ỨNG DỤNG VI SINH VẬT NHẰM GIẢM HÀM LƯỢNG NITRATE TRONG DƯA MUỐI CHUA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG VI SINH VẬT NHẰM GIẢM HÀM LƯỢNG NITRATE TRONG DƯA MUỐI CHUA Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ ÁNH CHÂU Niên khóa : 2009 - 2013   Tháng 6/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG VI SINH VẬT NHẰM GIẢM HÀM LƯỢNG NITRATE TRONG DƯA MUỐI CHUA Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS NGUYỄN TIẾN THÀNH NGUYỄN THỊ ÁNH CHÂU ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG Tháng 6/2013 LỜI CÁM ƠN Trên thực tế khơng có thành cơng mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập giảng đường đại học đến nay, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ q Thầy Cơ, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Ban giám hiệu nhà trường, quý Thầy Cô Bộ môn Công Nghệ Sinh học – Trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập hoàn thành tốt đề tài Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Tiến Thành, ThS Trương Phước Thiên Hoàng với tri thức tâm huyết truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em suốt thời gian học tập trình thực đề tài, tận tâm hướng dẫn em qua buổi nói chuyện, thảo luận vấn đề đề tài sống Nếu khơng có lời hướng dẫn, dạy bảo thầy em nghĩ đề tài em khó hồn thiện Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Để có thành công bước đầu ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Cô Nhã Trầm tận tâm dìu dắt, hỗ trợ lớp 09SH suốt bốn năm qua KS Trương Thị Ngọc Hân, KS Nguyễn Tường Ngọc Tú, KS Nguyễn Phan Thành, anh Tuấn giúp đỡ, động viên suốt thời gian thực đề tài Bạn Huy, Pháp, Q, Đơ, nhóm K8 tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài Hai bạn Hải Vân lớp DH12SH nhiệt tình giúp đỡ tơi nhiều Cuối xin cảm ơn anh chị khố trước tập thể lớp DH09Sh đóng góp, động viên giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Nguyễn Thị Ánh Châu i TÓM TẮT Dưa cải muối chua thức ăn phổ biến ưa chuộng Việt Nam Theo Hải Yến Xuân Tươi (2013), sản phẩm có triển vọng thị trường nước xuất sang nước Vì vậy, đòi hỏi sản phẩm đạt chất lượng cao mà phải an tồn Do đó, đề tài thực nhằm mục đích phân lập, bổ sung vi khuẩn làm giảm hàm lượng nitrate dưa cải giúp hoàn thiện, nâng cao chất lượng sản phẩm tăng hiệu kinh tế Từ góp phần định hướng cho ứng dụng lĩnh vực cơng nghiệp chế biến thực phẩm Thí nghiệm bắt đầu việc tiến hành thu thập mẫu dưa cải thị trường, sau tiến hành xác định hàm lượng nitrate theo ngày ủ chua phương pháp so màu với Natri salicylate Từ 10 mẫu dưa cải khác thu thập quanh khu vực Thủ Đức vùng lân cận tiến hành phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải nitrate môi trường đặc trưng Giltay chứa chất KNO3, kết hợp với kiểm tra đặc tính sinh hóa chủng phân lập Cuối tiến hành muối dưa cải có bổ sung chủng vi khuẩn có khả khử nitrate cao so sánh hàm lượng nitrate với mẫu đối chứng Kết sau khảo sát mẫu dưa cải cho thấy hàm lượng nitrate dưa cải vượt ngưỡng cho phép Tổ chức Sức khỏe Thế giới (WHO) (2.000 – 5.000 mg/kg, so với ngưỡng cho phép WHO hàm lượng nitrate có rau, củ từ 60 – 1.500 mg/kg) ngày thứ nhất, hai ba thời gian lên men Quá trình phân lập chủng vi sinh phản nitrate phân lập chủng có khả khử nitrate mơi trường Giltay tuyển chọn chủng có khả khử nitrate cao nuôi cấy môi trường dịch thể nitrate Cuối bổ sung hai chủng vi khuẩn vào mẫu dưa cải cho thấy hàm lượng nitrate thấp so với mẫu không bổ sung vi khuẩn Trong mẫu bổ sung kết hợp chủng vi khuẩn chiếm ưu cao chất lượng cảm quan không tốt mẫu đối chứng Từ khóa: muối chua dưa cải, phương pháp so màu với Natri salicylate, vi khuẩn khử nitrate ii SUMMARY The subject: “Application of beneficial microorganisms to reduce the nitrate content in fermented cabbage” at the laboratory of the Research Institute of Biotechnology and Environment, Nong Lam University, from December 2012 to May 2013 Advisors: Dr Nguyen Tien Thanh ME Truong Phuoc Thien Hoang The study was carried out to apply beneficial bacteria in reducing nitrate concentration in fermented cabbage The strains of beneficial bacteria ware isolated and added in fermented cabbage to evaluate the nitrate reduction efficiency during the fermentation process The samples were collected from households and retailers in some markets in Thu Duc area for further fermentation procedure evaluation and nitrate level determination The total of 10 samples collected from the market were use to determine the nitrate concentration using color comparison with sodium salicylate The strains of nitrate-reducing bacteria were isolated and cultured on specific media Giltay containing KNO3, combining with biochemical characteristics testing of the isolated strains After that, the cabbage was fermented with additional nitratedecomposing bacteria and the nitrate concentration was compared with the control treatment The results showed that, the nitrate concentration in 10 collected samples in the survey varied from 2000 – 5000 mg/kg exceeded the allowable level of WHO (60 – 1500 mg/kg) on the first, second and the third days of fermentation The results of isolation have collected strains capable of decomposing nitrate in Giltay media and strains with very high nitrate decomposing ability were selected Finally, adding selected strains in the fermentation process showed lower nitrate level compared to the control treatment and the lowest nitrate level was found in the treatment which was added both nitrate-decomposing bacterial trains Keyword: Color comparison with Sodium salicylate, Fermented cabbage, Nitrate Reducing Bacteria, Photometric method iii MỤC LỤC Trang Lời cám ơn i Tóm tắt .ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu nguyên liệu 2.1.1 Cải bẹ 2.1.1.1 Thành phần hoá học cải bẹ 2.1.1.2 Tính chất cải bẹ 2.1.1.3 Tính chất cơng nghệ 2.1.1.4 Têu chuẩn chọn nguyên liệu 2.1.2 Củ hành tím (Allium schoenoprasum) 2.1.3 Ớt (Capsicum frutescens L.) 2.1.4 Tỏi (Allium sativum L.) 2.1.5 Muối ăn 2.1.6 Đường 2.2 Cơ sở lý thuyết trình muối chua 2.2.1 Quá trình lên men tổng quát vi khuẩn lactic 2.2.1.1 Các dạng lên men lactic 2.2.1.2 Các giai đoạn trình lên men lactic 10 2.2.2 Vi sinh vật lên men lactic 10 2.2.2.1 Vi khuẩn 10 2.2.2.2 Nấm men 12 iv 2.2.2.3 Nấm mốc 12 2.3 Nitrate Phản ứng phản nitrate 12 2.3.1 Nitrate 12 2.3.1.1 Đặc điểm tính chất 12 2.3.1.2 Nguồn gốc Nitrates (NO3) 13 2.3.1.3 Nitrate thực vật 13 2.3.1.4 Ảnh hưởng nitrate tới sức khỏe tuổi thọ người, động vật 14 2.3.2 Phản ứng phản nitrate hóa 15 2.3.2.1 Các vi sinh vật khử nitrate 15 2.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình khử nitrate vi khuẩn 16 2.3.3 Một số phương pháp định lượng nitrate 16 2.3.3.1 Phương pháp thể tích 17 2.3.3.2 Phương pháp so màu 17 2.3.3.3 Phương pháp dòng chảy (FIA) 19 2.3.3.4 Phương pháp cực phổ 19 2.3.3.5 Phương pháp đo khí 20 2.3.3.6 Phương pháp xác định tổng NO3- NO2- 20 2.4 Quy trình chế biến dưa cải 21 2.4.1 Quy trình chế biến dưa cải truyền thống 21 2.4.2 Quy trình chế biến dưa cải công nghiệp 22 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Thời gian địa điểm 25 3.2 Khảo sát quy trình muối chua dưa cải 25 3.3 Khảo sát hàm lượng nitrate mẫu dưa cải vào thời điểm khác 25 3.3.1 Nguồn gốc mẫu thí nghiệm 25 3.3.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 25 3.3.3 Chuẩn bị mẫu 26 3.3.4 Xác định hàm lượng nitrate phương pháp so màu với Natri salicylate 28 3.4 Phân lập chủng vi khuẩn có khả khử nitrate 28 3.4.1 Vật liệu 28 3.4.2 Phương pháp phân lập 29 3.4.3 Phương pháp kiểm tra sinh hóa chủng vi sinh vật phân lập 29 3.5 Bổ sung vi khuẩn khử nitrate vào quy trình muối chua dưa cải 30 3.5.1 Quy trình sản xuất Cải muối chua dự kiến 30 v 3.5.1.1 Quy trình dự kiến 30 3.5.1.2 Thuyết minh quy trình 30 3.5.2 Bố trí thí nghiệm 31 3.5.2.1 Thí nghiệm khảo sát khả khử nitrate chủng M1, M2 31 3.5.2.2 Khảo sát hàm lượng nitrate dưa cải 32 3.5.2.3 Phương pháp đánh giá thông số mơi trường thí nghiệm 32 3.5.2.4 Đánh giá tiêu vi sinh 32 3.5.2.5 Theo dõi thay đổi đánh giá cảm quan 33 3.6 Phương pháp xử lý số liệu 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Kết khảo sát quy trình muối chua dưa cải truyền thống 34 4.2 Kết khảo sát hàm lượng nitrate có dưa cải điểm khác 35 4.3 Kết quả phân lập chủng vi sinh vật khử nitrate 36 4.3.1 Kết quả phân lập làm 36 4.3.2 Kết định danh vi khuẩn phản ứng sinh hóa 37 4.3.2.1 Kết nhuộm Gram 37 4.3.2.2 Kết kiểm tra khả khử nitrate chủng phân lập 38 4.3.2.3 Kết kiểm tra sinh hóa chủng M1 M2 39 4.4 Bổ sung vi khuẩn khử nitrate vào quy trình muối chua dưa cải 40 4.4.1 Hàm lượng nitrate mẫu dưa cải có bổ sung vi khuẩn 40 4.4.2 Các thông số môi trường 42 4.4.2.1 Thông số pH q trình thí nghiệm 42 4.4.2.2 Hàm lượng acid tổng số q trình thí nghiệm 43 4.4.2.3 Mật độ vi khuẩn khử nitrate sau 24 120 lên men 44 4.4.3 Kết tiêu vi sinh 45 4.4.4 Sự thay đổi cảm quan đánh giá cảm quan 46 4.5 Đề xuất quy trình muối chua dưa cải có hàm lượng nitrate đạt giới hạn an tồn 49 4.5.1 Sơ đồ quy trình 49 4.5.2 Giải thích quy trình 50 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CFU Colony Forming Unit ctv Cộng tác viên DRBC Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ĐC Đối chứng FAO FIA Food and Agriculture Organization Flow Injection Analysis LB Luria Bertani MPN Most Probable Number Method MR – VP Methyl Red, Voges - Proskauer NA Nutrient Agar O/F Oxydation/Fermentation OD Optical Density UV – VIS Ultraviolet - Visible WHO World Health Organization vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần hóa học cải bẹ (% khối lượng) Bảng 2.2 Thành phần chất màu 100g nguyên liệu Bảng 2.3 Thành phần chất dinh dưỡng 100g phần ăn tỏi Bảng 2.4 Chỉ tiêu đường saccharose sử dụng sản xuất Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu nơi lấy mẫu 25 Bảng4.1 Thống kê kết khảo sát (%) 34 Bảng 4.2 Mật độ vi khuẩn tổng số mẫu phân lập 36 Bảng 4.3 Đặc tính khuẩn lạc phân lập môi trường Giltay 37 Bảng 4.4 Đặc điểm nhuộm Gram chủng phân lập 38 Bảng 4.5 Một số phản ứng sinh hóa dùng để định danh chủng M1 M2 39 Bảng 4.6 Hàm lượng nitrate thời gian lên men 40 Bảng 4.7 Sự tạo thành acid tổng số thời gian muối chua 43 Bảng 4.8 Mật độ vi khuẩn khử nitrate sau 24 120 lên men 44 Bảng 4.9 Kết tiêu đánh giá vi sinh sau 120 lên men 45 Bảng 4.10 Những thay đổi cảm quan trình muối dưa sau 48 47 Bảng 4.11 Những thay đổi cảm quan trình muối dưa sau 120 48 viii Phụ lục 3: Thành phần môi trường sử dụng Môi trường Giltay Dung dịch A: Asparagine 1g KNO3 1g Nước cất 0,25 l Dung dịch B: Cao tịt Peptone NaCl Gelatine pH Citric acid/citrate kali KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2.6H2O FeCl2.4H2O Nước cất Agar Thêm nước cất đủ lít Mơi trường MR - VP Peptone 5g Glucose 5g K2HPO4 NaCl 5g Nước cất lít Mơi trường canh tryptone Tryptone trypticase 10 g Nước cất lít g/(8,5 g) 1g 1g 0,2 g vết 0,25 l 20 g Môi trường gelatine 3g 5g 5g 120 g 6,8 ± 0,2 Môi trường Hugh Leifson Peptone 2,0 g K2HPO4 0,3 g NaCl 5,0 g Dextrose 10 g Bromothymol blue 0,05 g Môi trường Simmon citrate agar NH4H2PO4 1g KH2PO4 1g NaCl 5g Sodium citrate 2g MgSO4 0,2 g Agar Nước cất Bromothymol blue Agar 3g lít Mơi trường lên men lactose 0,08 g 13 g Môi trường lên men glucose Tryptone NaCl Cao thịt Lactose Phenol red 10 g 5g 1g 5g 0,018 g Tryptone NaCl Cao thịt Glucose Phenol red 10 g 5g 1g 5g 0,018 g Nước cất lít Nước cất lít Mơi trường dịch thể nitrate Cao thịt 10 g Peptone 5g KNO3 1g Môi trường di động Tryptone NaCl Cao thịt 10 g 5g 1g Môi trường LB Trytone Yeast extract NaCl pH 7.2 Môi trường Thornley 10 g 5g 8g lít Peptone NaCl K2HPO4 Arginine HCl Phenol red Agar pH: 7,2 1g 5g 0,3 g 10 g 0,01g 3g Phụ lục 4: Phương pháp xác định mật độ tế bào Nguyên tắc Đếm số khuẩn lạc mọc môi trường Giltay từ lượng mẫu xác định sở xem khuẩn lạc hình thành từ tế bào số lượng khuẩn lạc xuất đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường điều kiện ủ Mật độ tế bào lớn làm khuẩn lạc chồng chéo lên nhau, khó xác định Ngược lại, mật độ khuẩn lạc đĩa qua nhỏ khơng có ý nghĩa mặt thống kê, số lượng khuẩn lạc tối ưu 25 – 250 khuẩn lạc/ đĩa (theo FDA, AOAC) Cách tiến hành Bước 1: pha loãng mẫu theo dãy thập phân Mẫu pha loãng thành dãy thập phân 10-1, 10-2, 10-3,…mỗi bậc pha loãng 10-1 thực cách hút ml mẫu vào ml nước cất có ống nghiệm khử trùng Sau lắc kỹ pha loãng 10-1 Tiếp tục pha loãng ta 10-2, 10-3… Bước 2: tạo hợp trải hay hộp đổ Hộp trải: lắc ống pha loãng liên tiếp, dùng micro pipet hút 0,1 ml dịch pha loãng dàn mặt thạch que gạt thủy tinh vô trùng Mỗi độ pha loãng dàn mặt thạch que cấy trang vơ trùng Mỗi độ pha lỗng cấy lặp lại đĩa petri, đem ủ nhiệt độ thích hợp Hộp đổ: môi trường chuẩn bị chai thủy tinh hấp khử trùng sau để nguội đến khoảng 50oC (môi trường dạng lỏng) dùng micro pipet hút ml dịch mẫu pha loãng vào đĩa petri trống hấp khử trùng sấy khô (mỗi nồng độ lặp lại lần) sau đổ khoảng 15 ml môi trường chuẩn bị vào đĩa Xoay đĩa để mơi trường dịch pha lỗng trộn đều, để khơ đem ủ nhiệt độ thích hợp Phụ lục 5: Nguyên tắc đếm số vi khuẩn phương pháp Drop plate Count (đếm sóng nhỏ giọt) Dựa nguyên tắc phương pháp đếm gián tiếp số lượng vi sinh vật môi trường thạch đĩa, việc đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật mọc môi trường thạch đĩa sau thời gian nuôi cấy xác định Nguyên tắc xem khuẩn lạc tính tế bào vi sinh vật có mẫu ban đầu Cụ thể sử dụng phương pháp Drop plate Count 10-7 10-6 10-5 Cùng độ pha lỗng Hình 5.1 Ph ng pháp Drop plate Count Cơng thức tính số lượng vi khuẩn ml dịch mẫu độ pha loãng: A(vsv/ml) = a x B x h Trong : a= : số khuẩn lạc trung bình có hàng ngang độ pha lỗng ai: tổng số khuẩn lạc hàng ngang độ pha loãng n: số lần lặp lại cho độ pha loãng h: hệ số pha loãng B= : hệ số thể tích quy ml Tính số lượng vi khuẩn ml dịch mẫu nguyên: lấy trung bình số lượng vi sinh vật có ml dịch mẫu n độ pha loãng khác (A1, A2, A3) Atb = Ưu điểm: Dễ thực hiện, xác nhanh chóng Phụ lục 6: Định lượng acid tổng số phương pháp chuẩn độ Therne  Nguyên tắc: Dựa phản ứng trung hòa acid có mẫu dung dịch kềm NaOH 0,1 N với chất thị phenolphtalein Từ lượng NaOH trung hòa trên, ta tính lượng acid tổng số có mẫu Trong phản ứng trung hòa đây, theo nguyên tắc ion hóa, kết thúc phản ứng pH (vì acid thực phẩm acid hữu nghĩa acid yếu trung hòa hết hồn tồn lượng kiềm mạnh pH 7) Vì người ta dùng phenolphthalein chuyển màu pH ~ 8,2  Phương pháp tiến hành Lấy 100 ml nước cất (đã tách khí cách đun sơi, làm nguội) cho vào bình tam giác 250 ml, cho ml dung dịch thị phenolphtalein Đặt bình tam giác lên máy khuấy từ khuấy Đặt nhẹ đầu cực đo máy pH vào dung dịch (tránh va chạm với cánh khuấy từ) dùng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn tới pH=8,2 (có xuất màu hồng nhạt bền khoảng phút Cho ml dịch lên men vi khuẩn (đã lắc khoảng phút để loại bỏ CO2) vào bình tiếp tục chuẩn dung dịch NaOH 0,1 N đạt pH=8,2 (có màu hồng nhạt bền khoảng phút) Định lượng acid ngày đợt, đợt lặp lại thí nghiệm lần ngày liên tiếp - Tính kết quả: Hàm lượng acid tổng số dịch lên men cần tính theo mg đương lượng lít dịch lên men (mEq/l) g acid lít (g/l) Ae = (n * 1000)/ V, mEq/l; Ax = (n * K * 1000)/ V, g/l Trong : Ae: lượng acid có lit sản phẩm tính theo mg đương lượng Ax: lượng acidc có lít sản phẩm, g/l; n: số ml NaOH 0,1 N tiêu hao định phân mẫu thực, ml; V: lượng mẫu mang phân tích K: số g acid tương ứng với ml NaOH 0,1 N Với acid lactic = 0,0090 Phụ lục 7: Quy trình đánh giá vi sinh 7.1 Xác định tổng vi khuẩn hiếu khí Pha lỗng mẫu để có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3….10-6 Chọn nồng độ pha lỗng thích hợp, dùng micro pipet chuyển 0,02 ml mẫu vào đĩa môi trường Nutrient agar hấp vô trùng (1 đĩa môi trường phân làm ô, nồng độ phân vào ơ), ủ nhiệt độ phòng Chọn có số khuẩn lạc khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/ơ để đếm Tính kết quả: tổng vi sinh vật hiếu khí mẫu (cfu/ml) Hình 7.1 Sơ đồ quy trình xác định tổng vi khuẩn hiếu khí 7.2 Xác định Tổng men mốc Chuẩn bị dịch đồng pha lỗng mẫu để có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10- Chuyển 0,1ml mẫu nồng độ pha lỗng vào đĩa petri vơ trùng có chứa mơi trường DRBC ( nồng độ từ 2- đĩa ), ủ 37 0C, 5-7 ngày Chọn số đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/ đĩa để đếm Đếm số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc ( CFU/g ) Hình 7.2 Sơ đồ quy trình định lượng tổng nấm men nấm mốc Cơng thức tính tổng vi sinh hiêu khí: N A ( CFU/g hay CFU/mL) = (n1Vf1 +….+ niVfi) Trong đó: A: Số tế bào vi khuẩn ml hay 1mg N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni : số lượng đĩa cấy nồng độ pha lỗng thứ I V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa fi : Độ pha loãng tương ứng 7.3 Định lượng Coliform E coli phương pháp MPN Chuẩn bị dịch đồng pha loãng mẫu để có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10- (thực môi trường peptone đệm nước cất vô trùng) Chuyển ml dung dịch 10-1, 10-2, 10- vào ống chứa ml môi trường LB, nồng độ ống lặp lại, ủ 37 0C 48h Cấy vào ống canh BGBL, ủ 370C, 48 h Cấy vào ống canh EC ủ 440C, 24 h Số ống (+) độ pha loãng, Tra bảng MPN Số ống (+) độ pha loãng Coliforms Cấy lên thạch EMB, ủ 370C, 24 Thử phản ứng sinh hóa canh Trypton, MR-VP, SC citrate 440C, 24h E.coli Đếm ống canh EC (+) thử nghiệm sinh hóa ++ , tra bảng MPN Hình 7.3 Sơ đồ quy trình định lượng Coliform E coli phương pháp MPN Phụ lục 8: Hình ảnh phân lập, nhuộm Gram,sinh hóa, thí nghiệm Hình 8.1 Chủng M1 Hình 8.2 Chủng M2 f Hình 8.3 Chủng M3 Hình 8.4 Chủng M4 g Hình 8.5 Từ trái qua: Thử nghiệm Arginine dyhydrolase, Lên men lactose, thử nghiệm lên men glucose, Thử nghiệm citrate Hình 8.6 Thử nghiệm O/F, Indol, catalase, di động Hình 8.7 Kết thí nghiệm Hình 8.8 Dưa cải sau ngày lên men Hình 8.9 Hàm lượng nitrate nghiệm thức sau 24 lên men Hình 8.10 Hàm lượng nitrate nghiệm thức sau 48 lên men Hình 8.11 Hàm lượng nitrate nghiệm thức sau 120 lên men Hình 8.12 Hàm lượng nitrate nghiệm thức sau 24 lên men mẫu dưa cải thị trường Phụ lục 9: Kết phân tích Anova LSD phần mềm MSTATC hàm lượng nitrate Bảng 9.1 Hàm lượng nitrate dưa cải (mg/kg) Nghiệm thức ĐC Bổ sung M1 Bổ sung M2 Bổ sung M1 M2 Lần lặp lại A B C A B C A B C A B C Sau ngày 2297,4 2381,7 2160,4 1991,8 1222,5 2086,6 2213,1 2740,0 2192,0 1833,7 1454,3 1875,8 2276,3 2423,8 2276,3 2149,8 2055,0 1960,1 2170,9 2318,4 2339,5 2202,5 1032,8 2002,3 Sau ngày 1738,8 1475,4 1633,5 1096,0 1138,1 1359,5 1085,5 1243,5 1348,9 558,5 516,4 769,3 Sau ngày 1654,5 1454,3 1612,4 1180,3 990,6 1169,8 1180,3 1233,0 1222,5 474,2 558,5 737,7 653,4 516,4 927,4 474,2 526,9 632,3 769,3 706,1 737,7 411,0 453,2 516,4 674,5 653,4 885,2 347,8 305,6 442,6 611,2 663,9 716,6 347,8 663,9 484,8 Sau ngày 537,5 337,2 611,2 284,5 800,9 400,5 442,6 347,8 400,5 210,8 274,0 252,9 316,2 358,3 569,1 347,8 263,5 337,2 252,9 316,2 368,8 252,9 242,4 242,4 Sau ngày 210,8 210,8 326,7 179,2 200,2 284,5 200,2 221,3 274,0 189,7 274,0 210,8 189,7 305,6 295,1 263,5 263,5 295,1 210,8 168,6 221,3 242,4 347,8 231,8 9.1 Hàm lượng nitrate sau ngày nghiệm thức Bảng kết phân tích ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 779023.843 259674.614 3.737 0.0604 Within 555925.038 69490.630 Total 11 1334948.881 Coefficient of Variation = 12.74% Bảng kết phân tích trắc nghiệm phân hạng Error Mean Square = 69490 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 496.3 at alpha = 0.050 _&k2S Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 2303 1911 2329 1734 A AB A B Mean Mean Mean Mean = = = = 2329 2303 1911 1734 A A AB B 9.2 Hàm lượng nitrate sau ngày nghiệm thức A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1506409.810 502136.603 77.512 0.0000 Within 51825.389 6478.174 Total 11 1558235.199 Coefficient of Variation = 7.04% Bảng kết phân tích trắc nghiệm phân hạng Error Mean Square = 6478 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 151.5 s_ = 46.47 at alpha = 0.050 x _&k2S Original Order Mean Mean Mean Mean = = = = 1595 1156 1219 602.6 A B B C Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 1595 1219 1156 602.6 A B B C 9.3 Hàm lượng nitrate sau ngày nghiệm thức Bảng kết phân tích ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 355120.616 118373.539 14.072 0.0000 Within 20 168240.715 8412.036 Total 23 523361.331 Coefficient of Variation = 15.59% Bảng kết phân tích trắc nghiệm phân hạng Error Mean Square = 10090 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 189.1 at alpha = 0.050 _&k2S Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 718.4 454.9 700.8 485.5 A B A B Mean Mean Mean Mean = = = = 718.4 700.8 485.5 454.9 A A B B 9.4 Hàm lượng nitrate sau ngày nghiệm thức Bảng kết phân tích ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 93829.577 31276.526 5.842 0.0205 Within 42832.406 5354.051 Total 11 136661.983 Coefficient of Variation = 19.55% Bảng kết phân tích trắc nghiệm phân hạng Error Mean Square = 7220 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 160.0 at alpha = 0.050 _&k2S Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 454.9 405.7 354.8 245.9 A AB AB B Mean Mean Mean Mean = = = = 454.9 405.7 354.8 245.9 A AB AB B 9.5 Hàm lượng nitrate sau ngày nghiệm thức Bảng kết phân tích ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2669.175 889.725 0.450 Within 15832.460 1979.058 Total 11 18501.635 Coefficient of Variation = 18.42% Bảng kết phân tích trắc nghiệm phân hạng Error Mean Square = 1979 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 83.76 at alpha = 0.050 _&k2S Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 255.6 247.7 216.1 249.3 A A A A Mean Mean Mean Mean = = = = 255.6 249.3 247.7 216.1 A A A A Phụ lục 10: Kết phân tích ANOVA LSD acid tổng số 10.1 Hàm lượng acid tổng số sau 24 lên men Bảng kết phân tích ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 25166.667 8388.889 10.486 0.0038 Within 6400.000 800.000 Total 11 31566.667 Coefficient of Variation = 15.02% Bảng kết phân tích trắc nghiệm phân hạng Error Mean Square = 800.0 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 53.25 at alpha = 0.050 _&k2S Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 266.7 160.0 153.3 173.3 A B B B Mean Mean Mean Mean = = = = 266.7 173.3 160.0 153.3 A B B B 10.2 Hàm lượng acid tổng số sau 120 lên men Bảng kết phân tích ANOVA A N A L Y S I S O F Degrees of V A R I A N C E Sum of T A B L E Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 22190.333 7396.778 2.189 0.1672 Within 27037.333 3379.667 - Total 11 49227.667 Coefficient of Variation = 8.23% Bảng kết phân tích trắc nghiệm phân hạng Error Mean Square = 3380 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 109.5 at alpha = 0.050 _&k2S Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean = = = = 780.0 682.0 689.0 673.3 A A A A Mean Mean Mean Mean = = = = 780.0 689.0 682.0 673.3 A A A A Phụ lục 11: Kết khảo sát thông số pH Nghiệm thức ĐC Bổ sung M1 Bổ sung M2 Lần lặp lại A B C A B C A B A Bổ sung B M1 M2 C Sau ngày 4,45 4,60 4,59 4,90 4,65 4,70 4,60 4,60 4,53 4,56 4,70 4,80 pH Sau ngày 4,04 3,82 3,70 4,57 4,52 4,54 4,54 4,64 4,55 4,56 4,54 4,50 Sau ngày 4,10 4,02 3,90 4,73 4,33 4,52 4,52 4,49 4,50 4,48 4,52 4,57 Sau ngày 3,90 3,21 3,83 4,61 4,55 4,63 4,63 4,61 4,58 4,53 4,52 4,63 Sau ngày 3,67 3,40 3,93 4,69 4,51 4,58 4,60 4,57 4,49 4,52 4,59 4,53 Phụ lục 12: Hàm lượng nitrate sản phẩm theo quy định số tổ chức Bảng 12.1 Dư lượng nitrate (mg/kg rau tươi) cho phép số loại rau Loại rau Nga (1) CAC/FAO (2) Việt Nam (3) Bắp cải 500 500 500 Cà chua 150 300 300 - - 1000 Cải 500 300 300 Cải - - 1000 Dưa leo 150 150 150 Đậu ăn 150 150 150 Xà lách 1500 2000 1500 Cải bẹ xanh Nguồn: Phạm Thị Minh Tâm (2001) Ghi chú: (1), (2) Bùi Quang Xuân, Bùi Đình Dinh, Mai Phương Anh (1996) (3) Nguyễn Văn Uyển (1995) Phụ lục 13: Giới hạn cho phép vi sinh vật rau, sản phẩm rau, Quy định giới hạn tối đa nhiễm sinh học hóa học thực phẩm (ban hành kèm Quyết định số 46/2007/QĐ – BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 trưởng Bộ Y tế Sản phẩm Rau muối, rau khô Loại vi sinh vật Giới hạn vi sinh vật (trong 1g hay ml thực phẩm) TSVSVHK 104 Coliforms 10 E.coli Khơng có Cl perfringens 10 B.cereus 102 TSBTNM-M 102 ... đề tài : Ứng dụng vi sinh vật có lợi nhằm giảm hàm lượng nitrate dưa muối chua thực 1.2 Yêu cầu Làm giảm hàm lượng nitrate dưa cải vi sinh vật Từ đó, đề xuất quy trình muối chua dưa cải đạt... THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG VI SINH VẬT NHẰM GIẢM HÀM LƯỢNG NITRATE TRONG DƯA MUỐI CHUA Hướng dẫn khoa học Sinh vi n thực TS NGUYỄN TIẾN THÀNH NGUYỄN... vi c loại bỏ làm giảm nitrate thực phẩm trước đưa vào sử dụng quan tâm Do xác định hàm lượng sở để đánh giá chất lượng thực phẩm vi c cần có phương pháp để làm giảm hàm lượng Nitrate có dưa muối