ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR (SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH LIÊN KẾT GEN DMD

Đặc biệt trong vài năm trở lại đây đã có một số nghiên cứu ở mức độ sinh học phân tử, song hầu hết các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột biến trên các đối tượng được chẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR (SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHẢO SÁT STR (SHORT TANDEM REPEAT) TRONG PHÂN TÍCH

LIÊN KẾT GEN DMD

ThS.BS NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN NGUYỄN DUY LAN ThS.BS QUÁCH THỊ HOÀNG OANH

Tháng 07/2010

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến:

Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các Thầy Cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt bốn năm học vừa qua tại trường

ThS.BS Nguyễn Khắc Hân Hoan và ThS.BS Quách Thị Hoàng Oanh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quý giá và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện Khóa luận tốt nghiệp này

Tập thể Y – Bác sĩ, Thầy Cô và Anh Chị - Phòng Di truyền đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Xin cảm ơn các bạn học cùng khóa đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt bốn năm học qua

Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất con xin gửi tới bố mẹ đã yêu thương, chăm sóc, dạy bảo và luôn dành cho con những điều tốt đẹp nhất

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010

Sinh viên Nguyễn Duy Lan

TÓM TẮT

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một trong những bệnh thần kinh – cơ di truyền phổ biến với tỷ lệ mới mắc là 1/3500 trẻ trai đẻ sống

Bệnh DMD xảy ra do đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc thể giới tính X Hơn 65%

trường hợp là đột biến mất hoặc lặp đoạn gen Kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification - Lai nhiều probe khuếch đại) gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả Tuy nhiên trong một số trường hợp bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nhưng MLPA không phát hiện được đột biến Lúc này, cần phải triển khai phương pháp khác nhằm chẩn đoán nguồn gốc gen đột biến, đó chính là khảo sát

STR trong phân tích liên kết gen dystrophin Đề tài nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật khảo

sát STR với ba cặp mồi đặc hiệu DYS6, DXS992 và STR49

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: ba mươi mẫu DNA của mười gia đình trong

đó gồm hai mươi mẫu từ bố mẹ và mười mẫu ối Xác định giới tính mười mẫu ối bằng multiplex PCR Sau đó tất cả ba mươi mẫu được khảo sát STR – PCR, điện di mao quản bằng CEQTM 8000, phân tích bằng chương trình Fragment Analysis Trong nghiên cứu này tôi đã tiến hành phản ứng multiplex PCR xác định được chính xác giới tính thai nhi

và xác định các thông số tối ưu cho việc khảo sát STR bằng kỹ thuật PCR sử dụng ba cặp mồi đặc hiệu

– linked dystrophin gene More than 65% of cases are deletion or duplication mutation

Recently, MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification) is described as an effective method to detect these mutations However, in some cases, mutation cannot be identified by this method although patient has clinical symptom Original mutaion need to

be identified by a different method, it’s linkage analysis base on Short tandem repeats (STR) In this study, we used three specific pairs of primer DYS6, DXS992 and STR49 for STR - PCR

Method: DNA samples from thirty families included twenty samples from ten couples and ten samples from amniotic fluid Sex of ten samples from amniotic fluid was determined by multiplex PCR Then all samples were carried out STR - PCR, capillary electrophoresis with CEQTM 8000, and analyzed by Fragment Analysis program The sex

of fetals were determined accurately by using multiplex PCR and the protocol STR – PCR was optimized successfully with three specific pair of primers in this study

MỤC LỤC

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Lược sử về bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne 3

2.2 Tổng quan về bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne 3

2.2.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne 3

2.2.2 Cơ chế di truyền bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne 5

2.3 Nguyên nhân gây bệnh 7

2.3.1 Cấu trúc gen dystrophin 8

2.3.2 Cấu trúc và chức năng protein dystrophin 10

2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne 13

2.4.1 Phương pháp chẩn đoán điện 13

2.4.1.1 Đo tốc độ dẫn truyền vận động 13

2.4.1.2 Điện cơ 13

2.4.2 Kiểm tra creatine kinase 14

2.4.3 Sinh thiết cơ 14

2.4.4 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch 15

2.4.5 Kỹ thuật Western blot 15

2.4.6 Chẩn đoán di truyền phân tử 16

2.4.6.1 Kỹ thuật Multiplex PCR 16

2.4.6.2 Kỹ thuật Southern blot 16

2.4.6.3 Kỹ thuật điện di trên gel biến tính 17

2.4.6.4 Kỹ thuật PCR phiên mã ngược 18

2.4.6.5 Kỹ thuật kiểm tra sự cắt ngắn protein 18

2.4.6.6 Kỹ thuật lai tại chỗ có gắn huỳnh quang 18

2.4.6.7 Kỹ thuật lai nhiều probe khuếch đại 19

2.4.6.8 Kỹ thuật khuếch đại nhiều probe phụ thuộc quá trình nối 20

2.4.6.9 Phân tích liên kết gen 21

(1) Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn 21

(2) Trình tự lặp lại ngắn (Short Tandem Repeats, STR) 22

2.5 Tổng quan nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne trên thế giới 22

2.6 Tổng quan nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne tại Việt Nam 23

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

3.2 Nội dung nghiên cứu 26

3.3 Vật liệu 26

3.3.1 Xác định giới tính bằng multiplex PCR 26

3.3.2 Hóa chất cho tách chiết DNA 27

3.3.3 Hóa chất cho phản ứng STR – PCR 27

3.3.4 Hóa chất cho điện di trên gel agarose 28

3.3.5 Hóa chất cho điện di mao quản trên máy Beckman Coulter CEQTM 8000 29

3.3.6 Các thiết bị, dụng cụ khác 29

3.4 Phương pháp nghiên cứu 31

3.4.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu 31

3.4.1.1 Phương pháp thu mẫu 31

3.4.1.2 Phương pháp tách chiết DNA 31

3.4.2 Thực hiện xác định giới tính bằng multiplex PCR 32

3.4.2.1 Phương pháp multiplex PCR xác định giới tính thai nhi 32

3.4.2.2 Đảm bảo chất lượng phản ứng 34

3.4.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 34

3.4.3 Phương pháp khảo sát STR – PCR 35

3.4.4 Phân tích liên kết gen dystrophin dựa trên kết quả khảo sát STR 38

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

4.1 Kết quả 40

4.1.1 Xác định giới tính bằng phương pháp mutiplex PCR 40

4.1.2 Phương pháp khảo sát STR dựa trên kỹ thuật PCR 43

4.2 Thảo luận 48

4.2.1 Xác định giới tính thai nhi bằng multiplex PCR 48

4.2.2 Phân tích liên kết gen dystrophin dựa vào khảo sát STR – PCR 49

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Array-cGH Array comparative genomic hybridization

BMD Becker muscular dystrophy

cDNA complementary deoxyribonucleic acid

DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis

DMD Duchenne muscular dystrophy DMSO dimethyl sulfoxide

DNA deoxyribonucleic acid

DSCP Double strand conformation polymorphism

EDTA ethylene diamine tetraacetid acid

FISH Flourescent in situ hybridization

HDA Heteroduplex analysis

Kb kilobase

MAPH Multiplex amplifiable probe hybridization, MAPH MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification

MK marker

mRNA messenger ribonucleic acid

NIL nihil, nothing hay zero

NST nhiễm sắc thể

nt nucleotide

PCR Polymerase chain reaction

PTT Protein Truncation test

RFLP Restriction fragment length polymorphism

RNA ribonucleic acid

RT – PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction SNP Single nucleotide polymorphism

SRY Sex-determining Region Y

STR Short tandem repeats

SSCP Single strand conformation polymorphism

tt tiếp theo

UV ultraviolet

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Trình tự 6 đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng multiplex PCR 26

Bảng 3.2 Trình tự 3 cặp mồi dùng trong phản ứng STR – PCR 28

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng multiplex PCR xác định giới tính thai nhi 33

Bảng 3.4 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR 34

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng STR – PCR 36

Bảng 3.6 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR 36

Bảng 4.1 Danh sách mẫu ối 40

Bảng 4.2 Kết quả xác định giới tính của 10 mẫu ối 41

Bảng 4.3 Danh sách mẫu 10 gia đình thực hiện khảo sát STR – PCR 43

Bảng 4.4 Bảng tổng kết alen của 30 mẫu thuộc 10 gia đình được khảo sát 44

Bảng 4.5 Tỷ lệ dị hợp tử của 10 mẫu mẹ 45

Bảng 4.6 Tần số alen của locus DYS6 trên 20 mẫu máu bố mẹ 46

Bảng 4.7 Tần số alen của locus STR49 trên 20 mẫu máu bố mẹ 46

Bảng 4.8 Tần số alen của locus DXS992 trên 20 mẫu máu bố mẹ 46

Bảng 4.9 Các alen được di truyền cho đời con 47

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Dấu hiệu Gowers 4

Hình 2.2 So sánh giữa dạng bình thường và DMD/BMD 5

Hình 2.3 Kiểu di truyền bệnh DMD 6

Hình 2.4 Vị trí locus Xp21 7

Hình 2.5 Vị trí 79 exon và 8 promoter của gen 9

Hình 2.6 Vị trí protein dystrophin trên mặt trong màng tế bào cơ vân 10

Hình 2.7 Mối liên quan giữa các vùng của dystrophin và một số phức hợp protein 11

Hình 2.8 Sự kết hợp của dystrophin với phức hệ protein trong tế bào cơ 12

Hình 3.1 Bộ kit tách chiết DNA của Qiagen 27

Hình 3.2 Thang chuẩn DNA 100bp 28

Hình 3.3 Bộ hóa chất cho điện di mao quản 29

Hình 3.4 Các máy móc thiết bị phòng thí nghiệm sinh học phân tử 30

Hình 3.5 Nguyên lý hệ thống điện di mao quản ..37

Hình 4.1 Hình điện di sản phẩm multiplex PCR trên 10 mẫu ối 41

Hình 4.2 Kết quả điện di mao quản của một mẫu ối xác định giới tính 42

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm STR – PCR 10 gia đình 43

Hình 4.4 Kết quả phân tích bằng chương trình Fragment Analysis của máy CEQ 48

Hình 4.5 Kết quả phân tích bằng chương trình Fragment Analysis của máy CEQ 48

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là bệnh di truyền

lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X Bệnh DMD gây nên bởi đột biến gen dystrophin,

gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST X, có chiều dài 2400 kb, bao gồm 79 exon chỉ chiếm 0,6% cấu trúc gen, còn lại là intron Protein mã hóa bởi gen có tên là dystrophin với trọng khối phân tử 427 kDa, nằm ở màng bào tương của tế bào cơ, có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng cơ

Bệnh DMD là một trong những bệnh thần kinh cơ - di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mắc bệnh là 1/3.500 trẻ trai đẻ sống Bệnh DMD có đặc trưng là thoái hóa và gây suy yếu cơ một cách tiến triển dẫn đến tàn tật và tử vong Đặc điểm lâm sàng của bệnh này rất đa dạng với mức độ biểu hiện khác nhau, thường được nhận biết ở giai đoạn trẻ từ 2 – 3 tuổi với triệu chứng yếu cơ xuất hiện sớm, tiến triển nhanh, mất khả năng đi lại lúc 10 – 13 tuổi và tử vong

ở lứa tuổi ngoài 20 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp

Vì tính chất nặng nề và phổ biến nên bệnh Duchenne đã được quan tâm nghiên cứu ở nước ta từ nhiều năm nay Đó là nghiên cứu về tần suất mắc bệnh, mối liên quan giữa chẩn đoán lâm sàng và xét nghiệm creatine kinase (CK), ứng dụng của xét nghiệm CK trong chẩn đoán người mang gen bệnh Đặc biệt trong vài năm trở lại đây đã có một số nghiên cứu ở mức

độ sinh học phân tử, song hầu hết các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột biến trên các đối tượng được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh nhược cơ Duchenne và chưa có nghiên cứu nào xác định người mẹ mang gen để ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh Chính vì vậy, việc nghiên cứu chẩn đoán chính xác người mẹ mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh cần được thực hiện một cách có hệ thống và là một việc làm hết sức cần thiết để sớm đưa ra

tư vấn di truyền nhằm mục đích ngăn ngừa và giảm tỷ lệ mắc bệnh

Hiện nay, Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ đang triển khai áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định các đột biến gây bệnh DMD, xác định người mang gen từ đó ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh Khóa luận này nằm trong khuôn khổ của nghiên cứu trên, được thực hiện tại Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ từ ngày 01/02/2010 đến ngày

31/05/2010 và được mang tên là “Thiết lập kỹ thuật khảo sát Short Tandem Repeat trong phân tích liên kết gen gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Khóa luận này được tiến hành với mục tiêu tối ưu hóa các thông số cho việc khảo sát

Short Tandem Repeat (STR) trong phân tích liên kết gen dystrophin

1.3 Nội dung thực hiện

Thực hiện phản ứng multiplex PCR nhằm xác định giới tính thai nhi trước khi khảo sát STR – PCR

Xác định các thông số tối ưu cho việc khảo sát STR trong phân tích liên kết gen

dystrophin với 3 cặp mồi đặc hiệu

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lược sử về bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne

Tháng 12-1851, Edward-Meryon, một thầy thuốc người Anh mô tả chi tiết về 8 trẻ trong

3 gia đình mắc cùng một bệnh với đặc điểm loạn dưỡng cơ Năm 1861, Guillaume Benjamin Duchenne de Boulogne, một nhà thần kinh học người Pháp – đã mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai, phân biệt với các bệnh cơ khác nhau và sau đó, bệnh được mang tên ông Năm 1879, Gowers thu thập dữ liệu ở 220 bệnh nhân và mô tả bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết

Trong một thời gian dài hơn 100 năm bệnh DMD được đánh giá chủ yếu chỉ ở mức độ lâm sàng và những chăm sóc hỗ trợ trong quá trình mắc bệnh đối với bệnh nhân Trước và sau năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặc biệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzyme CK

để phục vụ cho điều trị và tư vấn di truyền

Năm 1981, Zatz và cộng sự đã phát hiện gen dystrophin nằm ở vị trí Xp21 Tiếp theo, giai đoạn 1984 – 1987 Hoffman và các cộng sự đã phát hiện gen dystrophin và sản phẩm protein tương ứng của gen Năm 1987 – 1988, các nhà nghiên cứu mới chỉ biết gen dystrophin gồm 60 exon Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện đầy đủ

gồm 79 exon với kích thước 2400 kb

Đến nay, đặc điểm phân tử của bệnh ngày càng được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen

đã và đang được các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng nề của bệnh

2.2 Tổng quan về bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne

2.2.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne

Các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhi thường xuất hiện lúc 3 – 5 tuổi Trẻ thường chậm biết đi và không chạy được một cách bình thường, trẻ có nhiều cử động nhưng tiến về phía trước thì rất khó, vì trẻ không nâng đầu gối lên một cách thích hợp được; dáng đi lạch bạch và

đi nhón chân xuất hiện sớm

Dần dần bệnh nhân đi lại, trèo cầu thang và đứng dậy khi đang ngồi ghế đều khó khăn, cột sống ưỡn quá mức để giữ thăng bằng

Trẻ thường dễ bị ngã khi xô đẩy, chen lấn, sau đó khó dậy được Để ngồi và đứng dậy được, trẻ thường dùng thao tác đặc trưng (dấu hiệu Gowers): trẻ lăn cuộn mình để quỳ, vươn cẳng tay chống xuống đất để nâng mông lên và làm chân duỗi thẳng, sau đó chuyển tay về đầu gối và đẩy nâng người lên (thao tác trèo trên thân mình) Triệu chứng này có thể gặp trong những bệnh khác như yếu thân và gốc chi (bệnh teo cơ do tủy sống)

Hình 2.1 Dấu hiệu Gowers (Nguồn: http://neuromuscular.wustl.edu)

Giai đoạn sau, phản xạ gối có thể mất nhưng vẫn còn phản xạ gót, điều này chứng minh

do sự yếu cơ gốc chi

Giai đoạn tiến triển, tay và bàn tay cũng bị ảnh hưởng Có thể gặp yếu nhẹ cơ bám da mặt, nhưng nói, nuốt và vận động nhãn cầu vẫn bình thường Co cứng cơ chậu, đùi và cơ chày làm hạn chế động tác gấp khớp háng, co cứng gân gót góp phần tạo nên dáng đi nhón chân Vào tuổi 9 – 12, trẻ không đi được nữa và phải ngồi xe đẩy, cột sống bị vẹo, co cứng khuỷu

tay và đầu gối làm trẻ bị tàn tật nặng nề Khoảng 20 tuổi cơ hô hấp bị yếu, nên dễ viêm phổi

và suy hô hấp, cơ tim bị tổn thương dẫn đến tử vong

Một thể bệnh nhẹ của DMD là loạn dưỡng cơ Becker (BMD) Bệnh nhân BMD xuất hiện triệu chứng lâm sàng muộn hơn DMD, biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm hơn, có tuổi thọ cao hơn, nhiều trường hợp có thể sống đến 60 tuổi

Hình 2.2 So sánh giữa dạng bình thường và DMD/BMD

(Nguồn: www.humgen.nl)

Việc điều trị DMD/BMD vẫn còn là một vấn đề nan giải Hiện nay liệu pháp gen đang được nghiên cứu để áp dụng điều trị cho bệnh nhân DMD, mục đích là chuyển từ thể nặng DMD sang thể nhẹ BMD để kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân Tuy nhiên đây vẫn còn là những bước đầu thử nghiệm, phương pháp điều trị này rất phức tạp, giá thành cao và hiệu quả còn rất hạn chế Do vậy, phần lớn bệnh nhân vẫn không được điều trị và cuối cùng đều tử vong

2.2.2 Cơ chế di truyền bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne

Đối với cá thể nữ 46,XX có hai nhiễm sắc thể (NST) X, vì thế có hai gen dystrophin

Nếu có một NST X mang gen bị đột biến thì người này vẫn còn một NST X mang gen gen

dystrophin bình thường và vẫn tạo ra dystrophin Vì thế người nữ này có ít hoặc không có

biểu hiện bệnh Tuy nhiên, vì có 50% khả năng truyền gen bệnh cho đời con nên người nữ này được gọi là người mang gen bệnh Trong một số trường hợp hiếm, bệnh biểu hiện ở cá

thể nữ do chỉ có một NST X (hội chứng Turner – 45,X) hoặc do hiện tượng bất hoạt của NST

X bình thường còn lại của cặp XX

Còn đối với cá thể nam, 46, XY chỉ có một NST X nên nếu NST X này mang gen

dystrophin bị đột biến thì người nam sẽ biểu hiện bệnh

Hình 2.3 Kiểu di truyền bệnh DMD (Nguồn: www.mda.org.au)

Người con trai nhận NST Y từ bố và NST X từ mẹ Vì trên NST Y không chứa gen

dystrophin nên protein dystrophin sẽ chỉ được tổng hợp từ gen dystrophin của NST X nhận

được từ mẹ Nếu người con trai này nhận được NST X mang gen bị đột biến thì protein dystrophin được tạo ra sẽ bị khiếm khuyết gây nên bệnh Tuy nhiên con gái lại nhận được NST X từ cả bố và mẹ nên nếu người bố bị bệnh thì sẽ nhận cả gen đột biến và trở thành người mang gen

Mẹ mang gen bệnh Bố bình thường

Con gái

Con trai 25% mang gen 25% bình thường 25% mắc bệnh 25% bình thường

2/3 các trường hợp người nam bị bệnh là do thừa hưởng NST X mang gen đột biến từ

mẹ 1/3 trường hợp người nam bị bệnh, trong khi mẹ của họ không phải là người mang gen đột biến, đó là do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử (Emery, 1993)

Có thể có hai cách giải thích cho trường hợp một gia đình không có tiền sử mắc bệnh DMD lại bất ngờ có một đứa con bị mắc chứng bệnh này: đột biến gen đã xảy ra và di truyền qua các thế hệ phụ nữ của gia đình trong nhiều thế hệ mà không ai hay biết, không có trẻ trai nào được sinh ra bị mắc bệnh hoặc nếu có mắc bệnh thì không được hay được chẩn đoán phù hợp; trẻ bị bệnh DMD là do thừa hưởng đột biến mới, nảy sinh từ một trong các tế bào noãn của quá trình tạo trứng của người mẹ

Trong trường hợp người mẹ dù không mang gen bệnh, một khi sinh con ra với chứng

DMD, bao giờ cũng có thể có khả năng trên tế bào noãn bị đột biến gen dystrophin vì thế

người mẹ này có nguy cơ cao hơn mức bình thường về việc truyền gen đột biến cho một đứa con khác nữa, đứa trẻ này có thể truyền gen bệnh cho thế hệ kế tiếp

2.3 Nguyên nhân gây bệnh

Hình 2.4 Vị trí locus Xp21 (Nguồn: http://cit.nih.gov)

Năm 1986, nguyên nhân gây bệnh đã được xác định là do đột biến gen dystrophin tại

locus Xp21 mã hóa cho protein tên là dystrophin Dystrophin là protein có trọng khối phân tử

427 kD nằm ở mặt trong màng tế bào cơ vân và hoạt động như một yếu tố ổn định chức năng màng, biểu hiện ở cơ xương, cơ tim và vùng não Thiếu dystrophin gây biến đổi thoái hóa cả

hệ cơ xương lẫn hệ cơ tim

Dạng đột biến thường gặp nhất là đột biến mất đoạn, chiếm khoảng 60-65%, đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%, đột biến lặp lại chiếm 10 – 15% Đột biến mất đoạn hay xảy ra tại hai vùng trọng điểm (hotspot region) là vùng 5’ tận cùng (từ exon 3-19), và vùng trung tâm (vùng exon 45-52)

2.3.1 Cấu trúc gen dystrophin

Gen dystrophin có chiều dài 2400 kb, được biết đến là gen có kích thước lớn nhất trong

cơ thể người Gen dystrophin gồm 79 exon và 99,4% cấu trúc gen là intron Gen này phiên

mã cho mRNA có kích thước 14kb tổng hợp nên protein dystrophin có khối lượng phân tử là

427 kDa (Brown và Dickson, 1994)

Đến nay, 7 promoter độc lập đã được xác định nhờ việc kiểm soát phiên mã ở locus DMD bằng những phương pháp đặc hiệu tế bào, bao gồm promoter B (Corticol, C ), M

(Muscle), P (Purkinje), R (Retina), CNS (B3, Brain- 3), S (Schawann) và G (General)

(Matsuo, 1996)

Gen dystrophin mã hóa cho 7 đồng phân protein khác nhau Protein có chiều dài đầy đủ

427 kDa, được phiên mã từ các promoter ở đầu 5’ của gen Mỗi mRNA mã hóa cho protein

427 kDa (Dp427) chỉ khác nhau về trình tự ở đầu N tận Ba sản phẩm protein đó chính là Dp427 (B), Dp427 (M) và Dp427 (P) biểu hiện ở các mô chuyên biệt: B ở não, M ở cơ và P ở

các tế bào Purkinje Các promoter này là: B (Brain), M (muscle), P (Purkinje) Tên của các

promoter này phản ánh vị trí biểu hiện của dystrophin Promoter B biểu hiện ở các tế bào thần kinh vỏ não và vùng hippocampus của não bộ trong khi promoter P biểu hiện ở các tế bào Purkinje và cả cơ xương Promoter M biểu hiện ở mức độ cao tại cơ xương và cơ tim, đồng thời biểu hiện mức độ thấp đối với vài tế bào thần kinh giao cảm (Blake và cộng sự, 2002)

Hình 2.5 Vị trí 79 exon và 8 promoter của gen (Nguồn: Blake và cộng sự, 2002)

Gen dystrophin có ít nhất bốn promoter trong gen, đó chính là retinal (R), brain-3 (B3),

Schwann cell (S), and general(G)

Các promoter S (tế bào Schawann) và G (General hay glial) kiểm soát sự biểu hiện của protein apo-dystrophin Promoter S phiên mã cho một mRNA 5,6 kb mã hóa cho protein 116 kDa (apo-dystrophin 2 hay Dp116) chỉ biểu hiện ở hệ thần kinh ngoại biên của người trưởng thành (Blake và cộng sự, 1995)

Promoter G phiên mã cho ít nhất hai mRNA 4,8 và 2,2 kb có tên là apo-dystrophin 1 và apo-dystrophin 3, mã hóa cho protein ở vùng C tận Dp71 (Ahn và cộng sự, 1993)

Hai bản phiên mã dystrophin bổ sung 260 kDa (Dp260) (Piller và cộng sự, 1993) và 140 kDa (Dp140) (Lodov và cộng sự, 1995) khởi đầu từ các promoter R mới (retina) và B3 (CNS, brain-3)

2.3.2 Cấu trúc và chức năng protein dystrophin

Protein dystrophin gồm 4 vùng (hình 2.8):

- Vùng N-tận: mã hóa bởi exon 1-8, bao gồm khoảng 240 amino acid đầu tiên, vùng này là vị trí bám của actin, bao gồm β-spectrin và α-actinin (Koenig, M và cộng sự, 1988)

- Vùng rod: mã hóa bởi exon 9-64, gồm khoảng 2400 amino acid, thường được coi là vùng ít chức năng nhất, vùng trung tâm của dystrophin bao gồm 24 đoạn lặp lại tương đồng, mỗi đoạn trung bình khoảng 109 amino acid được nối bởi 4 vùng giàu proline không có cấu trúc xoắn giúp dystrophin linh hoạt và đàn hồi (hình 2.8) Tuy nhiên, vùng này thường được coi là vùng ít chức năng nhất

- Vùng giàu cystein: mã hóa bởi exon 65-67, vùng này chứa vị trí bám của dystroglycan (exon 62-67)

β Vùng Cβ tận: mã hóa bởi exon 68β 79, bao gồm 420 amino acid cuối cùng, vùng này chứa vị trí bám của α-syntrophin (exon 73-74) và α-dystrobevin (exon 74-76) (Ahn

và cộng sự, 1993)

Hình 2.6 Vị trí protein dystrophin trên mặt trong màng tế bào cơ vân

(Nguồn: Muscular Dystrophy Association of NSW)

Dystrophin là thành phần chính của các sợi cơ bình thường, định vị ở màng bao cơ với mức đầy đủ ngay khi thai đang phát triển (Arahata và cộng sự, 1988) Ngay từ giai đoạn sớm của sự tạo cơ, những nguyên bào cơ chưa biệt hóa bình thường đã có một lượng dystrophin

Sự xuất hiện dystrophin trùng với việc hòa lẫn một cách tự động các tế bào tạo cơ đơn nhân để hình thành một hợp bào đa nhân sau giảm phân Tuy nhiên, trong loạn dưỡng cơ thì không có hay thiếu hụt nhiều dystrophin, sở dĩ như vậy là do khi các sợi cơ được tái tạo, thoái hóa hay hoại tử thì kích cỡ sợi sẽ bị biến đổi (Miranda và cộng sự, 1988)

Sự vắng mặt của dystrophin không làm chết tức thời tất cả các sợi cơ ở bệnh nhân DMD

và BMD, các chức năng của chúng vẫn được duy trì trong các quá trình tiến triển của bệnh Tuy nhiên, sự tái sinh của các sợi cơ bị hủy hoại không bù đắp được mức độ thoái hóa sợi cơ ngày càng nghiêm trọng dẫn đến bất ổn định sợi cơ (Miller và cộng sự, 1994; Phạm Ngọc Khôi, 2009)

Hình 2.7 Mối liên quan giữa các vùng của dystrophin và

một số phức hợp protein khác (Nguồn: Trần Vân Khánh, 2005)

Vùng N’ tận Vùng rod base cystein Vùng giàu

Vùng C’ tận

Hình 2.8 Sự kết hợp của dystrophin với phức hệ protein trong tế bào cơ

(Nguồn: Blake và cộng sự, 2002)

Sự biểu hiện bệnh DMD và BMD cho đến nay đều do đột biến ở gen mã hóa cho dystrophin Nghiên cứu cho thấy có một vài mối liên quan giữa đột biến gen DMD và kết quả kiểu hình, cho thấy tầm quan trọng trong cấu trúc các vùng của protein dystrophin (Blake và cộng sự, 2002) Tại vùng N tận của dystrophin, tầm quan trọng của vùng gắn actin đã được chứng minh qua việc xác định các đột biến nhầm nghĩa (Arg for Leu-54), kết quả là trong một kiểu hình DMD liên kết với sự sụt giảm lượng protein Hơn nữa, các bệnh nhân DMD được

mô tả bị xóa bỏ các exon 3 – 25 biến đổi khung dịch mã, và sản xuất các protein bị cắt ngắn

Ở vùng rod của dystrophin, đáng chú ý nhất là sự phát hiện một bệnh nhân với một xóa trong khung của 46% của dystrophin trình tự mã hóa mà kết quả chỉ là một trường hợp nhẹ BMD (xóa bỏ các exon 17-48) Quan sát này cho thấy rằng các vùng rod hoạt động như một miếng đệm giữa vùng gắn actin với vùng giàu cysteine và vùng C tận của dystrophin, và cắt ngắn của khu vực này chỉ rút ngắn các cầu nối giữa hai khu vực chức năng mà không ảnh hưởng xấu đến chức năng của protein

Hầu hết các đột biến xóa đoạn tập trung chủ yếu ở hai vùng chính là vùng trung tâm rod (exon 45-53) và vùng N-tận Tuy nhiên kích thước của đột biến xóa đoạn thường không tương xứng với mức độ biểu hiện bệnh trên lâm sàng, một số bệnh nhân với đột biến xóa đoạn rất

ngắn nhưng có biểu hiện bệnh nặng (DMD), ngược lại một số bệnh nhân với đột biến xóa đoạn dài lại biểu hiện bệnh nhẹ (BMD)

Monaco đã đưa ra “thuyết chuyển mã” Theo đó, đột biến trên bệnh nhân DMD thường làm thay đổi khung dịch mã (out of frame) và tạo ra mã kết thúc sớm, kết quả là protein dystrophin không được sản xuất và vắng mặt hoàn toàn ở màng tế bào cơ Trong khi đó, đột biến trên bệnh nhân BMD không làm biến đổi khung dịch mã (in-frame) dẫn đến protein dystrophin được sản xuất ở dạng bán chức năng (semifunctional protein), với một protein có trọng khối phân tử nhỏ hơn do bị đột biến cắt đoạn bên trong gen nhưng vẫn duy trì được mã

di truyền (Trần Vân Khánh, 2005)

2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne

Chẩn đoán bệnh DMD thường dựa vào: tiền sử bản thân và gia đình, khám và phát hiện các triệu chứng lâm sàng, thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán như điện cơ, xét nghiệm enzyme creatine kinase, sinh thiết cơ và chẩn đoán phân tử

2.4.1 Phương pháp chẩn đoán điện

2.4.1.1 Đo tốc độ dẫn truyền vận động

Khi kích thích một dây thần kinh vận động bằng một xung điện, dây thần kinh sẽ bị khử cực tại điểm kích thích, tạo thành một xung thần kinh Xung thần kinh này di chuyển dọc theo dây thần kinh vận động, gây co cơ Điện cực ghi đặt trên bắp cơ ghi được một làn sóng do co

cơ sinh ra

Mục đích của phương pháp này là xác định tình trạng yếu của bệnh nhân bắt nguồn từ

cơ hay các dây thần kinh kiểm soát các cơ này Các dây thần kinh kiểm soát cơ hay là các neurone vận động, bắt nguồn từ não bộ, tủy sống và nối với tất cả các cơ, có thể gây ra tình trạng yếu có vẻ như từ bắp thịt nhưng sự thật lại không phải như vậy (Nguyễn Hữu Công, 2006)

2.4.1.2 Điện cơ (Electromyography, EMG)

Điện cơ là phương pháp dùng một điện cực có hình dáng giống một kim chích để ghi các hoạt động điện của cơ vân Nếu một cơ tăng hoạt động điện do đâm kim và có hoạt động điện

tự phát, thì nghi cơ đó bị mất phân bố thần kinh, căn nguyên do đứt dây thần kinh, hay bệnh dây thần kinh tổn thương sợi trục Điện thế của đơn vị vận động: trong bệnh cơ thì thấp bé và hẹp lại, trong yếu cơ do căn nguyên thần kinh thì cao lớn và rộng ra (Nguyễn Hữu Công, 2006)

2.4.2 Kiểm tra creatine kinase (CK)

Trong giai đoạn đầu của tiến trình chẩn đoán, các bác sĩ thường yêu cầu người bệnh làm xét nghiệm máu đặc biệt gọi là thử nghiệm lượng CK Chữ CK là chữ viết tắt của chữ creatine kinase là loại enzyme xúc tác sự tạo năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tế bào cơ

Creatine kinase Creatine + ATP Phosphocreatine + ADP

Phosphocreatine là dạng dự trữ năng lượng cho hoạt động của cơ và vận chuyển chất trong tế bào cơ

Chẩn đoán bệnh DMD thường dựa vào hoạt độ CK trong máu Ở bệnh nhân DMD, gen

dystrophin bị đột biến làm thay đổi cấu trúc protein dystrophin trên màng tế bào, dẫn đến tổn

thương màng tế bào cơ và giải phóng một lượng lớn CK vào máu Trong bệnh DMD, hoạt độ

CK tăng cao ít nhất 40 lần so với bình thường (bình thường <200 UI/L) Tuy nhiên, ở giai đoạn muộn của quá trình bệnh, hoạt độ enzyme này giảm thấp, nguyên nhân là do vào giai đoạn cuối khối cơ còn lại quá ít nên lượng cơ bị thoái hóa cũng ít

2.4.3 Sinh thiết cơ

Làm sinh thiết cơ là một thủ thuật lấy một mẫu thử nghiệm nhỏ từ cơ của người bệnh sẽ được sinh thiết bằng một kim nhỏ Sau đó, mẫu mô này sẽ được nhuộm để kiểm tra sự hiện diện của dystrophin trên mô bào Qua việc xét nghiệm mẫu thử này, các bác sĩ có thể biết rõ hơn về những gì thực sự đang xảy ra bên trong các cơ Điều này có thể giúp xác định hoặc chứng bệnh là DMD (không có dystrophin) hay BMD (có một ít dystrophin) (Muscular Dystrophy Association of NSW, 2006)

Sinh thiết cơ là phương pháp có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán, tuy nhiên đây là phương pháp xâm lấn và rất khó làm lặp lại trên cùng một bệnh nhân Ngoài ra nhiều khi kết quả cũng không thật rõ ràng (Nguyễn Hữu Công, 2009)

2.4.4 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch

Trong những năm gần đây hóa mô miễn dịch được sử dụng trong các phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh như là một phương pháp nhuộm đặc biệt để giúp chẩn đoán bệnh và xác định tác nhân gây nhiễm khuẩn Kỹ thuật này cho phép quan sát được sự hiện diện của kháng nguyên trên lát cắt mô Như vậy các nhà bệnh học có thể quan sát và đánh giá được cả hai phương diện hình thái học và phenotyp miễn dịch trên mô hay tế bào Kỹ thuật này có thể được thực hiện trên khối nến và quan sát dưới kính hiển vi quang học, không cần phải dùng mẫu mô tươi cũng như kính hiển vi huỳnh quang

Hóa mô miễn dịch là kết hợp phản ứng miễn dịch và hóa chất để làm hiện rõ các kháng nguyên (KN) hiện diện trong mô (bào tương, màng tế bào, nhân) Vì kháng nguyên không thể quan sát hình thái được nên người ta phải xác định vị trí của nó trên tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học Cho kháng thể (KT) đặc hiệu lên mô, nếu trong mô có kháng nguyên sẽ

có phản ứng kết hợp KN - KT Có 2 cách để quan sát được phức hợp này: miễn dịch huỳnh quang: cho gắn với một chất phát huỳnh quang và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang; miễn dịch men: cho gắn với một loại men (peroxidase hoặc alkaline phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen), có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học (Hứa Thị Ngọc Hà và

Huỳnh Ngọc Linh, 2001)

2.4.5 Kỹ thuật Western blot

Western blot (hay immunoblot) là phương pháp kết hợp giữa sinh học phân tử với sinh hóa và miễn dịch, nhằm phát hiện protein quan tâm trong một mẫu mô được chiết tách Sau

đó, các protein này sẽ được chuyển thẩm từ hệ gel lên bộ màng nitrocellulose Các protein trên màng tiếp tục được lai với các kháng thể chuyên biệt

Protein quan tâm trong mẫu được phân tách theo khối lượng phân tử bằng điện di trên gel Một thang hỗn hợp protein có sẵn sẽ giúp xác định khối lượng phân tử protein quan tâm Sau đó, protein được chuyển thẩm tách từ gel lên màng nitrocellulose để có thể được phát

hiện bằng kháng thể Các protein tích điện di chuyển từ trong gel vào màng, nhưng vẫn duy trì tổ chức của chúng có trong gel Kết quả của quá trình là sự hiện diện của protein trên bề mặt màng, giúp cho việc chẩn đoán bệnh (Phan Kim Ngọc, 2007)

2.4.6 Chẩn đoán di truyền phân tử

Các phương pháp chẩn đoán phân tử có thể cho phép phát hiện được các gen đột biến Với khả năng phát hiện đột biến mất đoạn và lặp đoạn lên đến 70% những trường hợp mắc bệnh DMD, phương pháp chẩn đoán phân tử đã được đánh giá cao hơn hẳn so với các phương pháp truyền thống khác (Prior, 2005)

Các nhóm nghiên cứu trên thế giới thường dùng kỹ thuật này để chẩn đoán bệnh DMD

vì cho kết quả nhanh và hiệu quả hơn hẳn Với kỹ thuật này, có thể phát hiện đột biến gen

dystrophin tỷ lệ chính xác là 98% khi sử dụng khoảng 20 cặp mồi (Prior, 2005)

Dựa vào các sản phẩm multiplex PCR, các kỹ thuật dùng để chẩn đoán đột biến điểm trên bệnh nhân DMD đã được phát triển như: kỹ thuật phân tích dựa vào sự đa dạng cấu hình của chuỗi đơn (Single strand conformation polymorphism, SSCP), kỹ thuật phân tích dựa vào

đa dạng cấu hình mạch đôi (Double strand conformation polymorphism, DSCP), phân tích dị kép (Heteroduplex analysis, HDA) (Phan Kim Ngọc, 2007; Trần Nguyễn An Phú, 2007)

2.4.6.2 Kỹ thuật Southern blot

Southern blot là phương pháp thấm mao quản hay thấm qua hút chân không để chuyển toàn bộ các vạch DNA trên gel điện di qua màng nitrocellulose Mục đích là dùng các đoạn

dò đặc hiệu gen DMD muốn tìm đã đánh dấu enzyme hay đồng vị phóng xạ phủ trên màng

nitrocellulose để tìm vị trí của đoạn DNA có mang trình tự đặc hiệu gen DMD DNA bộ gen được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bởi một hay nhiều enzyme giới hạn, các đoạn này được phân tách dựa vào kích thước qua điện di trên gel Sau đó DNA được làm biến tính ngay trên gel rồi được chuyển lên một màng lai Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn vẫn được giữ nguyên DNA cố định trên màng được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng

xạ Sau quá trình lai, đem rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997)

Các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng phương pháp này với các clon cDNA của

gen dystrophin dùng để phát hiện các đột biến mất đoạn và lặp đoạn một cách chính xác Tuy

nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi cần có chất đồng vị phóng xạ, nồng độ phân tử DNA cao và thời gian tiến hành kéo dài, nên kỹ thuật này cũng gặp phải những hạn chế nhất định Về sau, kỹ thuật multiplex PCR được Chamberlain phát triển thành phương tiện chẩn đoán nhanh hơn và cho kết quả chính xác (Prior, 2005; Phạm Ngọc Khôi, 2009)

2.4.6.3 Kỹ thuật điện di trên gel biến tính (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)

Kỹ thuật điện di trên gel biến tính tuyến tính (Denaturing gradient gel electrophoresis - DGGE) được Myers và cộng sự mô tả lần đầu vào năm 1987 khi điện di phân tử DNA mạch đôi trên gel polyacrylamide có chứa các chất biến tính như formamide và urea với nồng độ tăng dần Sự phân tách của đoạn DNA dựa trên cách thức nóng chảy của phân tử Nhiệt độ mà tại đó đoạn DNA tách ra gọi là nhiệt độ nóng chảy phụ thuộc vào trình tự của chuỗi DNA Tại điểm phân tử DNA trải qua sự biến tính một phần thì sự di chuyển của nó trên gel rất chậm Nhờ đó mà 2 đoạn DNA mạch đôi khác nhau chỉ một nucleotide có thể được phân biệt do sự

di chuyển khác nhau giữa các đoạn này trên gel

Kỹ thuật này có thể cho phép khảo sát đoạn DNA từ 50-1000 bp với thời gian chạy điện

di từ 7,5-10 giờ Sau khi nhuộm ethidium bromide và phát hiện bất thường thì tiến hành các phân tích tiếp theo bằng các kỹ thuật khác để xác định bản chất của đột biến Nhược điểm của

phương pháp này là tốn kém, đòi hỏi máy móc chuyên dụng (Trần Nguyễn An Phú, 2007)

2.4.6.4 Kỹ thuật PCR phiên mã ngược (Reverse transcriptase-PCR, RT-PCR)

RT-PCR là phương pháp PCR mà nucleic acid đích cần phải phát hiện là RNA Để có thể thực hiện được PCR này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược thành cDNA, rồi sau đó sẽ dùng PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này Giai đoạn phiên mã ngược là một giai đoạn hết sức quan trọng, quyết định sự thành công của RT-PCR Enzyme được sử dụng trong giai đoạn này là Reverse transcriptase

Để enzyme này có thể tổng hợp được cDNA từ sợi khuôn là mạch đơn RNA, cần phải có mồi đặc hiệu bám lên trên sợi khuôn RNA và cũng cần dNTP để enzyme reverse transcriptase khi trượt lên trên mạch khuôn RNA có thể kéo dài được mạch cDNA

Đối tượng của RT-PCR là RNA đích Bản chất của RNA là rất dễ bị phân hủy trong môi trường cũng như bị enzyme RNAse tiết ra từ các vi sinh vật trong môi trường, chai lọ, thiết bị, Bên cạnh đó, RNAse lại rất bền và khó phân hủy bởi nhiệt độ Chính vì những lý do này RT-PCR là một kỹ thuật không dễ thực hiện để chẩn đoán bệnh (Phạm Hùng Vân, 2009)

2.4.6.5 Kỹ thuật kiểm tra sự cắt ngắn protein (Protein truncation test, PTT)

Kỹ thuật kiểm tra sự cắt ngắn protein PTT được dùng để phát hiện đột biến trong một vài bệnh lý di truyền dựa vào sự phát hiện các đột biến điểm ở giai đoạn sớm của cuối quá trình dịch mã Kỹ thuật này cho độ nhạy tốt, tỷ lệ dương tính giả thấp (Den Dunnen, và cộng sự, 1999)

Nguyên tắc của kỹ thuật PTT: thực hiện phản ứng RT-PCR để tổng hợp nên cDNA, từ cDNA này tổng hợp protein qua hai bước: phiên mã thành mRNA sau đó dịch mã thành protein Protein lúc này được đánh dấu bằng các amino acid (chất phóng xạ hay biotin) Quan sát các protein được đánh dấu phóng xạ này bằng phóng xạ tự ghi (autoradiography), quan sát bằng kỹ thuật Western blot đối với protein được đánh dấu bằng biotin (Saad, 1994)

2.4.6.6 Kỹ thuật lai tại chỗ có gắn huỳnh quang (Flourescent in situ hybridization, FISH)

FISH là phương pháp sử dụng probes acid nucleic để phát hiện các DNA hoặc RNA đích trong mẫu cắt của mô, tế bào hoặc nhiễm sắc thể Nguyên lý cơ bản là khả năng gắn đặc hiệu của DNA hoặc RNA mạch đơn với trình tự bổ sung để hình thành phân tử lai mạch kép

Probe có thể được đánh dấu phóng xạ hoặc không phóng xạ (ví dụ đánh dấu huỳnh quang) (Voskova-Goldman và cộng sự, 1997)

Đây là một phương pháp xét nghiệm chính xác và nhạy, nó được coi là một xét nghiệm tiêu chuẩn với độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện sự khuyếch đại bất thường của gen Tuy nhiên phương pháp này cũng có những bất lợi, đó là giá thành cao, cần những thiết bị đắt tiền, việc đọc kết quả khó khăn hơn do có những dấu hiệu hình thái học đôi khi khó ghi nhận, mất nhiều thời gian hơn, phải quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, và vì nhuộm huỳnh quang nhanh bay màu nên không bảo quản lâu được để có thể xem lại (Ross và cộng sự, 1998)

2.4.6.7 Kỹ thuật lai nhiều probe khuếch đại (Multiplex amplifiable probe hybridization, MAPH)

MAPH là kỹ thuật dựa vào phản ứng PCR định lượng các probe ngắn được phục hồi sau quá trình lai để giữ cố định DNA của hệ gen trên màng nitrocellulose Mỗi probe DNA sẽ đại diện cho một exon đã được khuếch đại và clon vào một vector đặc hiệu Thay cho việc phải tái khuếch đại sử dụng nhiều cặp mồi cho nhiều vị trí clon thì giờ đây ta có thể cùng một lúc khuếch đại tất cả các probe này trong cùng một phản ứng mà chỉ sử dụng duy nhất một cặp mồi mà thôi Người ta thường chia các exon của gen DMD thành hai nhóm riêng lẻ cho từng phản ứng một Với 1 µg DNA biến tính sẽ được đem lai trên một màng nitrocellulose nhỏ và chúng được cho lai qua đêm trong dung dịch chứa một trong các probe của gen DMD Sau

đó, chúng sẽ được rửa một cách nghiêm ngặt vào ngày tiếp theo nhằm loại bỏ các probe lai không đặc hiệu và tất cả các probe sau khi đã được rửa sạch sẽ được cho vào một tube PCR

để chạy phản ứng PCR định lượng và phân tích bằng hệ thống điện di mao quản với các mồi PCR đã được đánh dấu huỳnh quang trước đó Bằng việc so sánh kết quả các đỉnh sau khi chạy điện di mao quản giữa mẫu kiểm tra và mẫu chứng mà người phân tích có thể kết luận

có hay không việc mất từng exon một hay lặp đoạn mà các phương pháp chẩn đoán khác khó biết được (White, 2006; Phạm Ngọc Khôi, 2009)

2.4.6.8 Kỹ thuật khuếch đại nhiều probe phụ thuộc quá trình nối (Multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)

Kỹ thuật MLPA được mô tả lần đầu tiên vào năm 2002 bởi Jan P Schouten và cộng sự Đây là kỹ thuật cho phép chẩn đoán di truyền phân tử tốt nhất hiện nay, bởi vì nó cho phép phát hiện được các trường hợp mất đoạn, lặp đoạn một cách chính xác và hiệu quả mà ít kỹ thuật nào có thể phát hiện được

Kỹ thuật MLPA có khả năng khuếch đại 45 vị trí DNA đích khác nhau trong một phản ứng

Hình 2.10 So sánh kỹ thuật MLPA với các kỹ thuật sinh học phân tử khác

Kỹ thuật MLPA cho phép phát hiện đột biến với một giới hạn lớn hơn, phù hợp với các kích thước genome thay đổi từ đột biến điểm đến hay mất đoạn

và lặp đoạn NST (Nguồn: www.mlpa.com)

Mỗi probe MLPA gồm hai đoạn oligonucleotide lai với trình tự DNA đích tại vị trí liền

kề với nhau, dài 22-43 nucleotide và một mồi xuôi PCR hoặc ngược giống nhau ở tất cả các probe Để phân biệt sản phẩm khuếch đại, các probe còn chứa một đoạn DNA gắn chèn không tham gia vào lai có kích thước thay đổi (19-364 nt) Sau khi lai qua đêm với trình tự DNA đích, hai đoạn oligonucleotide của mỗi probe sẽ nối ghép (ligation) với nhau Sản phẩm nối có cả mồi xuôi và ngược được khuếch đại bằng PCR Số lượng tương đối của mỗi sản phẩm PCR sẽ tỷ lệ với số bản sao của trình tự đích trong mẫu khảo sát Kích thước khác nhau

của các sản phẩm sẽ được nhận biết bằng hệ thống điện di mao quản và đỉnh của mỗi sản phẩm sẽ được định lượng

Hình 2.11 Quy trình MLPA (Nguồn: www.mlpa.com)

2.4.6.9 Phân tích liên kết gen

Mục đích của việc sử dụng các kỹ thuật phân tích liên kết gen trong chẩn đoán bệnh DMD là nhằm xác định nguồn gốc gen đột biến, khi mà không thể phát hiện được ở các trường hợp mắc bệnh

(1) Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism, RFLP)

Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, phân tách qua điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt Sự khác biệt vị trí cắt giữa

hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau RFLP có ưu điểm là chỉ thị đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp

Hạn chế của phương pháp này là phải có mẫu thử nhiều tế bào để có thể trích được bộ gen nguyên vẹn (phải lấy không dưới 10 ml máu để có đủ bạch cầu dùng trong tách chiết bộ gen), quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng đánh dấu phóng xạ)

(2) Trình tự lặp lại ngắn (Short Tandem Repeats, STR)

STR còn gọi là Microsattelite hay Simple Sequence Repeats (SSRs) là các trình tự có kích thước nhỏ dưới 1000 base tạo nên bởi các trình tự lõi khoảng 2 đến 4 base được lặp lại nhiều lần (từ 10 đến 60 lần) STR được thực hiện bằng kỹ thuật PCR Đây là một kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm dựa vào những chu kỳ nhiệt, nhờ đó mà các mẫu thử dù chứa DNA với số lượng rất ít vẫn có thể nhân bản thành nhiều bản sao đặc hiệu giống hệt nhau về kích thước và trình tự Khi một STR được nhân bản bằng kỹ thuật PCR, trong ống nghiệm sẽ có một trong ba loại kiểu hình về kích thước STR tùy thuộc vào STR trong mẫu DNA thử nghiệm là đồng hợp tử vì nhận từ bố và mẹ STR kích thước giống nhau, hay dị hợp

tử vì nhận được STR từ bố có kích thước khác STR nhận từ mẹ Sự phân phối của các kích thước STR trong các cá nhân của một quần thể có thể rất rộng, như vậy sự khác biệt kích thước một loại STR trong loài người rất đa hình

Hiện nay với phương pháp điện di mao quản và sử dụng đa mồi, có thể phân tích được cùng lúc 12 đến 16 loci STR của một mẫu rất dễ dàng (Phạm Hùng Vân, 2009)

Ưu điểm của kỹ thuật này so với RFLP là mẫu thu thập không nhất thiết phải đạt tiêu chuẩn cao, STR – PCR cho tính đa hình cao vì thế kỹ thuật này cho phép đánh giá chính xác hơn, đồng thời STR - PCR gắn huỳnh quang rất tốt, nên rất dễ phát hiện tự động, thuận lợi cho phân tích, bảo quản và dễ phục hồi số liệu

2.5 Tổng quan nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều nơi ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện các đột biến gây bệnh DMD và việc chẩn đoán trước sinh đã được thực hiện rộng rãi