XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEXPCR CHẨN ĐOÁNMycoplasma hyopneumoniae và Mycoplasma hyorhinis TRÊN HEO CÓ DẤU HIỆUBỆNH HÔ HẤP vàVIÊM KHỚP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX-PCR CHẨN ĐỐNMycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyorhinis TRÊN HEO CĨ DẤU HIỆUBỆNH HÔ HẤP vàVIÊM KHỚP Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ BÍCH TRÂM Niên khóa: 2010 – 2014 Tháng1/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX-PCR CHẨN ĐỐNMycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyorhinis TRÊN HEO CĨ DẤU HIỆU BỆNHHƠ HẤP vàVIÊM KHỚP Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN TẤT TỒN TRẦN THỊ BÍCH TRÂM ThS ĐỖ TIẾN DUY Tháng1/2014 LỜI CẢM ƠN  Đầu tiên, xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học,Ban Quản Lý Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nơng Lâm, Phòng xét nghiệm Sinh học Phân tử - Tế bào thuộc Bệnh viện Thú Y- khoa Chăn Nuôi Thú Yđã tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Tất Toàn ThS Đỗ Tiến Duy tận tình dạy, giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt q trình thực khóa luận! Đồng thời, tơi xin cảm ơn BSTY Lê Thị Hạnh Dung BSTY Nguyễn Phạm Huỳnh tất anh chị Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm người hướng dẫn, bảo giúp đỡ nhiều lúc tơi gặp khó khăn thực đề tài Bên cạnh đó, tơi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Đình Đơn, ThS Tơn Bảo Linh, KS Võ Khánh Hưngcùng tồn thể quý thầy cô dạy dỗ truyền đạt cho kiến thức quý giá, kinh nghiệm sống suốt năm tháng học trường suốt thời gian thực khoá luận Cảm ơn tất bạn tập thể lớp DH10SH ln gắn bó, chia sẻ, động viên sát cánh tơi suốt q trình học tập trường Và hết, xin cảm ơn Ba, Mẹ Anh Chị người tin tưởng, động viên tạo điều kiện tốt để hồn thành khóa luận tất thành công lớn đường đời Gia đình khơng chỗ dựa vững cho vượt qua khó khăn, nơi chốn để trở mà nguồn động lực để tiếp tục hoàn thành mục tiêu tới Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013 TRẦN THỊ BÍCH TRÂM i TĨM TẮT  Bệnh truyền nhiễm đường hô hấp heo diễn biến phức tạp với tốc độ lây lan nhanh đồng nhiễm nhiều tác nhân khác Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) Mycoplasma hyorhinis(Mhr) hai nguyên nhân quan trọng đồng thời gây ảnh hưởng nặng đường hô hấp (phổi) gây viêm khớp heo Do đó, chẩn đốn sớm phát đồng thời nguyên nhiễm ghép để cách ly, áp dụng biện pháp phòng trị hợp lý cần thiết cho việckhống chế dịch bệnh triệt để trang trại chăn ni Chính lý đó, mục đích đề tài đặt xây dựng quy trình PCR đơi (Multiplex-PCR) phát đồng thời MhpvàMhrtừ đógiúp cho việc chẩn đốn bệnh ghép nhanh chóng, tiết kiệm chi phí Đề tài thực nội dung như: (1) xây dựng quy trình PCR đơn phát gen 16s rRNA Mhpvà gen 37p Mhr, (2) tối ưu hóa quy trình m-PCR xác minh hiệu lực phương pháp thông qua việc xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng, (3) ứng dụng quy trình vừa thiết lập mẫu bệnh phẩm so sánh khả phát với quy trình đơn Các kết đạt sau nồng độ mồi cho Mhp16s-F, Mhp16s-R, Mhr37pF, Mhr37p-R 0,5 µM; 0,5 µM; 0,5 µM; 0,5 µM Chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng m-PCR bao gồm giai đoạn tiền biến tính 94 oC phút, biến tính 94 oC phút, bắt cặp 45 oC phút, kéo dài 72 oC phút giai đoạn hậu kéo dài 72 oC phút, lặp lại 35 chu kỳ.Quy trình m-PCR có độ nhạy cao với khả phát 20,9 copies/ng (Mhp) 15,0 copies/ng (Mhr) Độ đặc hiệu cao thử nghiệm virus, vi khuẩn thường xuyên có mặt Mhp Mhr PRRSV, HP, APP, Salmonella, Staphylococcusaureus, E.coli Classical swine fever virus(CSFV).Quy trình có tính ứng dụng cao 11 mẫu thực địa cho kết hoàn toàn đồng với quy trình s-PCR 11/11 (100%) Keyword: Multiplex-PCR, Mycoplasma hyorhinis, heo ii hyopneumoniae, Mycoplasma SUMMARY The infectious diseases on respiratory tract occured commonly and complicatedly because of rapid transmission and combination with numerous pathogens included Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) andMycoplasma hyorhinis(Mhr) which are two important agents that causing negative effects on respiratory tract (lung) and/or arthritis in pigs Then, the early diagnosis and parallel detection co-infection of different pathogens to insulate, apply the methods for treatment and protection are very needful control program at farm-gate Therefore, the aim of this studywas to establish a protocol (m-PCR)for simultaneously detection of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasmahyorhinisthen furthersupport to get the rapiddiagnosis in diseases and cost-effectiveness The thesis contents included: (1) building a each single protocol for detection gene of 16s rRNA of Mhpand gene 37p of Mhr, (2) optimizing the multiplex – PCR protocol and identifying the effectiveness of developed protocol based on the sensitivity and specificity,(3) finally applying to diagnose these pathogens from 11 field samples and comparing with s-PCR protocol The results were obtained as follows the optimized concentration of primers for Mhp16s-F, Mhp16s-R, Mhr37p-F, and Mhr37p-R were 0.5 µM; 0.5 µM; 0.5 µM; 0.5 µM, respectively The m-PCR consisted of 35 optimized thermal cycles of initial denaturation at 94 oC for minutes, denaturation at 94 oC for min, annealing at 45 oC for minute, extension at 72 oC for and the final extension at 72 oC for mins The final m-PCR had very high sensitivity to detect 20.9copies/ng (Mhp)and 15.0 copies/ng (Mhr).The specifictitywas 100% for PRRSV, HP, APP, Salmonella, Staphylococcusaureus, E.coli CSFV.This m-PCR protocol could be highly applied in the field when result of determine Mhp and Mhr on 11 field specimens matched 11/11 (100%) compared with s-PCR Keyword: Multiplex-PCR, Mycoplasma hyorhinis, pigs iii hyopneumoniae, Mycoplasma MỤC LỤC  Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary ii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Yêu cầu đề tài : 1.3 Nội dung thực hiện: Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1Tổng quan Mycoplasma 2.2.Tổng quan bệnh Mycoplasma hyopneumoniae gây 2.2.1Đặc điểm bật Mycoplasma hyopneumoniae ( Mhp) 2.2.2Dịch tễ học Mycoplasma hyopneumoniae 2.2.3Cơ chế sinh bệnh 2.2.4Triệu chứng Mycoplasma hyopneumoniae gây 2.2.5Bệnh tíchdo Mycoplasma hyopneumoniae gây 2.3.Tổng quan bệnh Mycoplasma hyorhinis gây 2.3.1Đặc điểm bật Mycoplasma hyorhinis 2.3.2Dịch tể học Mycoplasma hyorhinis 2.3.3Cơ chế sinh bệnh 2.3.4Triệu chứng Mycoplasmahyorhinis gây 2.3.5Bệnh tíchdo Mycoplasma hyorhinis gây 2.4 Ứng dụng kỹ thuật m-PCR để phát tác nhân gây bệnh 2.4.1Các yếu tố ảnh hưởng đến thành công m-PCR 2.4.2Ưu nhược kỹ thuật PCR 10 iv 2.4.3So sánh phương pháp phát đồng thời Mhp Mhr 10 2.5 Đọc kết PCR định lượng DNA 10 2.5.1 Đọc kết PCR 11 2.5.2 Định lượng DNA phương pháp đo mật độ quang 12 2.6.Tình hình nghiên cứu chẩn đốn Mycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyorhinis ngồi nước 12 2.6.1Tình hình nướcMycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyorhinis 12 2.6.2Tình hình ngồi nướcMycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyorhinis 13 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 3.3.1 Phản ứng s-PCR phát Mycoplasma hyopneumoniae 18 3.3.1.1Kiểm tra đặc tính chung mồi 18 3.3.1.2Bước đầu xây dựng quy trình s-PCR 18 3.3.2Phản ứng s-PCR phát Mycoplasma hyorhinis 20 3.3.3 Xây dựng quy trình Multiplex-PCR phát Mhp, Mhr 21 3.3.3.1Đánh giá khả hoạt động mồi 21 3.3.3.2Khảo sát nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho phản ứng m-PCR 22 3.3.3.3Xác định nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng m-PCR 23 3.3.3.4Xác định lượng Master mix tối ưu cho phản ứng m-PCR 23 3.3.3.5Kiểm tra độ nhạy phản ứng m-PCR 24 3.3.3.6Kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng 25 3.3.4 Ứng dụng quy trình m-PCR tối ưu mẫu thực địa 26 3.3.4.1Điện di sản phẩm PCR 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Phản ứng s-PCR phát Mycoplasma hyopneumoniae 28 4.1.1Khảo sát đặc tính chung mồi 28 4.1.2Xây dựng quy trình s-PCR 28 4.2Phản ứng s-PCR phát Mycoplasma hyorhinis 35 4.3 Xây dựng quy trình Multiplex-PCR phát Mhp Mhr 39 4.3.1Đánh giá khả hoạt động mồi 39 4.3.2Khảo sát nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho phản ứng m-PCR 39 4.3.3Khảo sát nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng m-PCR 40 4.3.4Xác định lượng Master mix tối ưu cho phản ứng m-PCR 41 v 4.3.5Kiểm tra độ nhạy phản ứng m-PCR 41 4.4Ứng dụng quy trình m-PCR tối ưu mẫu thực địa 43 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤLỤC 50 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APP Actinobacillus pleuropneumoniae BLAST Basic Local Alignment Search Tool CSFV Classical swine fever virus DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E.coli Escherichia coli HP Haemophilus parasuis LOD Limit of Detection m-PCR Multiplex Polymerase Chain Reaction MWM Molecular Weight Marker Mhp Mycoplasma hyopneumoniae Mhr Mycoplasma hyorhinis NCBI National Center for Biotechnology Information NT Nghiệm thức OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction PRRSV Porcine reproductive and respiratory syndrome virus RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction s-PCR Single Polymerase Chain Reaction TBE Tris borate EDTA UV Ultraviolet vii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Trang Bảng 3.1 Các thiết bị dụng cụ sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.2 Các cặp mồi sử dụng phản ứng s-PCR m-PCR 16 Sơ đồ 3.3 Bố trí thí nghiệm 17 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng s-PCR phát Mhp 18 Bảng 3.5Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát Mhp 18 Bảng 3.6 Nghiệm thức chuẩn hóa quy trình s-PCR 19 Bảng 3.7Chuẩn hóa nhiệt độ phản ứng s-PCR 19 Bảng 3.8 Chuẩn hóa thể tích Master mix phản ứng s-PCR 20 Bảng 3.9 Thành phần phản ứng s-PCR phát Mhr 20 Bảng 3.10Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát Mhr 20 Bảng 3.11Chu trình luân nhiệt phản ứng m-PCR phát Mhp Mhr 21 Bảng 3.12Thành phần phản ứng m-PCR đánh giá khả hoạt động mồi 22 Bảng 3.13Chuẩn hóa nhiệt độ phản ứng m-PCR 22 Bảng 3.14 Thành phần phản ứng m-PCR xác định nồng độ mồi 23 Bảng 3.15 Chuẩn hóa thể tích Master mix phản ứng s-PCR 24 Bảng 3.16Nghiệm thức pha loãng DNA 25 Bảng 3.17 Các nghiệm thức kiểm tra độ đặc hiệu 26 Bảng 3.18Các mẫu sử dụng quy trình m-PCR s-PCR 27 Bảng 4.1 Các đặc tính cặp mồi 28 Bảng 4.2 Kết cấu trúc thứ cấp mang lượng tự thấp 27 Bảng 4.3Kết nồng độ DNA số copies 41 Bảng 4.4 Kết phản ứng m-PCR s-PCR mẫu thực địa 43 viii 4.3.4 Xác định lượng Master mix tối ưu cho phản ứng m-PCR 500bp Mhp(430bp) 200bp Mhr(346bp) 100bp Hình 4.17 Kết xác định lượng master mix thích hợp.(1) đối chứng âm; (2) (3)sản phẩm PCR master mix 12; (4) (5) sản phẩm PCR master mix 10; (6) (7) sản phẩm PCR master mix 8; (L) Ladder100bp (Promega) Thể tích master mix ảnh hưởng đến khả hoạt động mồi lượng sản phẩm tạo thành cần chọn thể tích master mix cho ngun liệu để hình thành đoạn gen đủ cho trình khếch đại Kết hình 4.17 cho thấy thể tích master mix 12µl cho sản phẩm rõ sáng Kết luận 12µl yếu tố giúp cho việc khếch đại sản phẩm thích hợp 4.3.5 Kiểm tra độ nhạy phản ứng m-PCR Sản phẩm phản ứng khếch đại tinh quy trình sử dụng chloroform sau dùng sản phẩm đo OD sử dụng phần mềm tính số copies (http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html )cho kết bảng 4.4 Bảng 4.3 Kết nồng độ DNA số copies Mhp Mhp Nồng độ DNA (ng/µl) 9,7 5,6 Số copies/ng 2,09.1010 1,5.1010 Theo kết bảng 4.3 ta tiến hành pha loãng từ đến 10-11 để kiểm tra độ nhạy phản ứng 41 Mhp(430bp) Mhr(346bp) 500bp Hình 4.18 Kết kiểm tra độ nhạy phản ứng m-PCR (1) Ladder 100bp (Promega); (2) đến (13) độ pha loãng từ đến 10-11; (14) đối chứng âm Kết thí nghiệm hình 4.18 cho ta thấy độ sáng rõ vạch giảm dần độ pha loãng tăng dần giếng số 12 khơng thể phát kết luận giếng số 11 tương ứng với độ pha loãng 10-9 giới han thấp mà phản ứng mPCR phát Để kiểm tra độ xác tiến hành chạy m-PCR lập lại 10 lần với mẫu nồng độ pha loãng 10-9 kết thể hình 4.19 Mhp(430bp) Mhr(346bp) 500bp 200bp 100bp Hình 4.19 Kết lập lại 10 lần nồng độ pha loãng 10-9 xác định LOD (1)Ladder 100bp (Promega); (2) sản phẩm PCR quy trình multi tối ưu; (3) đến (12) sản phẩm PCR lập lại 10 lần độ pha loãng 10-9 Từ kết hình 4.19 cho thấy lập lại 10 lần độ pha lỗng 10-9thì 10/10 có sản phẩm tương đồng Kết luận LOD (Limit of Detection), số copies thấp mà quy trình m-PCR phát đề tài độ pha loãng 10-9 tương ứng với khả phát phản ứng 20,9copies/ng Mycoplasma hyopneumoniae 15,0copies/ng choMycoplasma hyorhinis Tiếp theo kiểm tra độ đặc hiệu quy trình với vi sinh vật thường xuyên xuất với Mhp, Mhr gây bệnh heo 42 4.3.6 Kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng Độ đặc hiệu khả phương pháp phản ứng cách riêng biệt (đặc hiệu) với trình tự gen đích.Mục đích xác định tỷ lệ âm tính giả dương tính giả phương pháp m-PCR mồi.Thí nghiệm tiến hành vi khuẩn: HP, APP, Salmonella, Staphylococcusaureus, E.colivà virus PRRSV Chính nhiễm đồng thời vật chủ đường hơ hấp nên diện mẫu bệnh phẩm với Mhp Mhr Nếu mồi khơng bắt cặp với tác nhân chúng có tính ứng dụng thực tế cao khơng gây âm tính giả hay dương tính giả Kết PCR cho thấy đối chứng dương (Mhp, Mhr) có sản phẩm PCR tất giếng lại khơng có kể đối chứng âm chứng tỏ khơng có ngoại nhiễm q trình thao tác Kết luận mồi hồn tồn khơng bắt cặp với loài PRRSV, HP, APP, Salmonella, Staphylococcusaureus, E.coli CSFV hoàn toàn đặc hiệu cho Mhp Mhr 500bp 200bp 100bp Hình 4.20 Kết kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng mPCR.(1)Ladder 100bp (Promega); (2) sản phẩm m-PCR; (3) đối chứng âm; (4) NT1; (5) NT2; (6) NT3; (7) NT4; (8) NT5; (9) NT6; (10) 4.4 Ứng dụng quy trình m-PCR tối ưu mẫu thực địa Sau chuẩn hóa chu trình nhiệt điều kiện phản ứng tối ưu, áp dụng quy trình vào việc phát Mhp Mhr 11 mẫu bệnh phẩm có mẫu dịch khớp, mẫu mô, mẫu dịch hầu họng 43 Mhp(430bp) Mhr(346bp) 500bp 200bp 100bp Hình 4.21Kết ứng dụng quy trình m-PCR.(1) Ladder 100bp (Promega); (2)đối chứng âm;(3) đến (13) sản phẩm PCR với quy trình multi; (14) sản phẩm PCR cặp mồi Bảng 4.4 Kết phản ứng m-PCR s-PCR mẫu thực địa STT Mẫu Kết Mhp Kết Mhr s-PCR m-PCR s-PCR m-PCR D-1 + + + + M-1 + + - - M-2 - - + + H-2 + + - - M-3 + + + + H-3 + + - - M-4 - - + + D-2 + + - - D-3 + + + + 10 M-5 + + - - 11 M-6 + + + + X 0/11 0/11 Chú thích: H: mẫu dịch hầu họng, M: mẫu mô, D: mẫu dịch khớp Các mẫu từ số đến 11 tương ứng với giếng từ đến 13 hình 4.21, (+): dương tính, (-): âm tính, X: tỉ lệ sai khác kết m-PCR s-PCR 44 Trong 11 mẫu có mẫu từ dịch hầu họng, mẫu từ dịch khớp mẫu mơ chạy với quy trình s-PCR cho lồi kết quy trình m-PCR quy trình s-PCR hồn tồn trùng khớp với Trùng khớp với nhiều nghiên cứu trước có mặt vi khuẩn Mhp Mhr diện đường hô hấp chủ yếu phổi quan mô bệnh khác đồng thời xuất dịch họng dịch khớp vật chủ Tuy nhiên có số vạchsản phẩm độ sáng lượng sản phẩm nhỏ so với quy trình đơn Kết giải thích lượng mẫu đối chứng sử dụng thí nghiệm khơng đồng nồng độ Mhp Mhr nênsẽ có lồi có lượng lớn lượng thấp Tuy nhiên điều quy trình chưa tối ưu hóa đến mức tuyệt đối nên ứng dụng vào thực tế xuất vạch không đặc hiệu Trong phản ứng đơn có mồi hoạt động nên thành phần phản ứng cung cấp cho cặp mồi Tuy nhiên, quy trình m-PCR có khếch đại theo cấp số nhân cặp mồi lúc nên lượng khơng đồng kết lượng sản phẩm không đồng đều, phản ứng bị ức chế thành phần cho phản ứng sử dụng hết.Quy trình sử dụng thử nghiệm tất mẫu bệnh phẩm có Mhp Mhr để kiểm tra khả ứng dụng quy trình phổ rộng dễ dàng phục vụ cho phòng thí nghiệm xét nghiệm cần xét nghiệm với loại mẫu bệnh phẩm 45 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Xây dựng hai quy trình đơn phát đoạn trình tự 16s rRNA Mycoplasma hyopneumoniae 37p Mycoplasma hyorhinis - Thiết lập chu trình nhiệt thành phần phản ứng m-PCR sau giai đoạn tiền biến tính 94 oC phút, biến tính 94 oC phút, bắt cặp 45 oC phút, kéo dài 72 oC phút giai đoạn hậu kéo dài 72 oC phút lặp lại 35 chu kỳ, nồng độ mồi Mhp16s-F; Mhp16s-R; Mhr37p-F; Mhr37p-R 0,5 ; 0,5 ; 0,5 ; 0,5 µM thể tích master mix 12µl.Độ nhạy quy trình đạt 20,9copies/ng Mycoplasma hyopneumoniae 15,0copies/ngMycoplasma hyorhinis Độ đặc hiệu 100% PRRSV, HP, APP, Salmonella, Staphylococcusaureus, E.coli CSFV - Quy trình ứng dụng mẫu thực địa cho kết tương đồng 100% với quy trình đơn 5.2 Đề nghị - Khảo sát số lượng mẫu lớn để tăng độ tin cậy quy trình m-PCR - Đánh giá độ đặc hiệu quy trình nhiều lồi gây bệnh heo để đảm bảo tính xác quy trình - Tiếp tục đánh giá nồng độ mồi tối thiểu phát để tiết kiệm chi phí đến mức thấp 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Thị Thu Hường, 2005 Phát nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae heo phương pháp PCR ELISA Khóa luận thạc sĩ khoa học nơng nghiệp, Đại học Nơng Lâm Tp HCM Đồn Thị Nhung, 2013 Xây dựng quy trình Multiplex PCR phát Porcine circovirus type 2, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae gây bệnh hô hấp phức hợp heo Đỗ Tiến Duy, 2004 Chẩn đốn Mycoplasma hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại thể, vi thể kỹ thuật ELISA heo thịt giết mổ xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong TP HCM Khóa luận tốt nghiệp Bác sĩ Thú Y, Khoa CNTY, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học Thú y nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009 Chẩn đoán bệnh Mycoplasma hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại thể, phân lập kết hợp với kỹ thuật PCR phổi heo thịt có bệnh tích nghi ngờ Khóa luận tốt nghiệp Bác sĩ Thú Y, Khoa CNTY, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Thị Phước Ninh Đỗ Tiến Duy, 2010 Xác định tuổi nhiễm biểu lâm sàng Mycoplasma hyopneumoniae heo theo mẹ đến 56 ngày tuổi kỹ thuật PCR Hội nghị khoa học kỹ thuật Trường đại học Nơng Lâm Tp HCM Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp 2010 Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu 2005 Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp, trang 66 - 67 Nguyễn Thị Phước Ninh ctv, 2011 Phân lập xác định số đặc tính sinh hóa Mycoplasma hyopneumoniae phổi viêm heo thịt giết mổ Hội nghị KHKT trường Đại học Nơng Lâm Tp HCM Tạp chí KHKT Nơng Lâm Nghiệp, 2011 Nguyễn Thị Phước Ninh, Đỗ Tiến Duy, Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Ngọc Tuân Trần Thị Dân, 2006 Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae số vi khuẩn liên quan đến bệnh hô hấp phổi heo Tạp chí KHKT Thú Y XIII (3):12-15 10 Nguyễn Văn Thanh, 2007 Sinh học phân tử nhà xuất giáo dục 11 Phạm Sĩ Lăng, Phan Địch Lân Trương Văn Dung, 2002 Bệnh phổ biến heo biện pháp phòng trị Nhà xuất Nơng Nghiệp 12 Qch Tuyết Anh, 2003 Một số kinh nghiệm ứng dụng kỹ thuật PCR để phát Mycoplasma hyopneumoniae mẫu bệnh tích phổi heo nhục hóa Khóa luận tốt nghiệp Bác sĩ Thú Y, Khoa CNTY, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM 13 Trần Thanh Phong, 1996 Bệnh truyền nhiễm vi trùng heo Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP HCM, trang 32-43 14 HenegaruiO, Heerema N.A, Dlouhy S.R, Vance G.H Vogt1 P.H, 1997 Phản ứng Multiplex PCR: Các thơng số định quy trình bước Journal BioTechnology 23: 504-511 (9/1997).Người dịch: Lưu Quang Minh 47 Tài liệu tiếng nước 15 Palzer A., 2008 Associations between pathogens in healthy pigs and pigs with pneumonia Veterinary Record, 162(9):267-271 16 Abhijit K Barate, Hwi-Young Lee, Hye-Won Jeong, Lam Quang Truong, Hong-Gu Joo and Tae-Wook Hahn,2012 An improved multiplex PCR for diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniaeandMycoplasma hyorhinis690-756, Korea 17 Caron J., Ouardani M and Dea S., 2000.Diagnosis and Differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in Pigs by PCR Amplification of the p36 and p46 Genes 18 Cole B.C., Washburn L.R and Taylor Robinson D.,1985 Mycoplasm include arhritis In The Mycoplasma Vol.VI Mycoplasma pathogenicity (S Rain and M.F Barile, eds).,pp: 107-160 19 Freeman M J, Armstrong C H, Freeman-Sands L L and Lopez-Osuna M, 1984 Serological cross-reactivity of porcine reference antisera to Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma flocculare, Mycoplasma hyorhinis and Mycoplasma hyosynoviae indicated by the enzyme-linked immunosorbent assay, complement fixation and indirect hemagglutination tests Can J Comp Med 20 Hess M, Neubauer C and Hackl Clinic R, 2007 Interlaboratory comparison of ability to detectnucleic acid of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae by polymerase chain reaction, University of Veterinary Medicine Vienna 21 Hideki Kobayashi, Tessuo Morozumi, Chikako Miyamoto, Mitsugu Shimizu, Syunji Yamada, Seiichi Ohashi, Masanori Kubo, Kumiko Kimura, Kenji Mitani, Nobuyoshi Ito and Kuoshi Yamamoto, 1995 Mycoplasma hyorhinis infection levels in lung of piglets with Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) J.Vet.Med.Sci 58(2), pp:109-113 22 Kobisch M and Friis N.F, 1996 Swine mycoplasmoses,pp: 1569-1605 23 Lobo E., Poveda C., Gupta R., Suarez A., Hernández Y., Ramírez A andPoveda J.B., 2011 Mycoplasmashyorhinis in different regions of cuba 24 Maria Jose Clavijo, Albert Rovira, Simone Oliveira and Jerry Torrison,2012.Mycoplasma hyorhinis plays determinant role in polyserositis cases Tummaruk, Pacharee Thongkamkoon, 25 MettaMakhanon,Padet RoongrojeThanawongnuwechand NuveePrapasarakul, 2011 ComparisonofdetectionproceduresofMycoplasma hyopneumoniae, hyorhinis inlungs,tonsils,and Mycoplasmahyosynoviae,andMycoplasma synovialfluidofslaughtered pigsand their distributionsinThailand Trop Anim Health Prod44:313-318 26 Optimized protocol for multiplex nested polymerase chain reaction to detect and differentiate Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, and Mycoplasma hyorhinis in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues from pigs with polyserositis Canadian Journal of Veterinary Research, 2012;76(3):195-200 27 Quinn P.J, Carter M.E, Markey B, and Carter G.R, 1994 Clinical veterinary microbiology Mosby Internation, England, pp: 320-326 28 Roberta S Gardella and Richard A Del Giudice, 1995 Growth of Mycoplasma hyorhiniscultivar a on semisynthetic medium 48 29 ThackerEileen L, 2004.Diagnosis of Mycoplasmahyopneumoniae 2118 Veterinary Medicine Building, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, Ames, IA 50011, USA E-mail: ethacker@iastate.edu 30 Timenetsky J., Santo L M., Buzinhani M and Mettifogo E Detection of multiple Mycoplasma infection in cell cultures by PCR Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil 31 Villarreal, Vranckx K., Duchteau L., Pasmans F and Haesebrouk F., 2010 EarlyMycoplasmahyopneumoniaeinfections inEuropeansucklingpigsinherdswithrespiratory problems:detection rateandriskfactors Tài liệu từ internet 32 http://www.ceva.vn/content/search?SearchText=t%C3%ACnh+h%C3%ACnh+b%E1 %BB%87nh+do+mycoplasma&SearchButton=Search(truy cập ngày 21-112013)John Baker, 2012 Magezine of Asian Pork 33 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC98941/#!po=79.8295(truy cập ngày 21-11-2013) 34 Bệnh viêm phổi heo Mycoplasma, 2011 http://www.vbs.ac.vn/print.php?post=241(truy cập ngày 21-11-2013) 35 www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3769822/(truy cập ngày 21-11-2013) 49 50 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các bước tinh sản phẩm sau PCR Bước 1: Pha loãng 10 lần mẫu Nuclease Free Water tube ml Bước 2: Cho 0,6 V Cloroform trộn đều, ly tâm 13000 vòng 10 phút Bước 3: Hút 450 µl dịch trộn với 300 µl isopropanol lạnh, ly tâm 4oC 13000 vòng 30 phút Bước 4: Thu cạn thêm 700 µl ethanol 70% Ly tâm 13000 vòng 10 phút.Loại dịch phơi qua đêm Bước 5: Cho 30 – 40 µl nước Nuclease Free Water Phụ lục 2: Kết đo OD hai mẫu đối chứng ly trích từ thực địa Mẫu Nồng độ (ng/µl) 619,2 Độ tinh A260 A280 12,4 5,9 Mhp 260/280 2,1 260/230 0,5 Mhr 476,6 9,5 1,9 0,97 5,0 Phụ lục3 : Kết giải trình tự với hai cặp mồi Hình Kết giải trình tự Mhr với mồi Mhp16s F Hình Kết giải trình tự Mhr với mồi Mhp16s R Hình Kết giải trình tự Mhr với mồi Mhr 37p F Hình 4Kết giải trình tựu Mhr với mồi Mhr 37pR ... hyopneumoniaevàMycoplasmahyorhinis heo có dấu hiệu bệnh hô hấp viêm khớp thực 1.2 Yêu cầu đề tài Xây dựng quy trình Multiplex-PCR phát đồng thờiMycoplasma hyopneumoniaevà Mycoplasma hyorhinis ể chẩn đốn nhanh... đồng thời Mycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyorhinis  Thử nghiệm quy trình m-PCR heo mắc bệnh hô hấp viêm khớp so sánh với quy trình đơn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Mycoplasma. .. viêm phế quản phổi heo Mẫu dịch rửa phế quản từ 100 heo khơng có dấu hiệu lâm sàng 239 heo có dấu hiệu lâm sàng bệnh đường hơ hấp kiểm tra Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, virus