giá tình hình kháng thuốc kháng sinh carbapenem trên K pneumoniae gây

NKBV trong phạm vi bệnh viện Nguyễn Tri Phương

1.3 Nội dung thực hiện

• Thực hiện kháng sinh đồ đánh giá khả năng sinh ESBL và đề kháng với

carbapenem của K pneumoniae bằng phương pháp đặt đĩa khuếch tán

• Đánh giá mức độ đề kháng với kháng sinh carbapenem của K pneumoniae

dựa trên giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC bằng phương pháp Etest

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Kháng sinh

1.1.1 Định nghĩa

“Kháng sinh (antibiotica, chemotherapeutica) là những chất ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách đặc hiệu (mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn) bằng cách gây rối loạn phản ứng sinh vật ở tầm phân tử” (Lê Huy Chính, 2001)

Kháng sinh tác dụng lên vi khuẩn theo nhiều cơ chế khác nhau bao gồm:

• Ức chế sinh tổng hợp vách của vi khuẩn

• Ức chế sinh tổng hợp protein

• Ức chế quá sinh tổng hợp acid nucleic

• Gây rối loạn chức năng màng tương

• Tác dụng chống chuyển hóa hay đối kháng cạnh tranh

ƒ Phenoxypennicillin: Penicillin V (uống)

ƒ Penicillin kháng penicillinase (chống tụ cầu khuẩn): Oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin, methicillin, nafcillin

ƒ Aminpenicillin: Ampicillin, amoxixillin, bacampicillin, metapicillin

ƒ Carboxypennicillin: Carbenicillin, ticarcillin

ƒ Carbapenem: Imipenem, Meropenem, Ertapenem, Doripenem, Panipenem/betamipron, Biapenem

• Nhóm phenicol: Chloramphenicol, thianphenycol

• Nhóm lincosamide: Lincomycin, clindamycin

• Nhóm macrolide: Erythromycin, oleandomycin, spiramycin, josamycin, azithromycin, roxithromycin, clarithromycin

• Nhóm tetracycline: Tetracycline, oxytetracycline, methacycline, doxycline, minocycline

• Nhóm kháng sinh chống nấm: Nystatin, amphotericin B, griseofulvin, flucytosine, ketoconazole, miconazole, fluconazole, clotrimazole,…

• Các nhóm khác

o Các quinolone

ƒ Kinh điển: Flumequi, các acid nalidixic, oxolinic, pipemidic

ƒ Quinolone thế hệ thứ 2 (fluoroquinolone): Nofloxacin, ofloxacin, enoxcin, ciprofloxacin, rosoxacin…

o Các Nitroimidazole: Mitronidazole, ornidazole, tinidazole, secnidazole…

o Các dẫn xuất của sulfanilamide (sulfamide, sulfonamide): Sulfafurazol, sulfadiazine, sulfadimethoxin, sulfadoxine, sulfaguanidin

o Các glycopeptides: Vancomycin, teicoplanin

1.1.3 Sự đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn

Kể từ khi con người phát hiện và đưa kháng sinh vào điều trị chống lại các tác nhân vi khuẩn gây bệnh thì sau đó rất nhiều loại kháng sinh được phát hiện, sản xuất

và đưa vào điều trị Nhưng cùng với việc sử dụng thuốc kháng sinh là sự liên tục đề kháng của vi khuẩn với thuốc kháng sinh, đòi hỏi những kháng sinh mới thay thế hiệu quả hơn và sử dụng kháng sinh điều trị hợp lý hơn

Các tác nhân vi khuẩn kháng đề với kháng sinh do hai cơ chế chủ yếu là đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được Vi khuẩn đề kháng tự nhiên với kháng sinh là do bản thân kháng sinh đã không có khả năng tác động lên vi khuẩn, ví dụ như các vi

khuẩn không có vách như Mycoplasma sẽ không chịu tác dụng của kháng sinh ức chế

sinh tổng hợp vách như β - lactams Đề kháng thu được là vi khuẩn có các cơ chế để chống lại với tác động của kháng sinh, do gene có sẵn hay đột biến gene trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid quy định, cơ chế đề kháng thu được bao gồm vi khuẩn tiết ra men phá huỷ kháng sinh, biến đổi cấu trúc đích đối với kháng sinh, thay đổi tính thấm với kháng sinh, sản xuất nhiều chất cạnh tranh với kháng sinh, thay đổi biến dưỡng làm kháng sinh mất hoạt tính (Lê Huy Chính, 2001)

Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý rất nguy hiểm với những tác động:

• Quá mẫn, sốc phản vệ, dị ứng,… của người sử dụng

• Thay đổi vi khuẩn thường trú gây bội nhiễm vi khuẩn kháng thuốc

• Che lấp trình trạng nhiễm khuẩn nặng mà không loại bỏ được vi khuẩn nên quá trình nhiễm khuẩn vẫn tiếp tục

• Tác động trực tiếp do độc tính của thuốc nhất là thuốc được sử dụng một thời gian dài

• Phát triển vi khuẩn kháng thuốc do loại bỏ vi khuẩn nhạy cảm

Vì vậy kháng sinh cần phải được sử dụng một cách hợp lý, khoa học tránh gây hại đến người bệnh và gia tăng sự kháng thuốc của vi khuẩn (Nguyễn Thanh Bảo, 2009)

Sự đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh hiện nay rất phức tạp làm cho bệnh tật càng nguy hiểm khó điều trị hơn và luôn đòi hỏi chúng ta có những giải pháp đối phó bao gồm sử dụng kháng sinh khoa học, hợp lý và sử dụng các kháng sinh thế hệ mới

1.1.4 Nhóm kháng sinh carbapenem

Kháng sinh carbapenem là lớp kháng sinh thế hệ mới thuộc nhóm β - lactams

có phổ kháng khuẩn rộng, có cấu trúc giúp chống lại sự phân hủy của β - lactamases,

là enzyme của vi khuẩn tiết ra làm phân hủy kháng sinh β - lactams thường sử dụng

như cephalosporin Kháng sinh carbapenem đầu tiên được phát triển từ kháng sinh

thienamycin, một sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên của Streptomyces cattleya

Carbapenem gồm những kháng sinh như: Imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, panipenem/betamipron, biapenem

™ Phổ kháng khuẩn, chỉ định

Hiện có hai sản phẩm thường được sử dụng là imipenem và meropenem Các kháng sinh này có phổ rộng, rất mạnh, được dành cho điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn nặng

• Phổ kháng khuẩn

o Các vi khuẩn nhạy cảm với thuốc

ƒ Tụ cầu methi - S, liên cầu A, B, C, G

ƒ S pneumoniae peni – S và R, S bovis

ƒ Enterococcus (trừ E gaecium), L monocytogenes

ƒ Rhodococcus equi

ƒ Klebsiella, E coli, Salmonella, Shigella, Yersinia

ƒ Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Providencia

ƒ Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter

ƒ H influenzae β – lactamase (-) và β – lactamase (+)

ƒ Neisseria, M catarrahalis

ƒ Peptococus, Peptostreptococcus, Clostridium, Nocardia

ƒ Campylobacter, Eikenella, P multocida

ƒ Actinomyces, Fusobacterium, Veillonella, B fragilis

o Các vi khuẩn kháng thuốc

ƒ Tụ cầu methi-R, corynebacterium ssp, E faecium

ƒ B cepacia, S moltophilia, Flavobacterium

ƒ Chlamydia, Mycoplasma, Legionella, các Mycobacteria

o Các vi khuẩn nhạy cảm vừa phải với thuốc

ƒ Proteus indol (+) và (-), E faecalis

• Chỉ định: Các thuốc này được dùng để điều trị nhiễm nặng các vi khuẩn nhạy cảm, nhất là nhiễm khuẩn ổ bụng, phổi - phế quản, phụ khoa, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn da và các phần mềm, niệu - sinh dục, xương khớp, viêm màng trong tim

dụng nhiều để ngăn chặn các vi khuẩn kháng thuốc

Cơ chế hoạt động của imipenem là ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào Không bị thủy phân bởi các enzyme β - lactamase (penicillinase và cephalosporinase) nên có tác dụng tốt đối với vi khuẩn ESBL Tuy nhiên imipenem bị phân hủy bởi enzyme dehydropeptidase của thận, để ngăn chặn điều này imipenem được dùng kết hợp với cilastatin

Cơ chế tác động kháng sinh này là do ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn Các vi khuẩn sản sinh ra metallo – beta - lactamases kháng lại meropenem Meropenem không bị thủy phân bởi enzyme dehydropeptidase của thận

Meropenem có tác dụng tốt với các vi khuẩn Gram (-) và Gram (+), nhất là các

nhóm vi khuẩn Enterobacteriaceace, và các vi khuẩn tiết ESBL Meropenem không

được dùng để điều trị nhiễm trùng MRSA

2.2 Nhiễm khuẩn bệnh viện

2.2.1 Nhiễm khuẩn bệnh viện là gì

Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) là một nhiễm trùng tại chỗ hay toàn thân do phản ứng với sự có mặt của tác nhân gây bệnh (hoặc độc tố của nó) mà nó chưa có mặt hoặc chưa được ủ bệnh lúc nhập viện (Đỗ Kháng Chiến, 2006)

Hầu hết các NKBV thường xảy ra sau khi nhập viện 48 giờ hoặc lâu hơn (48 giờ là thời gian đặc trưng cho giai đoạn ủ bệnh) Tuy thế, mỗi loài vi khuẩn gây bệnh lại có thời kỳ ủ bệnh khác nhau, hơn nữa cũng phụ thuộc vào sức đề kháng của người bệnh, nên mỗi trường hợp NKBV cần được đánh giá riêng rẽ bằng các chứng cứ có liên quan với việc điều trị trong bệnh viện

NKBV gây ra những tác hại to lớn không những riêng bệnh nhân nhập viện, nhân viên y tế tiếp xúc mà còn là mối đe dọa cho cộng đồng:

• NKBV làm kéo dài thời gian nằm điều trị tại bệnh viện (cùng các hậu quả do nó gây ra cho gia đình và xã hội)

• Làm tăng chi phí chăm sóc và thuốc, nhất là kháng sinh

• Tăng nguy cơ tử vong (gấp 2 - 4 lần, nếu NKBV là viêm phổi hoặc nhiễm khuẩn máu)

NTBV có thể xảy ra lẻ tẻ (từng bệnh nhân, từng phòng) nhưng cũng có thể xảy

ra thành dịch trong một bệnh viện hay nhiều bệnh viện (ví dụ do cùng sử dụng một sản phẩm bị nhiễm trùng như dịch truyền …)

Những dạng NKBV thường gặp là:

• Nhiễm khuẩn vết mỗ, vết thương

• Nhiễm khuẩn đường tiểu, sau khi phẩu thuật đặt các ống dẫn

• Nhiễm khuẩn đường hô hấp: Viêm phổi bệnh viện, viêm phổi do thở máy

• Nhiễm khuẩn huyết

Theo báo cáo CDC (2002): Nhiễm khuẩn tiết niệu chiếm 34 - 46 %, nhiễm khuẩn vết thương ngoại khoa, nhiễm khuẩn da 22 - 35 %, nhiễm khuẩn đường hô hấp 14 - 18 %, nhiễm khuẩn máu 3 - 7 %

2.2.2 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện

Mặc dù y tế ngày càng tiến bộ thế nhưng NKBV vẫn là một vấn nạn của cả những nước phát triển và nước kém phát triển do các yếu tố như: giảm miễn dịch của các bệnh nhân; sự đa dạng ngày càng nhiều các kỹ thuật phẩu thuật tạo ra nhiều tiềm năng, con đường nhiễm khuẩn; quần thể vi khuẩn bệnh viện này càng lớn và nguy cơ kháng thuốc cao; nơi ít kiểm soát các tác nhân NKBV Theo báo cáo cuộc khảo sát của WHO (2002) tại 55 bệnh viện của 14 quốc gia đại diện cho 4 khu vực (Châu Âu, Đông Địa Trung Hải, Đông Nam Á, và Tây Thái Bình Dương) cho thấy tỉ lệ NKBV trung bình là 8,7 % số người nhập viện và bất kỳ lúc nào cũng có hơn 1,4 triệu người mắc phải NKBV Khu vực có tỷ lệ NKBV cao là Đông Địa Trung Hải (11,8 %), Đông Nam

Á (10,0 %) và Tây Thái Bình Dương (9,0 %)

2.2.3 Tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện

NKBV do nhiều vi khuẩn khác nhau gây nên, những tác nhân hàng đầu được

các báo cáo là K pneumoniae, E coli, P aeruginosa, S aureu, và A baumannii

Theo chương trình ASTS của bộ y tế (2006) các vi khuẩn hàng đầu gây NKBV,

thường xuyên được báo cáo trong nghiên cứu tại các bệnh viện là Klebsiella (18 %),

E coli (16 %), S aureus (10 %), và A baumannii (12 %)

Theo báo cáo của Cao Minh Nga (2009), các vi khuẩn thường phân lập được trong 1884 chủng vi khuẩn phân lập từ NKBV tại bệnh viện Thống Nhất năm 2006 thì

các các tác nhân vi khuẩn gây NKBV bao gồm Klebsiell spp (26,91 %) chiếm tỉ lệ cao nhất, đến Pseudomonas aeruginosa (25,47 %), E coli (15,87 %), Acinetobacter spp (10,19 %), S aureus (7,27 %) và Enterococci (3,45 %)

Các vi khuẩn gây NKBV đều có khả năng kháng kháng sinh cao vì được tiếp xúc và được chọn lọc thường xuyên trong môi trường bệnh viện Hiện nay NKBV càng phức tạp khi các vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày càng phổ biến với nhiều

cơ chế kháng và kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau, nhất là nhóm vi khuẩn Gram (-) tiết ESBL (Expanded Spectrum β - lactamase) kháng thuốc kháng sinh phổ

rộng, chủ yếu là trên vi khuẩn K pneumoniae và E coli Các vi khuẩn này kháng với

các kháng sinh cephalosporin, monobactam thường được sử dụng điều trị NKBV, làm cho quá trình điều trị gặp rất nhiều khó khăn

2.2.4 Vi khuẩn tiết ESBL

ESBL (Expanded Spectrum β - lactamase) là men β - lactamase có khả năng ly giải các cephalosporin phổ rộng thế hệ 3 (như ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone) và monobactam (như aztreonam), nhưng không tác động đến cephamycins (như cefoxitin, cefotetan) hay carbapenem (meropenem và imipenem) (Nguyễn Thị Xuân Yến và ctv, 2005)

Bản chất của vi khuẩn sinh tiết ESBL là:

• Gene tổng hợp nằm trên plasmid, đột biến từ các gene sản xuất β - lactamase kinh điển (TEM-1, SHV-1…)

• Nhạy với carbapenem, cephamicins, temocillin

Theo thống kê chính thức của bộ y tế công bố năm 2004, có 8 % vi khuẩn E coli,

20 % Enterobacter và 24 % K pneumonia tiết ESBL

Theo nghiên cứu đa trung tâm khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của các trực khuẩn Gram (-) dễ mọc gây NKBV của phòng thí nghiệm vi sinh của 3 bệnh viện

Tp Hồ Chí Minh và 1 bệnh viện ở Đà Nẵng từ tháng 1/2007 đến 5/2008 kết quả cho

thấy tỷ lệ vi khuẩn tiết ESBL là rất cao Tỷ lệ này ở K pneumonia là 66 %, E coli là

64 % và Enterobacter là 46 % Các vi khuẩn này đề kháng cao với các kháng sinh

cephalosporin thế hệ 3 và cả thế hệ 4 (Phạm Hùng Vân và ctv, 2009) Và những nghiên cứu của các tác giả khác ở nhiều bệnh viện khác nhau cũng cho thấy tình hình

vi khuẩn K pneumonia và E coli tiết ESBL là rất cao đáng báo động

Trong điều trị NTBV khi các tác nhân được xác định là trực khuẩn Gram (-) tiết ESBL, khi đó các kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 và thế hệ 4 không được chỉ định điều trị mặc dù cephalosporin thế hệ 4 thường còn nhạy cảm trong thí nghiệm

Theo công văn số 7654/ BYT-ĐTr về việc sử dụng cephalosporin và carbapenem,

bộ y tế Việt Nam khuyến nghị: những năm gần đây các cơ sở điều trị và cộng đồng có tình trạng lạm dụng sử dụng kháng sinh dẫn đến gia tăng sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, do đó nhiều kháng sinh không còn hiệu lực điều trị Việc lạm dụng cephalosporin đặc biệt là cephalosporin thế hệ 3 đang làm gia tăng vi khuẩn Gram (-) đột biến sinh β - lactamase phổ mở rộng (ESBL) Khi các vi khuẩn Gram (-) kháng cephalosporin thế hệ 3 hoặc được xác định có ESBL thì dùng nhóm thuốc kháng sinh thế hệ mới là carbapenem để điều trị (Đỗ Quốc Huy, 2009)

Kháng sinh carbapenem được chỉ định điều trị trong trường hợp NKBV do trực khuẩn tiết ESBL và đã cho kết quả rất hiệu quả Thế nhưng, những năm gần đây những vi khuẩn tiết ESBL lại có khả năng đề kháng với kháng sinh carbapenem, đặc

biệt trên trực khuẩn vốn nổi tiếng hàng đầu với khả năng tiết ESBL là K pneumoniae

Vi khuẩn này tiết men KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) thủy phân và đề kháng với kháng sinh carbapenem Và càng nguy hiểm hơn khi K pneumoniae có thể

truyền khả năng tiết KPC sang các vi khuẩn khác qua plasmid trung gian Vì vậy NKBV sẽ là vấn đề lớn cực kỳ nguy hiểm nếu trực khuẩn Gram (-) nói chung và trực

khuẩn K pneumoniae nói riêng tiết KPC trở nên phổ biến

2.3 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae và sự đề kháng kháng sinh

2.3.1 Đặc điểm vi sinh vật

• Hình thể: Là trực khuẩn Gram (-) thuộc chi Klebsiella, họ Enterobacteriaceae, thường đứng thành từng đôi, không có lông, không sinh bào tử,

có vỏ dày (gấp 2-3 lần so với vỏ tế bào trực khuẩn thông thường)

• Tính chất nuôi cấy: Là vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy ý, phát triển tốt trên môi trường thạch máu, môi trường MacConkey agar (MC) ở điều kiện nhiệt độ 35 -37 oC

và ở pH 7,2 - 7,5 Trên môi trường lỏng K pneumoniae phát triển làm đục môi trường,

có màu tím đỏ đường kính khuẩn lạc lớn từ 3 - 4 mm, thường rất nhầy, ngoài khuẩn lạc nhầy có thể có khuẩn lạc R do vi khuẩn không có vỏ

• Nuôi cấy phân lập: Nuôi cấy bệnh phẩm vào môi trường thạch máu, MC Sau 24 giờ nhận xét hình thái khuẩn lạc, nhuộm soi loại hình thể, cấy chuyền sang các môi trường sinh hóa Có thể sử dụng môi trường Esoin Methylene Blue Agar (EMB)

để phân lập K pneumoniae Môi trường EMB là môi trường được sử dụng phân lập,

nuôi cấy và phân biệt các vi khuẩn đường ruột gram âm dựa trên quá trình lên men

lactose Vi khuẩn lên men lactose, đặt biệt là các Coliform, E coli có khuẩn lạc xanh

đen có ánh kim Vi khuẩn không len men lactose có khuẩn lạc không màu hoặc màu

hồng Trên môi trường MC thì vi khuẩn E coli: khuẩn lạc màu xanh có ánh kim, vi khuẩn K pneumoniae: khuẩn lạc màu tím không có ánh kim và vi khuẩn Shigella flexneri: khuẩn lạc trong suốt (lactose âm tính)

• Xác định tính chất sinh hóa: chọn lọc khuẩn lạc nhầy từ các môi trường phân lập cấy sang môi trường sinh hóa, sau 24 giờ xác định các tính chất sinh hóa của

vi khuẩn trên môi trường đó, từ những kết quả các phản ứng sinh hóa có thể dùng định

danh xác định K pneumoniae Tính chất sinh hóa đặc trưng của K pneumoniae gồm

những tính chất sau:

o K pneumoniae có khả năng sử dụng nhiều loại đường như glucose,

saccarose, mantose, manit, lactose

o Phản ứng LDC dương tính cho thấy K pneumoniae có thể sản sinh

enzyme thủy phân amino acid lysin Môi trường lỏng LDC chứa glucose

và lysin và có màu tím, thoạt đầu vi khuẩn lên men glucose acid hóa môi

trường nên môi trường đổi thành vàng Sau đó vi khuẩn thủy phân lysin

làm môi trường kiềm hóa trở lại và môi trường trở lại màu tím

o K pneumoniae có khả năng biến dưỡng glucose nên dương tính với phản

ứng Voges proskauer (VP)

o Phản ứng tìm indol và thử tính di động K pneumoniae âm tính

o K pneumoniae có thể sử dụng citrate trong môi trường làm nguồn cacbon

duy nhất, phản ứng simmons citrate dương tính

o Đối với phản ứng tìm urease trên môi trường thạch nghiêng Christensen’s

urea agar, K pneumoniae thủy phân urê kém chỉ làm hồng phần nghiêng

(dương tính một phần)

2.3.2 Sự đề kháng thuốc kháng sinh của K pneumoniae

K pneumoniae là nguyên nhân thường xuyên gây NKBV, do sự tiếp xúc nhiều

với kháng sinh điều trị trong môi trường bệnh viện nên tình hình vi khuẩn này đề

kháng với các kháng sinh điều trị là rất phổ biến Một nhóm lớn K pneumoniae tiết

ESBL kháng lại hầu hết kháng sinh nhóm β - lactams kể cả cephalosporin thế hệ 3, cephalosporin thế hệ 4 và aztreonam khi đó nhóm kháng sinh carbapenem cho kết quả

điều trị rất tốt Nhưng giờ đây K pneumoniae đã bắt đầu đề kháng lại với kháng sinh carbapenem, cơ chế là nhờ enzyme KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) có

khả năng thủy phân carbapenem, KPC do gene đột biến blaKPC nằm trên plasmid quy định và khả năng lan rộng gene đột biến này là rất lớn, không chỉ trên trực khuẩn

K pneumoniae mà còn truyền sang cả nhiều vi khuẩn khác

KPC được mô tả đầu tiên vào năm 2001 trên vi khuẩn K pneumoniae tại một

bệnh viện Bắc Carolina, Mỹ Đến tháng 8/2003, một bệnh viện ở New York phát hiện

thêm 2 trường hợp vi khuẩn K pneumoniae tiết KPC, sau đó đã bùng phát thành ổ

dịch với tổng số 60 trường hợp được phát hiện ở cả 2 ổ dịch trên

Vi khuẩn tiết KPC đề kháng với các kháng penicillin, cephalosporin, aztreonam

và carbapenem, vi khuẩn này cũng có thể tồn tại cơ chế kháng kháng sinh khác như ESBL, fluoroquinolone, aminoglycoside Vì thế vi khuẩn tiết KPC rất nguy hiểm trong NKBV khi chúng đề kháng hầu hết các loại kháng sinh và tỷ lệ tử vong sau 2 tuần phát hiện đến 47 % các trường hợp mắc phải

Sau khi phát hiện hai ổ dịch trên, vi khuẩn tiết KPC được báo cáo trên nhiều bang khác của Hoa Kỳ và tiếp tục lan rộng ra nhiều quốc gia và khu vực trên thế giới như Israel (Azita và ctv, 2007), Trung Quốc (Ping và ctv, 2009), Hi Lạp (Giakoupi và ctv, 2009), Italia (Carla và ctv, 2010), Nam Mỹ (Maria và ctv, 2006), Thổ Nhĩ Kỳ, Pháp và nhiều quốc gia khác

Gene blaKPC nằm trên plasmid và trên trình tự transposon nên sự lan truyền rộng gene này là rất đáng lo ngại và các báo cáo tìm thấy KPC trên các vi khuẩn khác

như Enterobacter, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas, E coli, Serratia marcescens

KPC được phân lập đầu tiên ở Bắc Carolina, được đặt tên là KPC - 1, những phát hiện tiếp theo được đặt tên theo thứ tự số thứ tự từ KPC - 2 đến KPC – 4, KPC - 2 được tìm thấy tại Maryland và sau đó ở New York của Mỹ, KPC - 2 còn được tìm thấy

ở cả vi khuẩn Samonella spp và Klebsiella oxytoca Nghiên cứu trình tự chuổi KPC - 1

cho thấy rằng KPC - 1 và KPC - 2 thu được trong thực tế giống hệt nhau

KPC - 3 được tìm thấy ở một ổ dịch tại New York, các vi khuẩn sản sinh KPC -

2 và KPC - 3 phát triển mạnh mẽ tại miền Đông và Trung nước Mỹ, cấu trúc enzyme

KPC - 2 và KPC - 3 phát hiện trong mẫu lâm sàng khác nhau chỉ một acid amine

Những nghiên cứu cho thấy gene blaKPC - 2 là gene gốc, do đột biến phát sinh các blaKPC phiên bản tiếp theo KPC - 5 và KPC - 6 đã được mô tả tại Puerto Rico,

KPC - 5 được phát hiện trong Pseudomonas và KPC - 2 khác với KPC - 5 một acid

amin (Pro 103 thay thế cho Arg) và KPC - 6 được phân lập khác với KPC - 2 cũng chỉ một acid amine (Val 239 thay thế cho Gly)

Nhiều báo cáo rằng K pneumoniae đề kháng với kháng sinh carbapenem ngày càng mạnh mẽ và lan rộng trên nhiều nước trên thế giới, nguy cơ K pneumoniae

chuyển gene kháng blaKPC qua các loài vi khuẩn khác và sự tồn tại song song với các

cơ chế kháng khác làm cho tình hình sử dụng kháng sinh trong điều trị gặp nhiều khó

khăn, cùng với đó là nguy cơ bệnh nhân tử vong cao khi nhiễm K pneumoniae tiết KPC đã làm cho NKBV trở nên thực sự nguy hiểm Vi khuẩn K pneumoniae tiết KPC

trong NKBV có thể được điều trị bằng kháng sinh colistin và tigecycline nhưng tác

dụng rất hạn chế Vì vậy K pneumoniae kháng kháng sinh carbepenem phải cần được

chú trọng nghiên cứu để đưa ra khuyến cáo hỗ trợ điều trị và xử lý kịp thời

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại phòng xét nghiệm vi sinh của công ty Nam Khoa Biotek trong thời gian từ tháng 2/2010 đến 7/2010

3.2 Vật Liệu

Mẫu thí nghiệm là chủng K pneumoniae được phòng xét nghiệm bệnh viện

Nguyễn Tri Phương phân lập từ bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010

• Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

o Môi trường MacConkey agar (MC)

o Môi trường Muler Hinton agar (MHA)

ƒ Acid Casein Peptone 17,5 g

ƒ Starch 1,5 g

ƒ Beef Infusion 2 g

ƒ Bacteriological Agar 17 g

ƒ pH 7,4 Các môi trường trên của công ty Nam Khoa Biotek

• Hệ thống định danh trực khuẩn gram âm, dễ mọc IDS 14 GNR® của công ty Nam Khoa Biotek

• Đĩa giấy kháng sinh

Kháng sinh có tên khoa học đầy đủ thống nhất chung theo chuẩn quốc tế nhưng

kí hiệu kháng sinh giữa các hãng có thể khác nhau, trong đề tái này kí hiệu kháng sinh theo quy định kí hiệu của công ty Nam Khoa Biotek

3.3 Phương Pháp

3.3.1 Phương pháp xử lý mẫu

3.3.1.1 Phương pháp cấy chuyền mẫu

Chủng vi khuẩn K pneumoniae thu nhận từ bệnh viện Nguyễn Tri Phương là

những chủng từ bệnh nhân mắc NKBV có xác nhận ESBL dương tính, chủng này được giữ ở nhiệt độ - 20 oC trong các tube giữ chủng 1,5 ml, sau khi rã đông ở nhiệt độ

phòng, lắc đều dịch vi khuẩn, dùng que cấy vòng vô trùng lấy một vòng que cấy và cấy ria trên môi trường thạch MC , cấy 2 chủng chung trên một đĩa (mỗi chủng trên ½ đĩa, tuyệt đối tránh sự lây lan đường cấy giữ hai chủng được cấy chung), sau khi cấy mẫu được ủ trong tủ ấm trong thời gian 16 - 20 giờ

Nếu sau khi cấy vi khuẩn từ ống giử chủng lên môi trường MC mà không mọc thì lần cấy thứ hai từ ống giữ chủng được cấy lại bằng cách lắc đều tube giữ chủng, dùng micropepet hút 20 µl dịch vi khuẩn và cấy trên môi trường MC

Các chủng được cung cấp phòng xét nghiệm bệnh viện Nguyễn Tri Phương đã

được định danh là K pneumoniae Và để khẳng định lại các chủng được cung cấp đều

là chủng vi khuẩn K pneumoniae thì các chủng vi khuẩn cấy trên môi trường MC phải

có hình dạng khuẩn lạc đặc trưng là màu tím đỏ, rất nhầy và kích thước khuẩn lạc lớn

từ 3 - 4 mm và các chủng này được bắt trên môi trường MC (vi khuẩn trẻ, không quá

24 giờ) nhuộm Gram và hình dạng nhuộm được là các trực khuẩn Gram (-), kích thước lớn Nếu không có các đặc điểm này thì vi khuẩn được định danh lại xác định chính

xác các chủng là K pneumoniae trước khi thử nghiệm kháng sinh đồ

Sau khi thực hiện xong toàn bộ thí nghiệm thì chủng vi khuẩn được cấy lại trên môi trường MC, sau khoảng 16 – 24 giờ, thu vi khuẩn lưu mẫu trở lại trong tube giữ chủng 1,5 ml chứa môi trường Trypticase Soy Broth, vi khuẩn được lưu mẫu trở lại phòng xét nghiệm vi sinh bệnh viện Nguyễn Tri Phương ở điều kiện – 20 oC (các chủng vi khuẩn khác được lưu mẫu và làm kháng sinh đồ từ những môi trường giàu

dinh dưỡng, nhưng K pneumoniae có thể thực hiện trực tiếp từ môi trường MC vì vi

khuẩn này phát triển rất mạnh và hoàn toàn không bị ức chế trên môi trường này)

Vi khuẩn K pneumoniae được cấy từ tube giữ chủng sang môi trường MC và

tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ được chia làm 3 đợt: Đợt một có 21 chủng vi khuẩn, đợt hai có 17 chủng và đợt ba 17 chủng

3.3.1.2 Phương pháp định danh K pneumoniae

Vi khuẩn K pneumoniae có thể định danh bằng các phản ứng sinh hóa đặc

trưng đã biết được trình bày mục 2.3.1 Một sản phẩm định danh thương mại dựa trên nguyên lý các phản ứng sinh hóa để định danh các chủng trực khuẩn Gram (-) dễ mọc

là sản phẩm “Hệ thống định danh trực khuẩn Gram (-), dễ mọc IDS 14 GNR®” của

công ty Nam Khoa Biotek dựa trên 14 phản ứng sinh hóa của trực khuẩn Gram (-) trên các môi trường sinh hóa

Các chủng sau khi cấy trên môi trường MC và nhuộm Gram nhận biết hình thể

nếu chủng vi khuẩn khác với đặc điểm hình thái đặc trưng của K pneumoniae thì sẽ

được định danh lại bằng hệ thống định danh trực khuẩn Gram (-), dễ mọc IDS 14 GNR® của công ty Nam Khoa Biotek Kết quả định danh lại để đảm bảo là tất cả các

chủng thử nghiệm là K pneumoniae Trong thử nghiệm định danh lại các chủng nghi

ngờ bằng hệ thống định danh trực khuẩn Gram (-), dễ mọc IDS 14 GNR® được thực hiện theo hướng dẫn của công ty Nam Khoa Biotek, vi khuẩn được sử dụng là vi khuẩn thuần, cấy không quá 24 giờ, vi khuẩn được đánh huyền dịch trong nước muối sinh lý đạt độ đục tương đương độ đục dung dịch chuẩn 2 McFarland Và đọc kết quả đối với thử nghiệm oxidase trong vòng 1 phút, đối với thử nghiệm khác đọc kết quả sau khi ủ 35 - 37 oC trong khoảng 12 - 24 giờ Thực hiện các thử nghiệm sinh hóa:

• Thử nghiệm oxidase: nhỏ giọt nước muối trên lam, kẹp lấy 1 đĩa giấy

oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý vô trùng, dùng vòng cấy vô khuẩn lấy một khuẩn lạc quệt lên đĩa giấy, đọc kết quả trong 1 phút Đĩa giấy oxidase xuất hiện màu tím đen là (+) với oxidase, đĩa giấy giấy không

có màu tím đen là (-) với oxidase

• Thí nghiệm sinh hóa trên bảng nhựa: Bảng nhựa là một dãy 10 giếng chứa

các đĩa giấy cho 11 phản ứng sinh hóa Dùng tăm bông vô trùng lấy khuẩn lạc cho vào nước muối vô trùng, đánh huyền dịch vi khuẩn tương đương dung dịch chuẩn 2 McFarland Tiếp theo dùng pipet hút 200 µl huyền dịch

vi khuẩn cho vào mỗi giếng trên bản nhựa Đậy nắp bảng nhựa, ủ ở nhiệt

độ 35 – 37 oC trong 12 - 24 giờ, đọc kết quả Kết quả định danh dựa trên

những đặt tính phản ứng sinh hóa của K pneumoniae và dựa vào sự chỉ

thị, biểu hiện của các chủng thử nghiệm và biện luận theo hướng dẫn của công ty sản xuất Nam Khoa Biotek, cách đọc chỉ thị màu của các thử nghiệm sinh hóa được trình bày ở bảng phụ lục số 1

• Thử nghiệm trên môi trường Lysin Decarboxylase (LDC): bơm 2 - 3 giọt

huyền dịch vi khuẩn ở trên xuyên qua lớp parafilm, đậy nắp và ủ ở nhiệt

độ 35 – 37 oC trong 12 - 24 giờ Đọc kết quả (+) khi môi trường có vi khuẩn mọc và có màu tím, đọc là (-) khi môi trường có màu vàng