NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: LÂM THIÊN NGỌC Niên khóa: 2006-2010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI Hướng dẫn khoa học ThS PHẠM VĂN PHÚC Sinh viên thực LÂM THIÊN NGỌC Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Sau tháng thực đề tài tốt nghiệp Phòng Thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tơi học tập nhiều điều Đó khơng kiến thức bổ ích tế bào gốc, khơng tác phong nghiên cứu khoa học chuyên nghiệp mà hết tình cảm gắn bó bạn sinh viên với lãnh đạo phòng anh chị cán trẻ Trong suốt thời gian làm đề tài, nhận giúp đỡ từ phía, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Thầy trưởng môn thầy cô thuộc Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh,đã tạo tận tình dạy bảo tơi năm đại học tạo điều kiện để thực đề tài tốt nghiệp theo hướng yêu thích Thầy Phan Kim Ngọc, người tạo điều kiện cho thực đề tài hỏi han, động viên khiến thêm vững niềm tin vào thân Từ tận đáy lòng, tơi biết ơn thầy cầu mong thầy mạnh khỏe để tiếp tục cống hiến cho khoa học nước nhà Thầy Phạm Văn Phúc, người hướng dẫn khoa học sẵn sàng giúp đỡ định hướng cho đề tài Thầy người tạo điều kiện tốt cho tơi q trình thực đề tài người anh thân thiết, động viên tinh thần cho tôi, giúp vượt qua trở ngại để hoàn thành tốt đề tài Thầy Nguyễn Thanh Tâm, người trực tiếp dẫn từ ngày đầu tiến hành đề tài đồng hành tơi suốt qng thời gian sau Tơi học nhiều điều từ thầy sau tháng làm khóa luận, đó, điều quan trọng việc làm, cần có say mê nỗ lực thành cơng chờ đợi ta phía trước Các anh chị Vũ Bích Ngọc, Huỳnh Mỹ Linh, Vương Gia Tuệ, Phạm Quốc Việt bên cạnh tôi, hỗ trợ kiến thức chuyên môn nguồn động lực khiến cố gắng Các anh chị trẻ, nhiệt tình ln sẵn sàng giúp đỡ sinh viên Mong anh chị giữ lửa đam mê khoa học vững bước đường đời Các bạn Đinh Văn Long, Phan Lữ Chính Nhân, bạn nhóm ung thư vú, tế bào mầm tất sinh viên phòng thí nghiệm, bạn giúp đỡ nhiều cho hiểu thêm sống thật tuyệt bên cạnh lúc có người bạn sẵn sàng giúp đỡ Xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ – người cho tơi hội có mặt đời Con mong ba mẹ khỏe Cảm ơn người chị tuyệt vời đứa em bé bỏng Chúc người điều tốt đẹp TÓM TẮT Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh tử vong bệnh tim mạch cao với tần suất 100.000 dân Hiện số ca đột quỵ tăng gấp lần so với 10 năm trước tỷ lệ nhồi máu tim tăng gấp lần so với năm 1960 Vì việc nghiên cứu giải pháp điều trị bệnh tim mạch vấn đề cần thiết Tế bào tiền thân nội mơ loại tế bào gốc đơn năng, có khả biệt hóa thành tế bào nội mơ trưởng thành chuyển biệt hóa thành tế bào trơn in vitro Chúng có vai trò quan trọng sửa chữa mạch máu bị tổn thương hình thành mạch máu Việc nghiên cứu sử dụng tế bào tiền thân nội mô điều trị bệnh tim mạch mở chiến lược chữa trị đầy hứa hẹn Tế bào tiền thân nội mơ thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, máu cuống rốn người nguồn cung cấp tế bào dồi Mục đích nghiên cứu nhằm thiết lập phương pháp hiệu để thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người Đề tài gồm nội dung thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô Tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn thu nhận phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với Ficoll nuôi cấy chọn lọc môi trường khảo sát: M199 + 15% FBS/KS; M199 + 15% FBS/KS + GF; EBM-2 + 15% FBS/KS; EBM-2 + 15% FBS/KS + GF Phương pháp chuyển dịch sau 3, 6, ngày sử dụng để đánh giá hiệu bám dính, tăng sinh tế bào thời điểm chuyển dịch Số lượng tế bào bám dính vào đĩa ni đếm 30 thị trường ngẫu nhiên tính trung bình cộng mẫu Các số liệu trung bình dùng để so sánh môi trường nhằm chọn môi trường tối ưu cho việc phân lập tế bào Sau xác định môi trường nuôi cấy tối ưu (EBM-2 + 15% FBS/KS + GF), việc nuôi cấy chọn lọc tế bào tiền thân nội mô tiến hành môi trường phương pháp chuyển dịch sau 0, 1, 2, 3, 4, 6, ngày Khi tế bào hấp thụ hết chất dinh dưỡng giải phóng chất thải q trình trao đổi chất vào môi trường, tiến hành thay môi trường cho đĩa nuôi Sau tế bào bám trải tạo thành lớp tế bào đơn, tiến hành cấy chuyền để tăng số lượng tế bào cung cấp chất   i dinh dưỡng, không gian cho phát triển tế bào Tế bào tiền thân nội mô xác định dựa vào khả bám dính, tăng sinh, hình thái marker bề mặt (CD133+, CD34+) Kết thu gồm có EBM-2 + 15% FBS/KS + GF mơi trường giúp cho bám dính tăng sinh tế bào ứng viên tốt môi trường khảo sát; chọn lọc thành công tế bào tiền thân nội mơ có khả tăng sinh cao môi trường tối ưu biểu dương tính với marker chọn lọc Chúng tơi kết luận thiết lập thành cơng quy trình thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người môi trường tối ưu EBM-2 + 15% FBS/KS + GF phương pháp chuyển dịch sau ngày     ii SUMMARY In Vietnam, mortality and morbidity rate caused by cardiovascular diseases is rather high (1 per 100.000 people) The number of people who die of stroke increases times than it was 10 years ago In addition, myocardial infarct rate increases times compared to that in 1960s Thus, study to facilitate treatment of cardiovascular disease has been a matter of concern Endothelial progenitor cell is a unipotential stem cell which has a capacity for differentiation to mature endothelial cell and transdifferentiation to smooth muscle cell in vitro It plays an essential role in repairing injured vascular and promoting neovascularization Investigation of using endothelial progenitor cells will create a novel and promising strategy for treatment cardiovascular diseases Endothelial progenitor cells can be isolated from various sources, among which human umbilical cord blood is a tremendous source The aim of this research is to establish a method to efficiently isolate and culture human umbilical cord blood -derived endothelial progenitor cells At first, mononuclear cells were isolated from human umbilical cord blood by gradient centrifugation made by Ficoll Then these cells were cultured on selective media to isolate endothelial progenitor cells There were different media M199 + 15% FBS/antibiotic-antimycotic; M199 + 15% FBS/antibiotic-antimycotic + GF; EBM-2 + 15% FBS/antibiotic-antimycotic; EBM-2 + 15% FBS/antibioticantimycotic + GF Every day the supernatant was changed, and the number of attached cells was counted at 30 random fields to estimate the capacity of cell proliferation Then, the averages of total samples were used to compare among media to examine which one is best for cell adhesion and proliferation The result indicated the most successfully selective culture of endothelial progenitor cells was the last medium (EBM-2 + 15% FBS/KS + GF) We used the identified medium for the next step We changed supernatant every 0, 24, 48, 72, 96, 144, 216 hrs When the culture dish reached to 75-80% cell confluence, cells were harvested using Trypsin/EDTA 0,25% and then cultured in a defined volume of medium Endothelial progenitor cells were identified based on their   iii ability to attach to culture dish, to proliferate, and on their morphology and surface markers In summary, human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells were isolated successfully in optimal medium EBM-2 + 15% FBS/KS + GF by changing supernatant after 24h These cells displayed high potential to proliferate and express specific markers                                           iv MỤC LỤC Bìa Bìa phụ Lời cảm ơn Tóm tắt i Summary iii Mục lục v Danh mục bảng vii Danh sách biểu đồ viii Danh mục chữ viết tắt ix Danh sách hình xi Danh sách sơ đồ xii Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Ý nghĩa đề tài 1.3 Nội dung thực Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tế bào gốc 2.2.1 Định nghĩa 2.2.2 Phân loại 2.2.3 Ứng dụng 2.2 Sinh học cuống rốn 2.2.1 Cấu tạo phát triển cuống rốn 2.2.2 Ưu sử dụng nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn 2.3 Tế bào tiền thân nội mô 2.3.1 Định nghĩa 2.3.2 Lịch sử nghiên cứu tế bào tiền thân nội mô 10 2.3.3 Đặc điểm 13   v 2.3.4 Nguồn thu nhận 16 2.3.5 Nuôi cấy EPC 20 2.3.6 Ứng dụng 22 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 25 3.1.1 Thời gian 25 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 25 3.2 Vật liệu 25 3.2.1 Mẫu vật 25 3.2.2 Dụng cụ 26 3.2.3 Thiết bị 27 3.2.4 Hóa chất 28 3.3 Phương pháp nghiên cứu 30 3.3.1 Nội dung 1: Thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người 30 3.3.1 Nội dung 2: Nuôi cấy chọn lọc EPC 32 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 Hiệu bám dính, tăng sinh tế bào tiền thân nội mô môi trường khảo sát 39 4.2 So sánh tương quan số lượng tế bào tối ưu môi trường 48 4.3 Khảo sát phương pháp nuôi cấy tối ưu EPC ứng viên EGM-2 49 4.4 Khẳng định tế bào tiền thân nội mô ứng viên tế bào tiền thân nội mô 52 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Phụ lục             vi Beltinger, 2003, “Endothelial progenitor cell culture and differentiaion in vitro: a methodological comparison using human umbilical cord blood”, Cardiovascular Research, 58:478-486 13 Lindsey Tilling, Philip Chowienczyk, Brian Clapp, 2009, “Progenitors in motion: mechenisms of mobilization of endothelial progenitor cells” , British Journal of Clinical Pharmacology, 484–492 14 Mihail Hristov, Wolfgang Erl, Peter C.Weber, 2003, “Endothelial progenitor cells: isolation and characterization”, Elsevier Inc.,13:201-205 15 Mihail Hristov, Wolfgang Erl, Peter C Weber, 2003, “Endothelial progenitor cells: mobilization, differentiation and homing”, Journal of the American Heart Association, 23:1185-1189 16 National Academy of Sciences, National Academy of Engineering, Institute of Medicine, National Research Council, “Understanding stem cells”, 29 pages 17 Patricia Pranke and Raquel Canabarro, 2009, “Frontiers of cord blood science”, chương “Stem cells from umbilical cord blood”, Springer London, 27-90 18 Robert Lanza, John Gearhart, Brigid Hogan, 2006, “Essential of stem cell biology”, Elsevier Inc., 548 pages 19 Stewart Sell, 2004, “Stem cell handbook”, Human Press Inc, 509 pages TRANG WEB THAM KHẢO 20 http://content.nejm.org/cgi/content/short/348/7/593 21 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15862317 22 http://www.dhzb.de/fileadmin/user_upload/englische_Seite/science_research/tissu e_engineering/te_01.gif 23 http://www.patentlens.net/daisy/Telomerase/2951/version/default/part/ImageData/ data/stemcell_figure3_lg.jpg 56     PHỤ LỤC Tỷ lệ tế bào bám môi trường khảo sát a) Môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS Summary Statistics Count Average Variance Standard deviation Minimum -G1_3 10 39,8 23,7333 4,87169 32,0 G1_6 10 19,4 16,2667 4,0332 13,0 G1_9 10 7,7 3,12222 1,76698 5,0 G2_3 10 67,2 40,4 6,3561 60,0 G2_6 10 87,8 54,8444 7,4057 75,0 G2_9 10 30,5 2,05556 1,43372 29,0 G3_3 10 15,1 9,43333 3,07137 10,0 G3_6 10 9,6 9,37778 3,06232 5,0 G3_9 10 3,7 8,67778 2,94581 ,0 -Total 90 31,2 775,128 27,8411 ,0 Maximum Range Stnd skewness Stnd kurtosis -G1_3 47,0 15,0 -,00893257 -,600461 G1_6 27,0 14,0 ,381749 ,201733 G1_9 10,0 5,0 -,0468014 -,893083 G2_3 81,0 21,0 1,47457 ,820439 G2_6 102,0 27,0 ,320607 ,612712 G2_9 33,0 4,0 ,730095 -,646238 G3_3 20,0 10,0 -,151498 -,455226 G3_6 15,0 10,0 ,461534 -,297117 G3_9 9,0 9,0 ,47388 -,290656 -Total 102,0 102,0 3,91411 -,384657 The StatAdvisor This table shows various statistics for each of the columns of data To test for significant differences amongst the column means, select Analysis of Variance from the list of Tabular Options Select Means Plot from the list of Graphical Options to display the means graphically WARNING: There is more than a to difference between the smallest standard deviation and the largest This may cause problems since the analysis of variance assumes that the standard deviations at all levels are equal Select Variance Check from the list of Tabular Options to run a formal statistical test for differences among the sigmas You may want to consider transforming the data to remove any dependence of the standard deviation on the mean ANOVA Table   Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 67475,2 8434,4 452,08 , Within groups 1511,2 81 18,6568 Total (Corr.) 68986,4 89 The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of the data into two components: a between-group component and a within-group component The F-ratio, which in this case equals 452,082, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate Since the P-value of the F-test is less than ,05, there is a statistically significant difference between the means of the variables at the 95,0% confidence level To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options Multiple Range Tests -Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -G3_9 10 3,7 X G1_9 10 7,7 X G3_6 10 9,6 X G3_3 10 15,1 X G1_6 10 19,4 X G2_9 10 30,5 X G1_3 10 39,8 X G2_3 10 67,2 X G2_6 10 87,8 X -Contrast Difference +/- Limits -G1_3 - G1_6 *20,4 3,84343 G1_3 - G1_9 *32,1 3,84343 G1_3 - G2_3 *-27,4 3,84343 G1_3 - G2_6 *-48,0 3,84343 G1_3 - G2_9 *9,3 3,84343 G1_3 - G3_3 *24,7 3,84343 G1_3 - G3_6 *30,2 3,84343 G1_3 - G3_9 *36,1 3,84343 G1_6 - G1_9 *11,7 3,84343 G1_6 - G2_3 *-47,8 3,84343 G1_6 - G2_6 *-68,4 3,84343 G1_6 - G2_9 *-11,1 3,84343 G1_6 - G3_3 *4,3 3,84343 G1_6 - G3_6 *9,8 3,84343 G1_6 - G3_9 *15,7 3,84343 G1_9 - G2_3 *-59,5 3,84343 G1_9 - G2_6 *-80,1 3,84343 G1_9 - G2_9 *-22,8 3,84343 G1_9 - G3_3 *-7,4 3,84343   G1_9 - G3_6 -1,9 3,84343 G1_9 - G3_9 *4,0 3,84343 G2_3 - G2_6 *-20,6 3,84343 G2_3 - G2_9 *36,7 3,84343 G2_3 - G3_3 *52,1 3,84343 G2_3 - G3_6 *57,6 3,84343 G2_3 - G3_9 *63,5 3,84343 G2_6 - G2_9 *57,3 3,84343 G2_6 - G3_3 *72,7 3,84343 G2_6 - G3_6 *78,2 3,84343 G2_6 - G3_9 *84,1 3,84343 G2_9 - G3_3 *15,4 3,84343 G2_9 - G3_6 *20,9 3,84343 G2_9 - G3_9 *26,8 3,84343 G3_3 - G3_6 *5,5 3,84343 G3_3 - G3_9 *11,4 3,84343 G3_6 - G3_9 *5,9 3,84343 -* denotes a statistically significant difference The StatAdvisor This table applies a multiple comparison procedure to determine which means are significantly different from which others The bottom half of the output shows the estimated difference between each pair of means An asterisk has been placed next to 35 pairs, indicating that these pairs show statistically significant differences at the 95,0% confidence level At the top of the page, homogenous groups are identified using columns of X's Within each column, the levels containing X's form a group of means within which there are no statistically significant differences The method currently being used to discriminate among the means is Fisher's least significant difference (LSD) procedure With this method, there is a 5,0% risk of calling each pair of means significantly different when the actual difference equals sample Box-and-Whisker Plot G1_3 G1_6 G1_9 G2_3 G2_6 G2_9 G3_3 G3_6 G3_9 20 40 60 80 100 response b) Môi trường M199 bổ sung 15% FBS/KS + GF Summary Statistics   120 Count Average Variance Standard deviation Minimum -G1_3 10 104,8 26,1778 5,11642 98,0 G1_6 10 70,4 23,3778 4,83506 63,0 G1_9 10 39,2 35,9556 5,9963 29,0 G2_3 10 105,1 30,9889 5,56677 98,0 G2_6 10 189,8 67,0667 8,18942 177,0 G2_9 10 52,8 75,2889 8,67692 39,0 G3_3 10 48,2 43,0667 6,56252 39,0 G3_6 10 33,6 39,1556 6,25744 24,0 G3_9 10 13,2 21,0667 4,58984 6,0 -Total 90 73,0111 2619,16 51,1777 6,0 Maximum Range Stnd skewness Stnd kurtosis -G1_3 115,0 17,0 ,861392 ,297205 G1_6 80,0 17,0 ,651782 ,508996 G1_9 49,0 20,0 -,0999981 -,263363 G2_3 115,0 17,0 ,319429 -,440906 G2_6 205,0 28,0 ,644513 ,154332 G2_9 67,0 28,0 -,21995 -,229356 G3_3 61,0 22,0 ,611179 ,111561 G3_6 45,0 21,0 ,328966 -,132257 G3_9 21,0 15,0 ,271036 -,160019 -Total 205,0 199,0 4,41334 1,17693 The StatAdvisor This table shows various statistics for each of the columns of data To test for significant differences amongst the column means, select Analysis of Variance from the list of Tabular Options Select Means Plot from the list of Graphical Options to display the means graphically ANOVA Table Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 229846,0 28730,7 714,01 , Within groups 3259,3 81 40,2383 Total (Corr.) 233105,0 89 The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of the data into two components: a between-group component and a within-group component The F-ratio, which in this case equals 714,015, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate Since the P-value of the F-test is less than ,05, there is a statistically significant difference between the means of the variables at the   95,0% confidence level To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options Multiple Range Tests -Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -G3_9 10 13,2 X G3_6 10 33,6 X G1_9 10 39,2 X G3_3 10 48,2 X G2_9 10 52,8 X G1_6 10 70,4 X G1_3 10 104,8 X G2_3 10 105,1 X G2_6 10 189,8 X -Contrast Difference +/- Limits -G1_3 - G1_6 *34,4 5,64443 G1_3 - G1_9 *65,6 5,64443 G1_3 - G2_3 -,3 5,64443 G1_3 - G2_6 *-85,0 5,64443 G1_3 - G2_9 *52,0                 5,64443             G1_3 - G3_3 *56,6 5,64443 G1_3 - G3_6 *71,2 5,64443 G1_3 - G3_9 *91,6 5,64443 G1_6 - G1_9 *31,2 5,64443 G1_6 - G2_3 *-34,7 5,64443 G1_6 - G2_6 *-119,4 5,64443 G1_6 - G2_9 *17,6 5,64443 G1_6 - G3_3 *22,2 5,64443 G1_6 - G3_6 *36,8 5,64443 G1_6 - G3_9 *57,2 5,64443 G1_9 - G2_3 *-65,9 5,64443 G1_9 - G2_6 *-150,6 5,64443 G1_9 - G2_9 *-13,6 5,64443 G1_9 - G3_3 *-9,0 5,64443 G1_9 - G3_6 5,6 5,64443 G1_9 - G3_9 *26,0 5,64443 G2_3 - G2_6 *-84,7 5,64443 G2_3 - G2_9 *52,3 5,64443 G2_3 - G3_3 *56,9 5,64443 G2_3 - G3_6 *71,5 5,64443 G2_3 - G3_9 *91,9 5,64443 G2_6 - G2_9 *137,0 5,64443 G2_6 - G3_3 *141,6 5,64443 G2_6 - G3_6 *156,2 5,64443 G2_6 - G3_9 *176,6 5,64443 G2_9 - G3_3 4,6 5,64443 G2_9 - G3_6 *19,2 5,64443 G2_9 - G3_9 *39,6 5,64443 G3_3 - G3_6 *14,6 5,64443 G3_3 - G3_9 *35,0 5,64443   G3_6 - G3_9 *20,4 5,64443 -* denotes a statistically significant difference The StatAdvisor This table applies a multiple comparison procedure to determine which means are significantly different from which others The bottom half of the output shows the estimated difference between each pair of means An asterisk has been placed next to 33 pairs, indicating that these pairs show statistically significant differences at the 95,0% confidence level At the top of the page, homogenous groups are identified using columns of X's Within each column, the levels containing X's form a group of means within which there are no statistically significant differences The method currently being used to discriminate among the means is Fisher's least significant difference (LSD) procedure With this method, there is a 5,0% risk of calling each pair of means significantly different when the actual difference equals sample Box-and-Whisker Plot G1_3 G1_6 G1_9 G2_3 G2_6 G2_9 G3_3 G3_6 G3_9 40 80 120 160 200 240 response c) Môi trường EBM bổ sung 15% FBS/KS Summary Statistics Count Average Variance Standard deviation Minimum -G1_3 10 130,8 24,1778 4,91709 125,0 G1_6 10 208,9 88,3222 9,39799 198,0 G1_9 10 415,2 2853,29 53,4162 366,0 G2_3 10 190,3 298,011 17,263 150,0 G2_6 10 402,2 915,067 30,2501 362,0 G2_9 10 84,6 181,6 13,4759 68,0 G3_3 10 42,5 70,7222 8,40965 33,0 G3_6 10 89,1 160,322 12,6618 63,0 G3_9 10 25,6 80,0444 8,94676 16,0 -Total 90 176,578 19355,3 139,123 16,0 Maximum   Range Stnd skewness Stnd kurtosis -G1_3 142,0 17,0 1,76861 1,45028 G1_6 225,0 27,0 ,753785 -,600733 G1_9 555,0 189,0 2,97539 3,96896 G2_3 210,0 60,0 -1,87096 1,77789 G2_6 467,0 105,0 1,29339 ,829996 G2_9 110,0 42,0 1,04818 -,00976369 G3_3 57,0 24,0 ,97589 -,432197 G3_6 110,0 47,0 -,700612 ,947392 G3_9 42,0 26,0 ,887117 -,314916 -Total 555,0 539,0 3,34745 -,869977 The StatAdvisor This table shows various statistics for each of the columns of data To test for significant differences amongst the column means, select Analysis of Variance from the list of Tabular Options Select Means Plot from the list of Graphical Options to display the means graphically WARNING: There is more than a to difference between the smallest standard deviation and the largest This may cause problems since the analysis of variance assumes that the standard deviations at all levels are equal Select Variance Check from the list of Tabular Options to run a formal statistical test for differences among the sigmas You may want to consider transforming the data to remove any dependence of the standard deviation on the mean WARNING: The standardized skewness and/or kurtosis is outside the range of -2 to +2 for columns This indicates some significant nonnormality in the data, which violates the assumption that the data come from normal distributions You may wish to transform the data or use the Kruskal-Wallis test to compare the medians instead of the means ANOVA Table Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1,68058E6 210072,0 404,72 , Within groups 42044,0 81 519,062 Total (Corr.) 1,72262E6 89 The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of the data into two components: a between-group component and a within-group component The F-ratio, which in this case equals 404,716, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate Since the P-value of the F-test is less than ,05, there is a statistically significant difference between the means of the variables at the 95,0% confidence level To determine which means are significantly   different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options Multiple Range Tests -Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -G3_9 10 25,6 X G3_3 10 42,5 X G2_9 10 84,6 X G3_6 10 89,1 X G1_3 10 130,8 X G2_3 10 190,3 X G1_6 10 208,9 X G2_6 10 402,2 X G1_9 10 415,2 X -Contrast Difference +/- Limits -G1_3 - G1_6 *-78,1 20,2726 G1_3 - G1_9 *-284,4 20,2726 G1_3 - G2_3 *-59,5 20,2726 G1_3 - G2_6 *-271,4 20,2726 G1_3 - G2_9 *46,2 20,2726 G1_3 - G3_3 *88,3 20,2726 G1_3 - G3_6 *41,7 20,2726 G1_3 - G3_9 *105,2 20,2726 G1_6 - G1_9 *-206,3 20,2726 G1_6 - G2_3 18,6 20,2726 G1_6 - G2_6 *-193,3 20,2726 G1_6 - G2_9 *124,3 20,2726 G1_6 - G3_3 *166,4 20,2726 G1_6 - G3_6 *119,8 20,2726 G1_6 - G3_9 *183,3 20,2726 G1_9 - G2_3 *224,9 20,2726 G1_9 - G2_6 13,0 20,2726 G1_9 - G2_9 *330,6 20,2726 G1_9 - G3_3 *372,7 20,2726 G1_9 - G3_6 *326,1 20,2726 G1_9 - G3_9 *389,6 20,2726 G2_3 - G2_6 *-211,9 20,2726 G2_3 - G2_9 *105,7 20,2726 G2_3 - G3_3 *147,8 20,2726 G2_3 - G3_6 *101,2 20,2726 G2_3 - G3_9 *164,7 20,2726 G2_6 - G2_9 *317,6 20,2726 G2_6 - G3_3 *359,7 20,2726 G2_6 - G3_6 *313,1 20,2726 G2_6 - G3_9 *376,6 20,2726 G2_9 - G3_3 *42,1 20,2726 G2_9 - G3_6 -4,5 20,2726 G2_9 - G3_9 *59,0 20,2726 G3_3 - G3_6 *-46,6 20,2726 G3_3 - G3_9 16,9 20,2726 G3_6 - G3_9 *63,5 20,2726   -* denotes a statistically significant difference The StatAdvisor This table applies a multiple comparison procedure to determine which means are significantly different from which others The bottom half of the output shows the estimated difference between each pair of means An asterisk has been placed next to 32 pairs, indicating that these pairs show statistically significant differences at the 95,0% confidence level At the top of the page, homogenous groups are identified using columns of X's Within each column, the levels containing X's form a group of means within which there are no statistically significant differences The method currently being used to discriminate among the means is Fisher's least significant difference (LSD) procedure With this method, there is a 5,0% risk of calling each pair of means significantly different when the actual difference equals sample Box-and-Whisker Plot G1_3 G1_6 G1_9 G2_3 G2_6 G2_9 G3_3 G3_6 G3_9 200 400 600 800 1000 response d) Môi trường EBM bổ sung 15% FBS/KS + GF Summary Statistics Count Average Variance Standard deviation Minimum -G1_3 10 255,1 215,878 14,6928 232,0 G1_6 10 584,4 347,378 18,6381 555,0 G1_9 10 860,9 368,989 19,2091 840,0 G2_3 10 387,7 298,233 17,2694 356,0 G2_6 10 555,4 135,378 11,6352 539,0 G2_9 10 257,3 352,233 18,7679 222,0 G3_3 10 114,5 156,5 12,51 92,0 G3_6 10 135,3 147,344 12,1386 119,0 G3_9 10 64,6 9,6 3,09839 58,0 -Total 90 357,244 63094,1 251,185 58,0 Maximum Range Stnd skewness Stnd kurtosis -  G1_3 272,0 40,0 -,75501 -,68383 G1_6 613,0 58,0 ,0420863 -,604253 G1_9 898,0 58,0 1,37104 ,0376887 G2_3 410,0 54,0 -,760729 -,220539 G2_6 575,0 36,0 ,21643 -,663618 G2_9 280,0 58,0 -,862701 -,145534 G3_3 133,0 41,0 -,196998 ,0883362 G3_6 160,0 41,0 1,00845 ,365196 G3_9 69,0 11,0 -1,16753 ,860036 -Total 898,0 840,0 2,6787 -1,17133 The StatAdvisor This table shows various statistics for each of the columns of data To test for significant differences amongst the column means, select Analysis of Variance from the list of Tabular Options Select Means Plot from the list of Graphical Options to display the means graphically WARNING: There is more than a to difference between the smallest standard deviation and the largest This may cause problems since the analysis of variance assumes that the standard deviations at all levels are equal Select Variance Check from the list of Tabular Options to run a formal statistical test for differences among the sigmas You may want to consider transforming the data to remove any dependence of the standard deviation on the mean ANOVA Table Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5,59709E6 699636,0 3099,49 , Within groups 18283,8 81 225,726 Total (Corr.) 5,61537E6 89 The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of the data into two components: a between-group component and a within-group component The F-ratio, which in this case equals 3099,49, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate Since the P-value of the F-test is less than ,05, there is a statistically significant difference between the means of the variables at the 95,0% confidence level To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options Multiple Range Tests -Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups   G3_9 10 64,6 X G3_3 10 114,5 X G3_6 10 135,3 X G1_3 10 255,1 X G2_9 10 257,3 X G2_3 10 387,7 X G2_6 10 555,4 X G1_6 10 584,4 X G1_9 10 860,9 X -Contrast Difference +/- Limits -G1_3 - G1_6 *-329,3 13,3688 G1_3 - G1_9 *-605,8 13,3688 G1_3 - G2_3 *-132,6 13,3688 G1_3 - G2_6 *-300,3 13,3688 G1_3 - G2_9 -2,2 13,3688 G1_3 - G3_3 *140,6 13,3688 G1_3 - G3_6 *119,8 13,3688 G1_3 - G3_9 *190,5 13,3688 G1_6 - G1_9 *-276,5 13,3688 G1_6 - G2_3 *196,7 13,3688 G1_6 - G2_6 *29,0 13,3688 G1_6 - G2_9 *327,1 13,3688 G1_6 - G3_3 *469,9 13,3688 G1_6 - G3_6 *449,1 13,3688 G1_6 - G3_9 *519,8 13,3688 G1_9 - G2_3 *473,2 13,3688 G1_9 - G2_6 *305,5 13,3688 G1_9 - G2_9 *603,6 13,3688 G1_9 - G3_3 *746,4 13,3688 G1_9 - G3_6 *725,6 13,3688 G1_9 - G3_9 *796,3 13,3688 G2_3 - G2_6 *-167,7 13,3688 G2_3 - G2_9 *130,4 13,3688 G2_3 - G3_3 *273,2 13,3688 G2_3 - G3_6 *252,4 13,3688 G2_3 - G3_9 *323,1 13,3688 G2_6 - G2_9 *298,1 13,3688 G2_6 - G3_3 *440,9 13,3688 G2_6 - G3_6 *420,1 13,3688 G2_6 - G3_9 *490,8 13,3688 G2_9 - G3_3 *142,8 13,3688 G2_9 - G3_6 *122,0 13,3688 G2_9 - G3_9 *192,7 13,3688 G3_3 - G3_6 *-20,8 13,3688 G3_3 - G3_9 *49,9 13,3688 G3_6 - G3_9 *70,7 13,3688 -* denotes a statistically significant difference The StatAdvisor This table applies a multiple comparison procedure to determine which means are significantly different from which others The bottom half of the output shows the estimated difference between each pair of   means An asterisk has been placed next to 35 pairs, indicating that these pairs show statistically significant differences at the 95,0% confidence level At the top of the page, homogenous groups are identified using columns of X's Within each column, the levels containing X's form a group of means within which there are no statistically significant differences The method currently being used to discriminate among the means is Fisher's least significant difference (LSD) procedure With this method, there is a 5,0% risk of calling each pair of means significantly different when the actual difference equals Tỷ lệ tế bào tăng sinh môi trường EBM-2 15%FBS/KS + GF Summary Statistics Count Average Variance Standard deviation Minimum -g_1 47,2 103,7 10,1833 37,0 g_3 234,2 2783,2 52,756 169,0 g_6 616,8 5818,2 76,2771 520,0 g_9 873,0 3831,5 61,8991 776,0 -Total 20 442,8 111945,0 334,582 37,0 Maximum Range Stnd skewness Stnd kurtosis -g_1 60,0 23,0 ,262967 -1,07641 g_3 296,0 127,0 -,0402891 -,894731 g_6 723,0 203,0 ,223752 ,0326898 g_9 927,0 151,0 -1,08368 ,278276 -Total 927,0 890,0 ,266613 -1,48535 The StatAdvisor This table shows various statistics for each of the columns of data To test for significant differences amongst the column means, select Analysis of Variance from the list of Tabular Options Select Means Plot from the list of Graphical Options to display the means graphically WARNING: There is more than a to difference between the smallest standard deviation and the largest This may cause problems since the analysis of variance assumes that the standard deviations at all levels are equal Select Variance Check from the list of Tabular Options to run a formal statistical test for differences among the sigmas You may want to consider transforming the data to remove any dependence of the standard deviation on the mean ANOVA Table Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2,07681E6 692269,0 220,88 , Within groups 50146,4 16 3134,15 Total (Corr.) 2,12695E6 19   The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of the data into two components: a between-group component and a within-group component The F-ratio, which in this case equals 220,879, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate Since the P-value of the F-test is less than ,05, there is a statistically significant difference between the means of the variables at the 95,0% confidence level To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options Multiple Range Tests -Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -g_1 47,2 X g_3 234,2 X g_6 616,8 X g_9 873,0 X -Contrast Difference +/- Limits -g_1 - g_3 *-187,0 75,0598 g_1 - g_6 *-569,6 75,0598 g_1 - g_9 *-825,8 75,0598 g_3 - g_6 *-382,6 75,0598 g_3 - g_9 *-638,8 75,0598 g_6 - g_9 *-256,2 75,0598 -* denotes a statistically significant difference The StatAdvisor This table applies a multiple comparison procedure to determine which means are significantly different from which others The bottom half of the output shows the estimated difference between each pair of means An asterisk has been placed next to pairs, indicating that these pairs show statistically significant differences at the 95,0% confidence level At the top of the page, homogenous groups are identified using columns of X's Within each column, the levels containing X's form a group of means within which there are no statistically significant differences The method currently being used to discriminate among the means is Fisher's least significant difference (LSD) procedure With this method, there is a 5,0% risk of calling each pair of means significantly different when the actual difference equals   Box-and-Whisker Plot sample g_1 g_3 g_6 g_9 200 400 600 800 1000 response