KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ BẢO QUẢN BUỒNG TRỨNG LÊN QUÁ TRÌNH TẠO PHÔI BÒ in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ BẢO QUẢN BUỒNG TRỨNG LÊN QUÁ TRÌNH TẠO PHƠI BỊ in vitro Ngành học : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : LÊ VĂN HUY TIN EM Niên khóa : 2009 – 2013 Tháng 06/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ BẢO QUẢN BUỒNG TRỨNG LÊN Q TRÌNH TẠO PHƠI BỊ IN VITRO Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS CHUNG ANH DŨNG LÊ VĂN HUY TIN EM KS NGUYỄN CHÍ HIẾU Tháng 06/2013 LỜI CẢM ƠN Ngay từ thuở nhỏ tơi có ước mơ trở thành kĩ sư công nghệ sinh học Chung tay với bạn bè bước tiếp đường bậc tiền bối kiến tạo thành tựu khoa học để góp phần nhỏ bé vào nghiệp phát triển đất nước Ngày nay, tơi hồn thành đề tài tốt nghiệp mình, dù nhỏ tất tâm huyết sức lao động Trong q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp nhận giúp đỡ lớn từ phía nhà trường, mơn CNSH, giáo viên hướng dẫn, gia đình bạn bè Tơi ln ghi khắc cơng ơn đó, tình cảm Em xin chân thành cảm ơn đếnBan Giám Hiệutrường ĐH Nông Lâm Tp.HCM, đến quý thầy côBMCông Nghệ Sinh Học, đến thầy Lê Đình Đơn, đến Tơ Thị Nhã Trầm tạo điều kiện để em học tập, nghiên cứu sinh hoạt trường Xin cảm ơn tất quý thầy cô đứng lớp Tuy thời gian học tập không nhiều thầy cô truyền đạt cho chúng em kiến thức vô quý báu Em xin chân thành cảm ơn đến Viện KHKTNN Miền Nam, đến thầy Chung Anh Dũng tạo điều kiện cho em tiến hành thí nghiệm viện,tận tình hướng dẫn em viết đề cương, bố trí thí nghiệm, giải đáp thắc mắc chỉnh sửa khóa luận tốt nghiệp giúp em Cám ơn anh Nguyễn Chí Hiếu anh Nguyễn Trường Hận đãtrực tiếp hướng dẫn, giải đáp thắc mắc, chỉnh sửa khóa luận giúp em Con xin cảm ơn cha mẹ nuôi nấng dạy dỗ nên người Cha mẹ truyền cho nghị lực, kiên trì, tâm cơng việc sống Em xin cảm ơn anh chị động viên gánh vác công việc thay em để em có nhiều thời gian cho học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn đến tất bạn lớp lớp thăm hỏi, động viên tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Một lần xin chân thành cảm ơn xin chúcnhà trường, môn Công nghệ Sinh học, giáo viên hướng dẫn, gia đình bạn bè lớp dồi sức khỏe, thành công học tập, công việc sống Tp.Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013 Lê Văn Huy Tin Em i TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng yếu tố bảo quản buồng trứng lên q trình tạo phơi bò in vitro”được thực phòng Cơng Nghệ Sinh Học thuộc viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam nhằm mục tiêu cải thiện tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phơi nang Buồng trứng bò sau giết mổ bảo quản nước muối sinh lý (0,9% NaCl bổ sung penicillin streptomycin) nhiệt độ 10oC, 24oC 37oC giờ, 12 để đánh giá tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phôi nang Trứng chọc hút nuôi trưởng thành môi trường TCM-199 tủ ấm 38,5oC, 5% CO2, độ ẩm 90% 24 Trứng trưởng thành thụ tinh vi giọt tinh trùng (mỗi giọt chứa 100 l tinh dịch, nồng độ 12×106 tinh trùng/ml) Sau thụ tinh giờ, phôi giả định nuôi vi giọt môi trường Cr1aa Sau đó, thí nghiệm khảo sát hiệu hormone ngựa chửa (PMSG) nồng độ khác bổ sung vào môi trường TCM-199 tiến hành trứng chọc hút từ buồng trứng bảo quản 24oC để theo dõi tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phôi nang Kết cho thấy trứng bò hút từ buồng trứng bảo quản 24oC cho tỉ lệ IVM, IVF, phôi dâu phôi nang cao ổn định (tỉ lệ tương ứng 46,95%, 31,71%, 25,64% 12,82%) Kết thí nghiệm khảo sát nồng độ PMSG bổ sung vào môi trường TCM-199 cho thấy tỉ lệ IVM tỉ lệ IVF trứng nghiệm thức (TCM-199 + 10 UI/ml PMSG) cao so với đối chứng (tương ứng 47,62%, 46,95% 33,64%, 31,71) Nhưng tỉ lệ phôi dâu phôi nang nghiệm thức (TCM-199 + 20 UI/ml PMSG) thấp so với đối chứng Sự khác biệt tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu, tỉ lệ phôi nang nghiệm thức đối chứng, nghiệm thức nghiệm thức khơng có ý nghĩa thống kê Như vậy, việc bổ sung PMSG nồng độ 10UI/ml 20UI/l vào môi trường nuôi trứng trưởng thành không cải thiện tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phôi nang ii SUMMARY The thesis “Effects of some ovary storage factors on the in vitro bovine embryos production”, whose targets are improvement on the rates of IVM, IVF, morula and blastocyst, was carried out at Biotechnology Department, the Institute of Agricultural Science for Southern Vietnam In the first experiment, slaughtered bovine ovaries were preserved inphysiological saline (0.9% NaCl combine with penicillin and streptomycin) at 10oC, 24oC or 37oC for 4, or 12 hours to value the rates of IVM, IVF, morula and blastocyst Then the oocytes were aspirated and in vitro matured in TCM-199 medium in the incubator at 38.5oC, 5% CO2 and 90% – 100% humidity for 24 hours Matured oocytes were fertilized with spermatozoa in small drops (100 l per drop, 12×106 sperms/ml) Five hours after fertilization, assumed zygotes were cultured in small drops of Cr1aa medium The second experiment tested the effect of TCM-199 medium supplemented with various concentrations of Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)on oocytes aspirated from the ovary was preserved at 24oC in hours to value the rates of IVM, IVF, morula and blastocyst The result of the first experiment indicated that the oocytes of the ovaries preserved at 24oC in hours give the highest and most stable rates of IVM, IVF, morula and blastocyst (46.95%, 31.71%, 25.64% and 12.82% respectively) In the second experiment, IVM and IVF rates in treatment 1(TCM-199 + 10 UI/ml PMSG) were higher than in the control (47.62%, 46.95% and 33.64%, 31.71% respectively) In contrast, morula and blastocyst rates the treatment and (TCM-199 + 20 UI/ml PMSG) were lower than the control However, the difference of IVM, IVF, morula and blastocyst rates of the control, treament and treatment was not statistically significant Therefore, the supplement of 10UI/ml and 20UI/ml PMSG to the oocytes matured medium had not improve the rates of IVM, IVF, morula and blastocyst Keywords: ovary storage, bovine embryos, fertilization, IVM, IVF, morula, blastocyst,PMSG iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2.Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1.Lịch sử phát triển thụ tinh in vitro 2.1.1 Lịch sử phát triển IVF giới .3 2.1.2.Lịch sử phát triển IVF Việt Nam .4 2.2.Thụ tinh in vitro 2.2.1.Định nghĩa 2.2.2.Sinh lý sinh sản bò 2.2.2.1.Cơ quan sinh sản bò .6 2.2.2.2.Chu kỳ động dục bò .8 2.2.2.3.Sự hình thành phát triển nang trứng .9 2.2.2.4.Sự rụng trứng .10 2.2.3.Sinh lý sinh sản bò đực 12 2.2.3.1.Cơ quan sinh sản bò đực 12 2.2.3.2.Sự hình thành tinh trùng 13 2.2.4.Sinh lý thụ tinh .13 2.2.4.1 Quá trình thụ tinh 13 2.2.4.2.Phản ứng cực đầu 14 2.2.4.3.Xuyên màng suốt .14 iv 2.2.4.4.Sự hòa nhập tinh trùng – trứng 14 2.2.4.5.Hoạt hóa trứng 14 2.2.4.6.Phản ứng vỏ chế ngăn chặn đa thụ tinh .15 2.2.4.7.Sự hình thành tiền nhân hòa nhập nhân 15 2.2.5.Sự phát triển phôi 16 2.2.5.1.Sự phân chia biệt hóa phơi giai đoạn sớm .16 2.2.5.2.Sự phân cắt đơn .17 2.2.5.3.Sự hình thành phôi dâu phôi nang 17 2.2.6.Các yếu tố ảnh hưởng đến IVF .18 2.2.6.1.Yếu tố bò mẹ .18 2.2.6.2.Sự trưởng thành trứng 18 2.2.6.3.Kích thước tế bào trứng .18 2.2.6.4.Giống bò cho trứng .19 2.2.6.5.Yếu tố bò cho tinh .19 2.2.7.Khả ứng dụng IVF 19 2.3.Nghiên cứu bảo quản buồng trứng phục vụ cho IVF 20 2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng PMSG IVF 23 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 3.2.Vật liệu 24 3.3.Phương pháp nghiên cứu 26 3.3.1.Bố trí thí nghiệm 26 3.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian bảo quản buồng trứng lên tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF tỉ lệ phát triển phôi 26 3.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng PMSG bổ sung vào môi trường TCM-199 lên tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF tỉ lệ phát triển phôi 27 3.3.2.Các bước tiến hành .27 3.3.2.1.Thu mẫu buồng trứng bò lò mổ 27 3.3.2.2.Chọc hút trứng phòng thí nghiệm .28 3.3.2.3 Nuôi trứng trưởng thành 29 3.3.2.4.Thụ tinh ống nghiệm 30 3.3.2.5.Nuôi kiểm tra trứng thụ tinh 30 v 3.4.Xử lý số liệu 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ lên tỉ lệ IVM, tỉ lệ phát triển phôi 32 4.1.1.Ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ lên tỉ lệ trưởng thành trứng 32 4.1.1.1 Ảnh hưởng thời gian lên trình trưởng thành trứng .32 4.1.1.2.Ảnh hưởng nhiệt độ lên trình trưởng thành trứng 34 4.1.2.Ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ lên tạo phôi in vitro 36 4.1.2.1.Ảnh hưởng thời gian lên phát triển phôi 37 4.1.2.2.Ảnh hưởng nhiệt độ lên phát triển phôi 39 4.2.Ảnh hưởng ảnh hưởng PMSG bổ sung vào môi trường TCM-199 lên tỉ lệ IVM, tỉ lệ IVF tỉ lệ phát triển phôi .43 4.2.1.Ảnh hưởng nồng độ PMSG lên trưởng thành trứng 43 4.2.2.Ảnh hưởng PMSG lên phát triển phôi 43 4.3.Thảo luận 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1.Kết luận 46 5.2.Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .47 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BO :Brackett – Oliphant BSA :Bovine Serume Albumin buCFF :Cystic Folucuiar Fluid For Buffalo cAMP :Cyclic Adenosine Monophosphate CS :Calf Serum ctv :cộng tác viên D – PBS :Dubelco’s Phosphate Buffer Saline FBS :Fetal Bovine Serum FSH :Follicle Stimulating Hormone GDF – :Growth Differentiation Factor GnRH :Gonadotropin Releasing Hormone HCG :Human Chorionic Gonadotropin ICM :Inner Cell Mass IVF :in vitro Fertilization IVM :in vitroMaturity LH :Luteinizing Hormone LIF :Leukemia Inhibitory Ractor NST :Nhiễm Sắc Thể PGF2 :Prostaglandin Kxđ :Không Xác Định Pt4-8, PC10-24 :Prob PMSG :Pregnant Mare Serum Gonadotropin TCM-199 :Tissue Culture Media TGF :Transforming Growth Factor UI :International Unit VEGF :Vascular Endothelial Growth Factor ZP1, ZP2, ZP3 :Zona Pellucida 1, 2, vii F2 DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1Thành tựu IVF động vật có vú Bảng 2.2Các thành tựu IVF động vật có vú Việt Nam .5 Bảng 3.1Thiết bị cần thiết sử dụng thí nghiệm 24 Bảng 3.2Các hóa chất sử dụng thí nghiệm 25 Bảng 3.3Các loại môi trường 26 Bảng 3.4Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian nhiệt độ 26 Bảng 4.1 Tỉ lệ IVM trứng thời gian bảo quản khác .32 Bảng 4.2Tỉ lệ IVM trứng bảo quản 10oC khoảng thời gian 33 Bảng 4.3Tỉ lệ IVM trứng bảo quản 24oC khoảng thời gian 33 Bảng 4.4Tỉ lệ IVM trứng bảo quản 37oC khoảng thời gian 33 Bảng 4.5 Tỉ lệ IVM trứng nhiệt độ bảo quản khác 34 Bảng 4.6Tỉ lệ IVM trứng sau bảo quản mức nhiệt độ khác 34 Bảng 4.7Tỉ lệ IVM trứng sau bảo quản mức nhiệt độ khác 35 Bảng 4.8 Tỉ lệ IVM trứng sau 12 bảo quản mức nhiệt độ khác 35 Bảng 4.9 Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phôi nang thời gian khác 37 Bảng 4.10 Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phôi nang trứng bảo quản 10oC 37 Bảng 4.11 Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phôi nang trứng bảo quản ở24oC .38 Bảng 4.12Tỉ lệ IVF bảo quản 37oC khoảng thời gian khác 39 Bảng 4.13 Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phôi nang thời gian khác 39 Bảng 4.14Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phôi nang trứng sau bảo quản 40 Bảng 4.15Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phôi nang trứng sau bảo quản 41 Bảng 4.16Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu tỉ lệ phôi nang trứng sau 12 bảo quản 42 Bảng 4.17Tỉ lệ IVM nồng độ khác PMSG 43 Bảng 4.18Tỉ lệ IVF, tỉ lệ phôi dâu, tỉ lệ phôi nangkhi bổ sung PMSG .43 viii 4.2 Môi trường BO Bảng.7 Thành phần môi trường BO Thành phần Dung dịch A-BO Sodium pyruvate Penicilin Streptomycin Dung dịch B-BO Hàm lượng 76 ml 0,01375 g 10000 IU 10 mg 24 ml Lưu ý: Chuẩn bị ngày sử dụng Sodium pyruvate kháng sinh thêm vào dung dịch A sau trộn với dung dịch B Tiệt trùng dung dịch phương pháp lọc 4.3 Dung dịch rửa tinh Bảng.8 Thành phần dung dịch rửa tinh Thành phần Hàm lượng Dung dịch BO 50 ml Na Caffeine Benzoate 0,1942 g Heparin (“Novo-heparin”: 5000 UI/ml) 50 µl 4.4 Dung dịch rửa trứng Bảng.9 Thành phần dung dịch rửa trứng Thành phần Dung dịch BO BSA (Bovine serum albumin) Hàm lượng 40 ml 400 mg 4.5 Dung dịch pha loãng tinh Bảng.10 Thành phần dung dịch pha loãng tinh Thành phần Dung dịch BO BSA (Bovine serum albumin) Hàm lượng 10 ml 200 mg 51 Môi trường nuôi phôi Bảng.11 Thành phần dung dịch A-Cr1aa Thành phần NaCl KCl Natri pyruvate NaHCO3 Phenol red Nước siêu Hàm lượng 6,7031 g 0,2311 g 0,0440 g 2,2011 g 10 µg/ml Đủ 700 ml Bảng.12 Thành phần dung dịch B-Cr1aa Thành phần Hemicalcium lactate Nước siêu Hàm lượng 0,5996 g Đủ 200 ml Bảng.13 Thành phần môi trường Cr1aa Thành phần A-Cr1aa B-Cr1aa BME MEM L-Glutamic acid BSA Penicillin Streptomycin Hàm lượng 15,4 ml ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,06 g 0,01207 g 0,02 g Khi sử dụng, bổ sung 5% FBS vào môi trường Cr1aa 52 Phụ lục 2.Hình ảnh liên quan đề tài Hình Một số thao tác thí nghiệm (a) pha hóa chất,(b) bảo quản trứng 37oC bể ổn nhiệt,( c)chọc hút trứng, (d) hoạt hóa tinh,(e) ni phơi, (f) kiểm tra phát triển phơi Hình Phân loại trứng (a) trứng chụp vật kính 4X, (b) trứng loại A chụp vật kính 10X, (c) trứng loại B chụp vật kính 10X, (d) trứng loại C chụp vật kính 10x; 1: trứng loại A, 2: trứng loại B; 3: trứng loại C Hình 3.Sự xâm nhập tinh trùng (a) trứng ủ vi giọt tinh trùng chụp vật kính 10X, (b) trứng thụ tinh rõ hai thể cực chụp vật kính 20X; 1: tinh trùng xuyên màng suốt; 2: hai thể cực 53 Phụ lục 3.Danh sách bảng số liệu Bảng 14.Chitest tỉ lệ IVM ba mức thời gian bảo quản Thời gian (giờ) 12 Tổng Số trứng trưởng thành 355 315 219 889 Số trứng không trưởng thành 423 458 550 1431 Tổng 778 773 769 2320 Tỉ lệ IVM (%) 45,63 40,75 28,48 P 0,00 Bảng 15.Chitest tỉ lệ IVF ba mức thời gian bảo quản Thời gian (giờ) 12 Tổng Tổng phôi 75 78 21 174 Không tạo phôi 280 237 198 715 Tổng 355 315 219 889 Tỉ lệ IVF (%) 21,13 24,76 9,59 P 0,00 Bảng 16.Chitest tỉ lệ phôi dâu ba mức thời gian bảo quản Thời gian (giờ) 12 Tổng Phôi dâu 17 19 37 Không đạt phôi dâu 58 59 20 137 Tổng 75 78 21 174 Tỉ lệ phôi dâu (%) 22,67 24,36 4,76 P 0,14 Bảng 17.Chitest tỉ lệ phôi nang ba mức thời gian bảo quản Thời gian (giờ) 12 Tổng Phôi nang 11 Không đạt phôi nang 70 72 21 163 Tổng 75 78 21 174 Tỉ lệ phôi nang (%) 6,67 7,69 0,00 P 0,43 Bảng 18.Chitesttỉ lệ IVMba mức nhiệt độ bảo quản Nhiệt độ (oC) 10 24 37 Tổng Tổng trứng trưởng thành 392 320 177 889 Trứng không trưởng thành 460 448 523 1431 54 Tổng 852 768 700 2320 Tỉ lệ IVM (%) 46,01 41,67 25,29 P 0,00 Bảng 19.Chitest tỉ lệ IVFba mức nhiệt độ bảo quản Nhiệt độ (oC) 10 24 37 Tổng Trứng không tạo phôi 312 240 163 715 Tổng số phôi 80 80 14 174 Tổng Tỉ lệ IVF (%) P 392 320 177 889 20,41 25,00 7,91 0,00 Bảng 20.Chitest tỉ lệ phôi dâuba mức nhiệt độ bảo quản Nhiệt độ (oC) 10 24 37 Tổng số phôi dâu Không đạt phôi dâu Tổng Tỉ lệ phôi dâu (%) P 18 18 37 62 62 13 137 80 80 14 174 22,50 22,50 7,14 0,40 Bảng 21.Chitest tỉ lệ phôi nangba mức nhiệt độ bảo quản Nhiệt độ (oC) 10 24 37 Tổng số phôi nang 11 Không đạt phôi nang 77 72 14 163 Tổng 80 80 14 174 Tỉ lệ phôi nang (%) 3,75 10,00 0,00 P 0,16 Bảng 22.Chitest tỉ lệ IVMtừng cặp thời giankhi bảo quản 10oC Số trứng Số trứng không Nhiệt độ Thời gian o (giờ) trưởng thành trưởng thành ( C) 168 129 133 135 10 Tổng 301 264 168 129 12 91 196 10 Tổng 259 325 133 135 12 91 196 10 Tổng 224 331 55 Tổng 297 268 565 297 287 584 268 287 555 Tỉ lệ IVM (%) 56,57 49,63 P 0,10 56,57 31,71 0,00 49,63 31,71 0,00 Bảng 23.Chitest tỉ lệ IVMtừng cặp thời giankhi bảo quản 24oC Nhiệt độ (oC) 24 24 24 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số trứng Số trứng không trưởng thành trưởng thành 132 131 123 139 255 270 132 131 74 169 206 300 123 139 74 80 Tổng 197 Tổng 263 262 525 263 243 506 262 243 219 Tỉ lệ IVM (%) 50,19 46,95 P 0,46 50,19 30,45 0,00 46,95 30,45 0,00 Bảng 24.Chitest tỉ lệ IVMtừng cặp thời giankhi bảo quản 37oC Nhiệt độ (oC) 37 37 37 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số trứng trưởng thành 57 59 116 57 54 111 59 54 113 Số trứng không trưởng thành 161 184 345 161 185 346 184 185 369 Tổng 218 243 461 218 239 457 243 239 482 Tỉ lệ IVM (%) 26,15 24,28 P 0,64 26,15 22,59 0,38 24,28 22,59 0,66 Bảng 25.Chitest tỉ lệ IVFtừng cặp thời giankhi bảo quản 10oC Nhiệt độ (oC) 10 10 10 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số phôi Không tạo phôi Tổng 39 30 69 39 11 50 30 11 41 129 103 232 129 80 209 103 80 183 168 133 301 168 91 259 133 91 224 56 Tỉ lệ IVF (%) 23,21 22,56 P 0,89 23,21 12,09 0,03 22,56 12,09 0,05 Bảng 26.Chitest tỉ lệ IVFtừng cặp thời giankhi bảo quản 24oC Nhiệt độ (oC) 24 24 24 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số phôi 31 39 70 31 10 41 39 10 49 Không tạo phôi 101 84 185 101 64 165 84 80 164 Tổng 132 123 255 132 74 206 123 74 213 Tỉ lệ IVF (%) 23,48 31,71 P 0,14 23,48 13,51 0,09 31,71 13,51 0,00 Bảng 27.Chitest tỉ lệ IVFtừng cặp thời giankhi bảo quản 37oC Nhiệt độ (oC) 37 37 37 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số phôi 14 5 9 Không tạo phôi 52 50 102 52 54 106 50 54 104 Tổng 57 59 116 57 54 111 59 54 113 Tỉ lệ IVF (%) 8,77 15,25 P 0,28 8,77 0,00 0,03 15,25 0,00 0,00 Bảng 28.Chitest tỉ lệ phôi dâu cặp thời gian bảo quản 10oC Nhiệt độ (oC) 10 10 10 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số phôi dâu 10 18 10 10 8 Không tạo phôi dâu 29 22 51 29 11 40 22 11 33 57 Tổng 39 30 69 39 11 50 30 11 41 Tỉ lệ phôi dâu (%) 25,64 26,67 P 0,92 25,64 0,00 0,06 26,67 0,00 0,06 Bảng 28 Chitest tỉ lệ phôi dâu cặp thời gian bảo quản 24oC Nhiệt độ (oc) 24 24 24 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số phôi dâu 10 17 10 11 Không tạo phôi dâu 24 29 53 24 33 29 38 Tổng 31 39 70 31 10 41 39 10 49 Tỉ lệ phôi dâu (%) 22,58 25,64 P 0,77 22,58 10,00 0,38 25,64 10,00 0,29 Bảng 29 Chitest tỉ lệ phôi dâu cặp thời gian 37oC Nhiệt độ (oC) 37 37 37 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số phôi dâu 1 0 1 Không tạo phôi dâu 13 5 8 Tổng 14 5 9 Tỉ lệ phôi dâu (%) 0,00 11,11 P 0,44 0,00 0,00 kxđ 11,11 0,00 kxđ Bảng 30 Chitest tỉ lệ phôi nang cặp thời gian bảo quản 10oC Nhiệt độ (oC) 10 10 10 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số phôi nang 2 1 Không tạo phôi nang 37 29 66 37 11 48 29 11 40 58 Tổng 39 30 69 39 11 50 30 11 41 Tỉ lệ phôi nang (%) 5,13 3,33 P 0,72 5,13 0,00 0,44 3,33 0,00 0,54 Bảng 31 Chitest tỉ lệ phôi nang cặp thời gian bảo quản 24oC Nhiệt độ (oC) 24 24 24 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số phôi nang 3 5 Không tạo phôi nang 28 34 62 28 10 38 34 10 44 Tổng 31 39 70 31 10 41 39 10 49 Tỉ lệ phôi nang (%) 9,68 12,82 P 0,68 9,68 0,00 0,31 12,82 0,00 0,23 Bảng 32 Chitest tỉ lệ phôi nang cặp thời gian bảo quản 37oC Nhiệt độ (oC) 37 37 37 Thời gian (giờ) Tổng 12 Tổng 12 Tổng Số phôi nang 0 0 0 0 Không tạo phôi nang 14 5 9 Tổng 14 5 9 Tỉ lệ phôi nang (%) 0,00 0,00 kxđ 0,00 0,00 kxđ 0,00 0,00 kxđ Bảng 33 Chitest tỉ lệ IVM cặp nhiệt độ bảo quản Thời gian Nhiệt độ Số trứng Số tr không Tỉ lệ IVM Tổng (giờ) (oC) trưởng thành trưởng thành (%) 10 168 129 297 56,57 24 132 131 263 50,19 Tổng 300 260 560 10 168 129 297 56,57 37 57 161 218 26,15 Tổng 225 290 515 24 132 131 263 50,19 37 57 161 218 26,15 Tổng 189 292 481 59 P P 0,13 0,00 0,00 Bảng 33 Chitest tỉ lệ IVM cặp nhiệt độ bảo quản Thời gian (giờ) 8 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số trứng trưởng thành 133 123 256 133 59 192 123 59 182 Số tr không Tổng trưởng thành 135 268 139 262 274 530 135 268 184 243 319 511 139 262 78 243 217 399 Tỉ lệ IVM (%) 49,63 46,95 P 0,54 49,63 24,28 0,00 46,95 24,28 0,00 Bảng 34 Chitest tỉ lệ IVM cặp nhiệt độ bảo quản 12 Thời gian (giờ) 12 12 12 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số trứng trưởng thành 91 74 165 91 54 145 74 54 128 Số tr không Tổng trưởng thành 196 287 169 243 365 530 196 287 185 239 381 526 169 243 185 239 354 482 Tỉ lệ IVM (%) 31,71 30,45 P 0,76 31,71 22,59 0,02 30,45 22,59 0,05 Bảng 35 Chitest tỉ lệ IVF cặp nhiệt độ bảo quản Thời gian (giờ) 4 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số phôi 39 31 70 39 44 31 36 Không tạo phôi 129 101 230 129 52 181 101 52 153 60 Tổng 168 132 300 168 57 225 132 57 189 Tỉ lệ IVF (%) 23,21 23,48 P 0,96 23,21 8,77 0,02 23,48 8,77 0,02 Bảng 36 Chitest tỉ lệ IVF cặp nhiệt độ bảo quản Thời gian (giờ) 8 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số phôi 30 39 69 30 39 39 48 Không tạo phôi 103 84 187 103 50 153 84 50 162 Tổng Tỉ lệ IVF(%) P 133 123 256 133 59 192 123 59 210 22,56 31,71 0,10 22,56 15,25 0,25 31,71 15,25 0,00 Bảng 37 Chitest tỉ lệ IVF cặp nhiệt độ bảo quản 12 Thời gian (giờ) 12 12 12 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số phôi 11 10 21 11 11 10 10 Không tạo phôi 80 64 144 80 54 134 64 54 118 Tổng 91 74 165 91 54 145 74 54 128 Tỉ lệ IVF (%) 12,09 13,51 P 0,78 12,09 0,00 0,01 13,51 0,00 0,00 Bảng 38 Chitest tỉ lệ phôi dâu cặp nhiệt độ bảo quản Thời gian (giờ) 4 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số phôi dâu 10 17 10 10 7 Không tạo phôi dâu 29 24 53 29 34 24 29 61 Tổng 39 31 70 39 44 31 36 Tỉ lệ phôi dâu (%) 25,64 22,58 P 0,77 25,64 0,00 0,20 22,58 0,00 0,24 Bảng 39 Chitest tỉ lệ phôi dâu cặp nhiệt độ bảo quản Thời gian (giờ) 8 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số phôi dâu 10 18 10 11 Không tạo phôi dâu 22 29 51 22 30 29 107 Tổng 30 39 69 30 39 39 118 Tỉ lệ phôi dâu (%) 26,67 25,64 P 0,92 26,67 11,11 0,33 25,64 11,11 0,00 Bảng 40 Chitest tỉ lệ phôi dâu cặp nhiệt độ bảo quản 12 Thời gian (giờ) 12 12 12 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số phôi dâu 1 0 1 Không tạo phôi dâu 11 20 11 11 9 Tổng 11 10 21 11 11 10 10 Tỉ lệ phôi dâu (%) 0,00 10,00 P 0,28 0,00 0,00 kxđ 10,00 0,00 kxđ Bảng 41 Chitest tỉ lệ phôi nang cặp nhiệt độ bảo quản Thời gian (giờ) 4 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số phôi nang 2 3 Không tạo phôi nang 37 28 65 37 42 28 33 62 Tổng 39 31 70 39 44 31 36 Tỉ lệ phôi nang (%) 5,13 9,68 P 0,46 5,13 0,00 0,60 9,68 0,00 0,47 Bảng 42 Chitest tỉ lệ phôi nang cặp nhiệt độ bảo quản Thời gian (giờ) 8 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số phôi nang 1 5 Không tạo phôi nang 29 34 63 29 38 34 112 Tổng 30 39 69 30 39 39 117 Tỉ lệ phôi nang (%) 3,33 12,82 P 0,17 3,33 0,00 0,58 12,82 0,00 0,00 Bảng 43 Chitest tỉ lệ phôi nang cặp nhiệt độ bảo quản 12 Thời gian (giờ) 12 12 12 Nhiệt độ (oC) 10 24 Tổng 10 37 Tổng 24 37 Tổng Số phôi nang 0 0 0 0 Không tạo phôi nang 11 10 21 11 11 10 10 Tổng 11 10 21 11 11 10 10 Tỉ lệ phôi nang (%) 0,00 0,00 P kxđ 0,00 0,00 kxđ 0,00 0,00 kxđ Bảng 44 chitest tỉ lệ IVM trứng nồng độ PMSG khác Nồng độ PMSG Trứng (UI/ml) trưởng thành 123 10 110 20 111 Tổng 344 Không trưởng thành 139 121 135 395 63 Tổng Tỉ lệ IVM(%) P 262 231 246 739 46,95 47,62 45,12 0,85 Bảng 45 Chitest tỉ lệ IVM trứng cặp nồng độ PMSG khác Nồng độ PMSG Trứng (UI/ml) trưởng thành 123 10 110 Tổng 233 123 20 111 Tổng 234 10 110 20 111 Tổng 221 Không trưởng thành 139 121 260 139 135 274 121 135 256 Tổng Tỉ lệ IVM (%) P 262 231 493 262 246 508 231 246 477 0,47 0,48 0,88 0,47 0,45 0,68 0,48 0,45 0,58 Bảng 46 Chitest tỉ lệ IVF trứng nồng độ PMSG khác Nồng độ PMSG (UI/ml) 10 20 Tổng Số phôi Không tạo phôi Tổng Tỉ lệ IVF (%) P 39 37 32 108 84 73 79 236 123 110 111 344 31,71 33,64 28,83 0,74 Bảng 47 Chitest tỉ lệ IVF trứng cặp nồng độ PMSG khác Nồng độ PMSG (UI/ml) 10 Tổng 20 Tổng 10 20 Tổng Số phôi Không tạo phôi Tổng Tỉ lệ IVF (%) P 39 37 76 39 32 71 37 32 69 84 73 157 84 79 163 73 79 152 123 110 233 123 111 234 110 111 221 31,71 33,64 0,75 31,71 28,83 0,63 33,64 28,83 0,44 Bảng 48 Chitest tỉ lệ phôi dâu nồng độ PMSG khác Nồng độ PMSG (UI/ml) 10 20 Tổng Số phôi dâu 10 24 Không đạt phôi dâu 29 29 26 84 64 Tổng phôi 39 37 32 108 Tỉ lệ phôi dâu (%) 25,64 21,62 18,75 P 0,78 Bảng 49 Chitest tỉ lệ phôi dâu cặp nồng độ PMSG khác Nồng độ PMSG (UI/ml) 10 Tổng 20 Tổng 10 20 Tổng Số phôi dâu 10 18 10 16 14 Không đạt phôi dâu 29 29 58 29 26 55 29 26 55 Tỉ lệ phôi dâu P (%) 25,64 0,68 21,62 Tổng phôi 39 37 76 39 32 71 37 32 69 25,64 18,75 0,49 21,62 18,75 0,77 Bảng 50 Chitest tỉ lệ phôi nang nồng độ PMSG khác Nồng độ PMSG (%) 10 20 Tổng Số phôi nang 1 Không đạt phôi nang 34 36 31 101 Tổng phôi 39 37 32 108 Tỉ lệ phôi nang (%) 12,82 2,70 3,13 P 0,13 Bảng 51 Chitest tỉ lệ phôi nang cặp nồng độ PMSG khác Nồng độ PMSG (%) 10 Tổng 20 Tổng 10 20 Tổng Số phôi nang 6 1 Không đạt phôi nang 34 36 70 34 31 65 36 31 67 65 Tổng phôi 39 37 76 39 32 71 37 32 69 Tỉ lệ phôi nang (%) 12,82 2,70 P 0,10 12,82 3,13 0,14 2,70 3,13 0,92 ... Khảo sát ảnh hưởng yếu tố bảo quản buồng trứng lên q trình tạo phơi bò in vitro thực 1.2 Yêu cầu đề tài  Xác định thời gian nhiệt độ bảo quản buồng trứng bò tối ưu cho phát triển phơi bò in. .. VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ BẢO QUẢN BUỒNG TRỨNG LÊN QUÁ TRÌNH TẠO PHƠI BỊ IN VITRO. .. gian bảo quản buồng trứng bò: giờ, 12 lên trưởng thành trứng phát triển phơi bò in vitro  Từ kết nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng thời gian nhiệt độ bảo quản buồng trứng bò lên trưởng thành trứng