Đánh giá và phát hiện gen kháng bệnh bạc lá xa4, xa5 và xa7 của tập đoàn nguồn gen lúa địa phương

Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện genkháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, xa5 và Xa7, đánh giá khả năng kháng nhiễm của 136mẫu giố

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ LƯƠNG

ĐÁNH GIÁ VÀ PHÁT HIỆN GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Xa4, xa5 VÀ Xa7 CỦA TẬP ĐOÀN

NGUỒN GEN LÚA ĐỊA PHƯƠNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phan Hữu Tôn

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực

và chưa sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lương

Tôi cũng xin được cám ơn ThS Tống Văn Hải cùng các thầy cô trong Bộ mônSinh học phân tử và CNSH ƯD, các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học cũng nhưcác cán bộ nghiên cứu của Trung tâm Bảo tồn & Phát triển Nguồn gen Cây trồng đãnhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành tốt luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người luôn bên cạnh độngviên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lương

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình

viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích nghiên cứu của đề tài 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Khái quát về bệnh bạc lá 3

2.1.1 Nguyên nhân, triệu chứng của bệnh bạc lá 3

2.1.2 Các chủng vi khuẩn gây bệnh 5

2.1.3 Phương pháp phân lập và lây nhiễm 6

2.2 Gen kháng và nguồn gen kháng bệnh bạc lá

8 2.2.1 Gen kháng bệnh bạc lá và chỉ thị liên kết với gen kháng 8

2.2.2 Di truyền tính kháng bệnh bạc lá 12

2.2.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá 14

2.3 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá 17

2.3.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá trên thế giới 17

2.3.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở Việt Nam

19 Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 22

3.1 Vật liệu nghiên cứu 22

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện các gen kháng bệnh bạc lá 25

3.4.2 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo 27

3.4.3 Phân loại loài phụ, nếp tẻ, đặc điểm nông sinh học năng suất 27

3.4.4 Xử lý số liệu 30

Phần 4 Kết quả nghiên cứu 31

4.1 Kết quả phát hiện gen kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử DNA 31

4.1.1 Kết quả phát hiện gen kháng bạc lá Xa4 31

4.1.2 Kết quả phát hiện gen kháng bạc lá Xa7 31

4.1.3 Kết quả phát hiện gen kháng bạc lá xa5 32

4.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo 35

4.3 Phân loại loài phụ, nếp tẻ, đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng của các mẫu giống nghiên cứu 45

4.3.1 Kết quả phân loại loài phụ, nếp tẻ 45

4.3.2 Kết quả đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng 48

4.3.3 Chiều cao cây 54

4.3.4 Khả năng đẻ nhánh, nhánh hữu hiệu và kiểu đẻ nhánh 54

4.3.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 55

4.3.6 Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng gạo 62

Phần 5 Kết luận và đề nghị 75

5.1 Kết luận 75

5.2 Đề nghị 75

Tài liệu tham khảo 76

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ

AFLP : Amplified Fragment length PolymorphismBAD2 : Enzyme betaine aldehyde dehydrogenase 2DNA : Deoxiribo Nucleic Acid

ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long

IRRI : International Rice Research Institue

GBSS : Grainule bound starch synthase

-enzyme tổng hợp amyloseIFAP : Internal fragrant antisense primer -

mồi nội biên của cặp mồi phát hiện gen fgr.INSP : Internal non-fragrant sense primer-

mồi nội biên của cặp mồi phát hiện gen fgrPCR : Polymerase Chain Reaction

QTLs : Quantitative Trait Locus

RFLP : Restriction Fragment Length PolymorphismRAPD : Random Amplified Polymorphic DNA SRFA : Selective Restriction Fragment AmplicationSSR : Simple Sequence Repeates hay Microsatellite

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách các giống lúa địa phương sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 3.2 Danh sách 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá 24

Bảng 3.3 Thành phần của dung dịch chiết tách DNA 25

Bảng 3.4 Thành phần dung dịch TE để bảo quản DNA 25

Bảng 3.5 Chỉ thị phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7 24

Bảng 4.1 Kết quả sử dụng chỉ thị phân tử phát hiện gen kháng bạc lá Xa4, xa5, Xa7 33

Bảng 4.2 Phản ứng của các giống lúa đối với 10 chủng vi khuẩn lây nhiễm nhân tạo 38

Bảng 4.3 Phân loại nguồn gen nghiên cứu 45

Bảng 4.4a Đặc điểm nông sinh học cơ bản của các mẫu giống lúa nếp 49

Bảng 4.4 b Đặc điểm nông sinh học cơ bản của các mẫu giống lúa tẻ 52

Bảng 4.5a Các yếu tố cấu thành năng suất của các giống lúa thuộc nhóm nếp 56

Bảng 4.5b Các yếu tố cấu thành năng suất của các giống lúa thuộc nhóm tẻ 59

Bảng 4.6a Kết quả đánh giá các tính trạng chất lượng gạo nếp 63

Bảng 4.6b Kết quả đánh giá các tính trạng chất lượng gạo tẻ 66

Bảng 4.7a Kết quả đánh giá mùi thơm các giống lúa nếp 68

Bảng 4.7b Kết quả đánh giá mùi thơm các giống lúa tẻ 70

Bảng 4.8a Hàm lượng amylose của các mẫu giống lúa nếp 71

Bảng 4.8b Hàm lượng amylose của các mẫu giống lúa tẻ 73

Bảng 4.9 Đặc điểm của 20 mẫu giống tốt đã được lựa chọn 74

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Một số hình ảnh điển hình về biểu hiện triệu chứng của bệnh bạc

lá lúa 4

Hình 2.2 Bản đồ phân bố các chủng bạc lá ở các tỉnh miền Bắc 6

Hình 2.3 Một số gen kháng bệnh bạc lá định vị trên NST 10

Hình 2.4 Gen kháng Xa4 trên NST11 với chỉ thị Npb181 11

Hình 2.5 Gen kháng xa5 trên NST 5 với chỉ thị liên kết RG556, RM122 11

Hình 2.6 Gen kháng Xa7 trên NST số 6 12

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng Xa4 31

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng Xa7 32

Hình 4.3 Điện di phát hiện gen kháng bệnh bạc lá xa5 33

Hình 4.4a Phản ứng của IR24 với 10 chủng vi khuẩn 36

Hình 4.4b Phản ứng của IRBB4 với 10 chủng vi khuẩn 36

Hình 4.4c Phản ứng của IRBB5 với 10 chủng vi khuẩn 36

Hình 4.4d Phản ứng của IRBB7 với 10 chủng vi khuẩn 36

Hình 4.5 Lây nhiễm nhân tạo trên các mẫu giống lúa nghiên cứu 37

Hình 4.6 Phản ứng phenol 48

Hình 4.7 Phân loại nhóm nếp/tẻ 48

Hình 4.8 Màu sắc vỏ lụa các mẫu giống nếp 63

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Thị Lương

Tên Luận văn: “Đánh giá và phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5 vàXa7 của tập đoàn nguồn gen lúa địa phương”

Mục đích nghiên cứu

Đánh giá được các đặc điểm nông sinh học, khả năng kháng và chứa các genkháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, xa5 và Xa7 của nguồn gen lúa phục vụ cho công tácbảo tồn và khai thác hiệu quả nguồn gen lúa

Phương pháp nghiên cứu

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện genkháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, xa5 và Xa7, đánh giá khả năng kháng nhiễm của 136mẫu giống lúa địa phương bằng lây nhiễm nhân tạo với 10 chủng vi khuẩn bạc lá, đồngthời đánh giá một số đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng nhằm chọn lựa ranhững mẫu giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt, chứa gen kháng bệnh bạc lá vụ côngtác lai, chọn tạo giống lúa mới

Kết quả chính và kết luận

Áp dụng chỉ thị phân tử ADN phát hiện được 15 mẫu giống chứa gen khángXa4, 7 mẫu giống chứa gen xa5, 25 mẫu chứa gen Xa7 và 2 mẫu giống chứa đồng thời 2gen Xa4 và Xa7

Bằng lây nhiễm nhân tạo nhận thấy các mẫu giống chứa gen kháng Xa4 khángđược 6/10 chủng, các mẫu giống chứa gen xa5 kháng được 9/10 chủng, các mẫu giống

chứa gen Xa7 kháng được 8/10 chủng Qua lây nhiễm nhân tạo cũng xác định đượcchủng bệnh số 5 có độc tính mạnh nhất mà không gen kháng nào kháng được.

Đánh giá được một số đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng của 136mẫu giống lúa từ đó chọn được 20 mẫu giống năng suất cao, chất lượng và chứa genkháng bệnh bạc lá Đây là nguồn vật liệu quý cho các chương trình chọn tạo giống lúamới năng suất cao, chất lượng tốt và kháng bệnh bạc lá

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Nguyen Thi Luong

Thesis title: "Evaluation and indentifying resistance gen to Bacterial Leaf LightXa4, xa5 and Xa7 of local rice gene resources"

Major: Biotechnology Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA).Introduction

Bacterial leaf blight (BLB) caused by Xanthomonas oryzae rice bacterial pv.oryzae is a destructive diseases of rice in Asia and Vietnam The BLB disease reducesproductivity 10- 80 percent, even lost all Use resistant rice varieties is the mosteffective method to bring about economic efficiency and environmental protection Inorder to rice breeding success, the genetic resources play very an important role Ricegenetic resources of Vietnam is very diversity and abundant To use these geneticresources in rice breeding program, the first work is to evaluate genetic resources

Research Objectives

Evaluation of agronomic biological characteristics, resistance ability andcontaining effective resistance genes to BLB disease (Xa4, xa5 and Xa7 gene) of ricegenetic resources serve for the conservation and effective exploitation

Methodology

In this study we have used DNA molecular markers to identify effectiveresistance genes to bacterial leaf blight (Xa4, xa5 and Xa7 gene), testing ability toresistance and susceptible of 136 rice accessions with 10 bacterial leaf blight strains byartificial inoculation, simultaneously evaluate agronomic biological characteristics,yield and quality to select good varieties with high yield, good quality and resistance toBLB diseases serve for new rice breeding

Main findings and conclusions

Application DNA molecular marker we identified 15 varieties contain Xa4 gene,

7 varieties contain xa5 gene, 25 varieties contain Xa7 and two varieties with both Xa4and Xa7 gene

By artificial inoculation found that, rice varieties contain Xa4, xa5 and Xa7 generesistant to 6/10, 9/10 and 8/10 strains respectively Through artificial inoculation wealso identified number 5 strain was the most powerful toxicity that have not any genecan resistant

Evaluated agronomic biological characteristics, yield and quality of 136 riceaccessions, through that we selected 20 accessions that showed good quality, high yieldpotential, contain resistance gene to bacterial leaf blight These materials can be usedfor rice breeding program with high yield, good quality and bacterial leaf blightresistance.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae (Xoo) gây ra làmột trong những bệnh hại nguy hiểm nhất đối với cây lúa ở khu vực châu Á(Mew et al, 1993) Bệnh có thể làm ảnh hưởng 10-80% đến năng suất, thậm chímất trắng ( Singh et al, 1977) Trước đây bệnh thường gây hại nặng trong vụ mùa

ở miền Bắc Việt Nam, nhưng trong những năm gần đây do sự biến đổi của khíhậu mà bệnh gây hại nặng trong cả điều kiện vụ xuân (Phan Hữu Tôn và, 2012)

Để phòng trừ người ta đã sử dụng một số biện pháp xử lý như: xử lý hạtgiống trước khi gieo, bón phân cân đối, bón sớm tập trung, sử dụng thuốc bảo vệthực vật hóa học Các thuốc trừ sâu bệnh được sử dụng thường có độ độc tínhcao, diệt sâu bệnh nhanh, phổ tác dụng rộng Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc hóahọc để trừ sâu bệnh đã lên tới mức báo động, để lại nhiều hậu họa như làm tồn dưthuốc trên nông sản, gây hiện tượng côn trùng kháng thuốc, phá vỡ thế cân bằngsinh thái trên ruộng lúa do thuốc hóa học diệt cả côn trùng thiên địch và gây ônhiễm môi trường Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống kháng bệnh vẫn đượccoi là hướng có hiệu quả về cả mặt kinh tế và môi trường

Để chọn tạo thành công giống lúa kháng bạc lá phụ thuộc nhiều vào sốlượng và chất lượng vật liệu khởi đầu Việt Nam được coi là cái nôi của nhiềuloài cây lương thực quan trọng, trong đó có cây lúa Thành phần các giống lúanày rất đa dạng và phong phú Phần lớn các giống lúa địa phương có đặc điểmnhư: bông to,cơm thơm mềm, khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh, sâubệnh tốt Nắm bắt được tình hình đó, thời gian vừa qua Trung tâm Bảo tồn vàPhát triển Nguồn gen Cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tiến hànhthu thập, lưu giữ được hơn 3.500 mẫu giống lúa trong và ngoài nước Để sử dụng

và khai thác hiệu quả nguồn gen này thì đánh giá cũng như phát hiện gen khángbệnh rất cần

thiết

Hiện nay, công nghệ sinh học ngày càng đạt được những thành tựu to lớn

Sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong việc phát hiện gen kháng bệnh trên cây lúađược áp dụng rộng rãi trên thế giới Các nhà khoa học trên thế giới đã xác địnhđược 42 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau Ở miền bắc Việt Nam theo Phan HữuTôn và cs, 2004; Taura et al., 2004; Lã Vĩnh Hoa và cs., 2010 có 4 gen Xa4, Xa5,

Xa7, Xa21 kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn gây bênh bạc lá Xuất phát từthực tế đó chúng tôi tiến hành làm đề tài “Đánh giá và phát hien gen kháng bệnhbạc lá Xa4, xa5, và Xa7 của tập đoàn nguồn gen lúa địa phương” Đề tài đượcthực hiện sẽ đáp ứng nhu cầu cấp bách cả về lý luận khoa học và thực tiễn sảnxuất chọn tạo giống kháng bạc lá hiện nay.

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Đánh giá các đặc điểm nông sinh học, khả năng kháng và chứa các genkháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, xa5 và Xa7 của nguồn gen lúa phục vụ chocông tác lưu giữ và khai thác hiệu quả nguồn gen

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Đánh giá và phát hiện gen kháng bạc lá của 136 mẫu giống lúa địa phươngViệt Nam

1.4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

* Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là đánh giá được nguồn gen, phát hiện và chọn lọcđược những mẫu giống lúa có nhiều đặc tính quý từ đó mở ra khả năng sử dụng,khai thác hiệu quả nguồn gen trong các chương trình chọn tạo giống lúa năngsuất, chất lượng và kháng bệnh bạc lá, đáp ứng nhu cầu xã hội và ứng phó vớibiến đổi khí hậu hiện tại và tương lai

* Ý nghĩa thực tiễn

Trong tập đoàn 136 mẫu giống lúa nghiên cứu chúng tôi đã chọn được 20mẫu giống lúa triển vọng có thể sử dụng trực tiếp nguồn gen này phát triển trongsản xuất đáp ứng được nhu cầu của thực tế, tăng hiệu quả kinh tế cho nông dân

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Vi khuẩn Xoo có hình gậy ngắn, hai đầu tròn, là vi khuẩn gram (-) vàkhông hình thành bào tử, có thể sống trong môi trường có độ pH 4,0 – 8,8 nhưng

khổng, đặc biệt qua vết thương xây xát trên lá Trong điều kiện mưa ẩm, trên bềmặt lá sẽ tiết ra những giọt dịch vi khuẩn và thông qua sự va chạm, tiếp xúc giữacác lá lúa bệnh có thể lây lan từ lá này sang lá khác để tiến hành xâm nhiễm lặplại nhiều lần trong suốt thời kỳ sinh trưởng và phát triển của cây lúa

mô khỏe có ranh giới rõ ràng theo gợn sóng màu vàng hoặc khô vàng, có khi cómột đường chỉ viền màu nâu sẫm đứt quãng hay không đứt quãng

Hình 2.1 Một số hình ảnh điển hình về biểu hiện triệu chứng

của bệnh bạc lá lúa2.1.1.3 Tác hại của bệnh bạc lá

Mức độ hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ nhiễm bệnh sớm haymuộn và mức độ bệnh nặng hay nhẹ Mức độ nặng hay nhẹ phụ thuộc vào tínhđộc của từng chủng vi khuẩn, mùa vụ, đặc tính của giống Cây lúa có thể bị giảmnăng suất tới 20 - 25% khi bệnh phát triển và xuất hiện trên lá đòng Bệnh bạc láphát sinh phá hại suốt thời kỳ mạ đến khi lúa chín

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá đã được phát hiện từ lâu trên các giống mùa cũ.Trong những năm gần đây, bệnh gây hại trên cả hai loại lúa lai và lúa thuần, đặcbiệt gây hại nặng trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Bệnh làm lá úa,lúa đòng sớm tàn, nhanh chóng bị khô chết, bộ lá úa xơ xác ảnh hưởng đến hiệuquả quang hợp tích lũy chất khô dẫn đến giảm khối lượng nghìn hạt, tỉ lệ lép cao,năng suất sút kém (Nguyễn Văn Viết và cs., 2005)

2.1.1.4 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá

Biện pháp canh tác: Sử dụng kết hợp với các kỹ thuật trong canh tác nhằmhạn chế nguồn bệnh và sự phát triển của bệnh Bao gồm các kỹ thuật : vệ sinhđồng ruộng, diệt trừ cỏ dại, xử lý hạt giống trước khi gieo trồng, bón phân cânđối, tăng cường bón phân hữu cơ, bón đạm sớm và tập trung

Biện pháp hóa học: dùng các loại thuốc hợp chất đồng, chất kháng sinhStreptomycin hoặc các chất như MBMAT Các chất này có bản chất kháng vikhuẩn gram âm

Biện pháp sinh học: Sử dụng giống kháng bệnh và sử dụng vi sinh vật đốikháng với vi khuẩn Xoo Các nhà khoa học đã được tìm thấy Pseudomomasfluorescens và một số chủng Bacillus được phân lập từ các mẫu đất vùng rễ lúa

có khả năng ức chế sự phát triển của X.oryzae.pv.oryzae trong phòng thí nghiệm(Gnanamanickam et al.,1999) hay chủng Lysobacter APMus được phân lập từ rễlúa của tỉnh Yunnan, Trung Quốc có khả năng ức chế phát triển của nhiều loạinấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật, trong đó có X.oryzae pv.oryzae (Jin etal.,2008) Đây là hướng đi mới trong chiến lược phòng chống bệnh bạc lá manglại hiệu quả cao

2.1.2 Các chủng vi khuẩn gây bệnh

Theo Ogawa et al (1986) và Noda et al (1999) nghiên cứu giống khángchủng bạc lá cho thấy ở Nhật Bản có 8 giống chứa gen kháng là Kinmaze,Kogyoku, Rantai- Emas, Wase Aikoku, Java Elwee, Hene Dikwee tương ứngphát hiện 9 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau là IA, Ib, II, IIIA, IIIB, IV, V,

VI, VII (Zhang Qi, 2007)

Các nhà khoa học IRRI đã tạo ra được các dòng đẳng gen kháng bệnh bạc

lá là IRBB4, IRBB10, IRBB5, IRBB7, IRBB14, IRBB21, đồng thời xác định có

10 chủng vi khuẩn Xoo: Race 1 (PXO61), Race 2 (PXO86), Race 3 (PXO79),Race 4 (PXO71), Race 5(PXO112), Race 6 (PXO99)¸ Race 7 (PXO145), Race 8(PXO280) , Race 9 (PXO330), Race 10 (PXO341) (Zhang Qi, 2007)

Theo nghiên cứu của Fang Zhong Da et al (1991) Trung Quốc có 5 giốngkháng bệnh bạc lá là Java14, Nam Geng 15, Jin Gang 30 tương ứng đã xác định 7chủng vi khuẩn bạc lá kí hiệu là I, II, III, IV, V, VI, VII Miền Bắc Trung quốcvùng trồng lúa Japonica chủ yếu tồn tại là chủng I, II, miền Nam khu vực trồnglúa Indica chủ yếu tồn tại chủng 4, 5, rất ít chủng 2

Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thủy (2004) đã phân lập 10 chủng vi khuẩngây bệnh bạc lá và bảo quản tại phòng thí nghiệm Học viện Nông nghiệp ViệtNam Miền Bắc Việt Nam chủ yếu tồn tại chủng 1, 2, 3, 4, 5, 7 trong đó miềnNam chủ yếu tồn tại chủng 2, 5, 10 (Phan Hữu Tôn, 2004; Naruto Furuya, et al,2002) Gần đây nhóm tác giả cũng đã phân lập 412 vi khuẩn gây bệnh bạc lá thuthập trên 39 giống lúa trồng phổ biến tại 19 tỉnh thuộc các tỉnh phía Bắc (PhanHữu Tôn, Tống Văn Hải và cs, 2012) Bằng lây nhiễm nhân tạo trên dòng đẳnggen và bằng chỉ thị phân tử đã phân loại 412 isolate thành 12 chủng bệnh Từ đótác giả cũng vẽ được phân bố của từng chủng ở miền Bắc Việt Nam Đây là dữliệu cực kỳ quý giá cho các nhà khoa học khi chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá

1 7

2 8

3 9

4 10

5 11

6 12

a 3 2

4 3 *4N Định 3 2 3 * BẢN ĐỒ PHÂN BỐ CHỦNG BỆNH BẠC LÁ MIỀN BẮC VIỆT NAM * T.Qua6ng 6 6

* Đ.Biên 2 2 6 * T.Nguyên6 6 3 10 10 5 3 2 5 3 2 * L.Châu 5 3 23 2

5 3 23 9 5 3 9 3 * 3 V.Phúc 3 1 4 1 3 3 3 10 * L.Sơn Chủng 5 3 5 3 2 * S L 5 3 9 3 4 1 3 4 * B.Ninh 8 2 10 2  Q.Ninh 1 1 3 4 3 H.Bình * 7 4

12 *7 H.Duong 2 12 811 * Hải Phòng * H.Yen 4 2 44 12 4 3 3 4 3 * T.Binh 4 3 4 3 T.Hóa * 3 4 4

* N Bình 5 2 2 3 5 3 2 3

Nghệ An 5 2 2 5

3 2 3

Hình 2.2 Bản đồ phân bố các chủng bạc lá ở các tỉnh miền Bắc

Nguồn: Phan Hữu Tôn và

cs (2012)

Tại phía Nam, Nguyễn Thị Liên và cs (2012) , trường Đại học Cần Thơ đã

sử dụng căp mồi XO290R-F được thiết kế khuếch đại đoan gen rhs có kích thước 290bp của vi khuẩn Xoo, kết quả đã nhận diện được 5 dòng vi khuẩn là OM66-1, OM98-1, OM98,TL6 và AG11 Đặc biệt một trong số đó có chứa gen rhs, một gen gây bệnh có độc tính cao mới được phát hiện có trong vi khuẩn Xoo

2.1.3 Phương pháp phân lập và lây nhiễm

2.1.3.1 Phân lập vi khuẩn

Vi khuẩn Xoo so với các loại vi khuẩn khác thường phát triển chậm hơn khi nuôi cấy ở môt trường nhận tạo, việc phân lập sẽ khó hơn đặc biệt từ hạt giống và đất Để phân lập thông thường người ta chọn những vết bệnh còn tươi Môi trường thích hợp để vi khuẩn sinh trưởng PH = 6,5 – 7,0 nhiệt độ thích hợp

Khi phân lập, bằng kinh nghiệm thì vi khuẩn lạc của vi khuẩn bạc lá có màu vàng rơm, bề mặt phồng lên và bóng Dựa vào đặc điểm này mà phân lập

Để khẳng định các khuẩn lạc đã được phân lập các nhà khoa học còn sửdụng chỉ thị phân tử để xác định Để phân biệt vi khuẩn gây bệnh bạc lá với các

vi khuẩn khác chỉ thị 16S và 23S được sử dụng Qua đó là vi khuẩn gây bệnh bạc

lá (Xoo) thì nhân lên đoạn DNA có kích thước 470 bp, là vi khuẩn khác thìkhông có đoạn ADN này được nhân lên (Furuya N và cs., 2000)

- Môi trường nuôi vi khuẩn bệnh bạc lá

Có rất nhiều loại môi trường để nuôi vi khuẩn Xoo nhưng môi trườngPSA (Potato semi – synthetic agar) là thích hợp nhất cho vi khuẩn phát triển Gầnđây môi trường nuôi cấy vi khuẩn thường được dùng là môi trường Wakimoto,

do chính Wakimoto tìm ra Môi trường này được coi là môi trường thích hợp hơn

cả dùng để phân lập và nuôi vi khuẩn phát triển Với môi trường Wakimoto khinuôi cấy vi khuẩn sau 48 giờ, dùng farafilm lỏng đổ ngập bề mặt vi khuẩn, đặt ởđiều kiện phòng có thể bảo quản được vi khuẩn 6-8 tháng mà không gây ảnhhưởng đến sinh trưởng, phát triển cũng như độc tính của vi khuẩn

2.1.3.2 Phương pháp lây nhiễm và đánh giá khả năng kháng bệnh

+ Vi khuẩn gây bệnh lây nhiễm qua vết thương: lỗ khí khổng, vết thươngsây sát trên lá, rễ lúa và thân lúa nên có rất nhiều phương pháp lây nhiễm được

đề xuất như: phương pháp phun vi khuẩn; phương pháp ngâm tưới; phương phápngâm rễ mạ; phương pháp châm kim và phương pháp cắt đầu lá

a Phương pháp phun

Trước khi nhổ mạ cấy 1-2 ngày, phun đều vi khuẩn cho lúa, giữ ẩm độ saulây nhiễm, phương pháp này giống với phương pháp lây nhiễm tự nhiên

b Phương pháp ngâm tưới

Phương pháp này tiếp cận xâm nhiễm tự nhiên Phương pháp ngâm doFang Zhong Da et al (1956) đề xuất, dùng nước vi chứa khuẩn ngâm tưới luống

mạ, phương pháp này thường sử dụng gieo mạ trên khay hoặc diện tích nhỏ(Zhang Qi, 2007)

c Phương pháp ngâm rễ mạ

Khi cây mạ bị tổn thương rễ khi nhổ cấy hoặc người ta cắt một phần rễtrước khi lây nhiễm, ngâm rễ vào trong nước chứa vi khuẩn với thời gian 3-6 giờ.Watanabe (1975) đã cải tiến phương pháp bằng cách trộn vi khuẩn lẫn vào đất,sau đó gieo hạt giống trên đất khô, làm như vậy sẽ tạo cơ hội xâm nhiễm đồngnhất khi hạt giống nảy mầm (Zhang Qi, 2007)

d Phương pháp châm kim

Chuẩn bị bọc xốp đã được thấm dung dịch vi khuẩn, đặt lá lên trên bọcxốp, sử dụng kim đơn hoặc kim kép đâm xuyên qua lá để tạo điều kiện cho vikhuẩn xâm nhập (Mukoo H, Yoshid K,1951), (Yoshida K, Mukoo H, 1961)

e Phương pháp cắt đầu lá

Do Kauffman et al (1973) đề xuất, dùng kéo vô trùng nhúng vào nướcchứa vi khuẩn sau đó cắt một lát cắt cách đầu lá 1-3 cm (tùy theo thời kỳ sinhtrưởng của cây lúa), vi khuẩn sẽ xâm nhập vào vị trí vết thương Hiệu quả xâmnhiễm của phương pháp này giống với phương pháp bấm kim Hệ số tương quangiữa hai phương pháp tương ứng r = 0,728 – 0,753 (Wu et al 1983) Các nhàkhoa học IRRI khi tiến hành lây nhiễm nhân tạo trên quy mô diện tích lớn đềuchủ yếu sử dụng phương pháp cắt đầu lá

Hiện nay phương pháp cắt đầu lá ở giai đoạn lúa từ trỗ đến làm đòng làphương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng kháng nhiễm củagiống Phương pháp này đơn giản, dễ làm và cùng một lúc có thể đánh giá đượcphản ứng của một hay nhiều giống với một hay nhiều chủng vi khuẩn (Furuya N

và cs., 2000)

2.2 GEN KHÁNG VÀ NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

2.2.1 Gen kháng bệnh bạc lá và chỉ thị liên kết với gen kháng

Cùng với việc xác định được các chủng bệnh và phân bố của của cácchủng bệnh bạc lá việc tìm ra nguồn gen kháng ở cây lúa với các chủng vi khuẩngây bệnh đó là rất cần thiết Cho đến nay đã có 42 gen kháng chính đã được pháthiện trên các giống lúa trồng và lúa hoang dại trên thế giới trong đó phần lớn tậptrung ở các nước Đông Nam Á Các gen kháng được tìm ra trên các giống khácnhau được ký hiệu từ Xa1 – Xa42 ( Chun et al., 2012;) Trên NST số 1 có 2 gen:

Xa 29 và xa34; NST số 2 có 1 gen là Xa24; NST số 3 có 1 gen là xa11; NST số 4

có 7 gen : Xa1, Xa2, Xa 12, Xa14, Xa25(t), Xa30(t), Xa31(t); NST số 5 có 1 gen

là xa5; NST số 6 có 3 gen là Xa7, Xa27, Xa33(t); NST số 7 có 1 gen là Xa8, NST

số 8 có 1 gen là xa13, NST số 11 có 10 gen Xa10, Xa23, Xa30(t), Xa3/Xa26,Xa22(t), Xa4, Xa32(t), Xa35(t) và Xa36(t); NST số 12 có 1 gen xa32

Như vậy trên tổng số 12 NST ở lúa thì có 10NST có chứa locus/gen quyđịnh tính kháng với các chủng khác nhau của vi khuẩn gây bệnh bạc lá Ở ViệtNam các tác giả Phan Hữu Tôn và cs, 2012; Bùi Trọng Thủy và cs, 2004 đã có

những kết luận là gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 là những gen kháng rất tốt đối vớicác chủng vi khuẩn bạc lá miền Bắc Việt Nam Tuy nhiên gen kháng Xa21không có mặt trong các giống lúa trồng mà chỉ có mặt ở các giống lúa hoang dại.Nên trong nghiên cứu này 3 gen kháng Xa4, xa5 và Xa7 được quan tâm và pháthiện trong gập đoàn 136 mẫu giống lúa địa phương Việt Nam Ba gen này đã xácđịnh được các chỉ thị liên kết, như vậy bằng kỹ thuật PCR có thể dễ dàng pháthiện sự hiện diện của gen này trong nguồn vật liệu nghiên cứu, các chỉ thị liênkết với các gen được tổng hợp ở bảng 2.1.

Ở Việt Nam một số gen kháng bệnh đã được tìm thấy trong các giống lúađịa phương ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và các tỉnh phía Bắc như genXa2 được tìm thấy ở giống lúa tẻ Tép, xa5 có ở giống lúa Ba Túc, Giòng Đôi,Kio Bo Teng, xa13 có ở giống Cà Đung, Thơm Lùn, Vệ Phích , Nếp Hoa Vàng,Nàng Sớm ( Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Bảng 2.1 Các chỉ thị phân tử liên kết với một số gen kháng bạc lá

Kiểuditruyền

LoạiChỉthịSSR

Chỉ thị liên kếtRM224

Khoảngcách1,0

Tài liệu thamkhảo

Sun et al., 2004Xa4 TKM6 11 Trội

Aus Boro

RFLPRFLPSSR

Npb181RG556RM122

1,7

<0,51,0

Wang et al.,2003Yer and McCouch, 2004xa5

Lines 5 Lặn

STS P3 2,5

Blair and McCouch, 2003Lee et al.,2000Xa7 DV85 6 Trội SSR RM5509 - Taura A et

al.,2004

Nhóm tác giả nghiên cứu tại trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội nay làHọc viện Nông nghiệp Việt Nam đã tiến hành phân lập các chủng bệnh vi khuẩngây bệnh bạc lá lúa trên các giống lúa phổ biến tại vùng trồng lúa từ Hà Tĩnh trở

ra và đánh giá khả năng kháng của các dòng lúa mang gen kháng với các chủng

vi khuẩn đã được phân lập Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả công bố rất phùhợp Các dòng lúa mang gen Xa4, xa5, Xa7 có khả năng kháng tốt với hầu hết

các chủng vi khuẩn gây bệnh ở các tỉnh phía Bắc (Phan Hữu Tôn và cs, 2004;Taura et al., 2004; Lã Vĩnh Hoa và cs., 2010) Các tổ hợp chứa gen xa5, Xa7 đềukháng mạnh với các chủng vi khuẩn gây bệnh ở các tỉnh phía Bắc ( Phan HữuTôn, Bùi Trọng Thủy, 2004), Gen Xa7, gen Xa21 có khả năng kháng cao với cácchủng gây bệnh phổ biến của các tỉnh phía Bắc (Vũ Hồng Quảng và cs., 2011)Ngoài ra gen Xa4, Xa7 còn có khả năng kháng tốt với các chủng gây bệnh trêncác giống ở ĐBSCL (Hoang et al.,2010) Các chỉ thị được các tác giả sử dụngphát hiện gen kháng là Npb181 (Xa4), RG556 (xa5), P3 (Xa7).

Bản đồ di truyền và chỉ thị liên kết của các gen kháng Xa4, xa5, Xa7 đượcđưa ra như sau:

Hình 2.3 Một số gen kháng bệnh bạc lá định vị trên NST

Hình 2.4 Gen kháng Xa4 trên NST11 với chỉ thị Npb181

Nguồn: Wang (2003)

Hình 2.5 Gen kháng xa5 trên NST số 5 với chỉ thị liên kết RG556, RM122

Nguồn: Blair and Mc Couch (2003)

Hình 2.6 Gen kháng Xa7 trên NST số 6

Nguồn: Porter B.W et al (2003)

Các dòng lúa mang gen kháng chuẩn như IRBB4 gen Xa4, IRBB5 gen xa5,IRBB7 gen Xa7 được sử dụng làm nguồn gen trong nghiên cứu và lai tạogiống lúa kháng bệnh bạc lá

2.2.2 Di truyền tính kháng bệnh bạc lá

Người ta có thể chia tính kháng sâu bệnh thành hai nhóm:

+ Tính kháng dọc (vertical resistance) còn được gọi là tính kháng chuyênđối với một vài nòi sinh lý nhất định, hay tính kháng không đồng nhất, tínhkháng chất lượng, tính kháng này thường không bền vững Nhược điểm là nòisinh lý thay đổi sẽ làm mất tính kháng

Cơ sở và đặc điểm của tính kháng nhiễm này là:

- Sự chuyên tính của một nòi nào đó cho phản ứng kháng hoặc nhiễm đốivới cây ký chủ

- Tính kháng nhiễm được kiểm soát bởi một hoặc một vài gen

- Tính kháng ít chịu ảnh hưởng của môi trường

- Rất hiệu quả đối với một số ít nòi, nhưng không hiệu quả đối với nhiềunòi khác

+ Tính kháng ngang (horizontance resistance) là phản ứng kháng tươngđương nhau với hầu hết các nòi và được kiểm soát bởi nhiều gen Tính kháng nàycòn được gọi là tính kháng toàn phần, tính kháng đồng nhất, tính kháng đa gen

Cơ sở tính kháng này là do:

- Sự không chuyên tính của các nòi cho phản ứng kháng với nhiều nòikhông nhất thiết có cùng mức độ

- Được kiểm soát bởi đa gen.

- Chịu ảnh hưởng tương tác với môi trường

- Có hiệu quả kháng ở một mức độ nhất định với nhiều nòi cho dù khôngcùng mức độ như nhau

- Có suy giảm ảnh hưởng nhất định sau khi hình thành quần thể ký sinh đủmạnh trên cây chủ

Do bản chất di truyền khác nhau nên khả năng kháng ngang, kháng dọckhông giống nhau Kháng dọc có tác dụng làm giảm nguồn bệnh ban đầu và trìhoãn sự bùng nổ của dịch bệnh Thời gian tồn tại khả năng kháng dọc phụ thuộcvào sự đa dạng di truyền trong quần thể ký sinh Kháng ngang không làm giảmbớt nguồn bệnh ban đầu nhưng lại làm giảm tốc độ phát triển của dịch bệnh Do

đó, kháng ngang có tính kháng bệnh bền vững hơn kháng dọc (Bùi Chí Bửu,Nguyễn Thị Lang, 2004)

Di truyền tính kháng bệnh lạc lá, theo Zhang, 2007, tính kháng của giốngvới độ độc tính của chủng có quan hệ điển hình, tính kháng của giống do genchính trong nhân khống chế Biểu hiện di truyền tính kháng của giống là số lượngphụ thuộc vào tính kháng của hai bố mẹ chứa gen chính kháng bệnh, bao gồmgen trội/lặn, tác dụng giữa các gen, liên kết gen, loại hình tính kháng (kháng suốttrong thời gian sinh trưởng hoặc kháng khi cây đã lớn)

Theo Zhu và cs (2000) để nghiên cứu mối quan hệ giữa tính kháng bệnhbạc lá ở lúa lai do nhân hay do tế bào chất Họ đã sử dụng 8 dòng bất dục đực,dòng duy trì (tế bào chất khác nhau) với 9 dòng phục hồi sử dụng để lai tạo con lai

và không có quan hệ với tế bào chất (Zhang Qi, 2007)

Di truyền tính kháng là di truyền số lượng bệnh bạc lá: Theo nghiên cứucủa Wan và Zhen (2007) cho biết, tính kháng bệnh bạc lá là tính trạng chấtlượng di truyền do gen chính khống chế, đồng thời cũng có thể là tính trạng sốlượng di truyền do đa gen khống chế; gen kháng bệnh liên kết với gen không lâynhiễm thì biểu hiện hiệu ứng kháng của gen chính, nếu liên kết với gen độc tínhthì biểu hiện kháng một phần hoặc tính kháng số lượng; gen chính với QRL(Quantitative Resistance Loci) tác dụng cấu thành phức tạp mang di truyền tínhkháng bệnh bạc lá

Tính kháng của giống: các giống khác nhau có tính kháng khác nhau rất

lớn, thông thường lúa nếp và các giống lúa thuộc loài phụ Japonica có tính khángcao hơn loài phụ Inidca; Giống có dạng lá hẹp và đứng tính kháng cao hơn lá to

và nằm ngang; giống có thủy khổng lá ít sẽ kháng mạnh hơn giống có thuỷ khổng

lá nhiều; giống chịu phân tốt sẽ có tính kháng cao hơn giống không chịu phânbón (Lã Vĩnh Hoa và cs., 2010)

2.2.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá

Trong những năm gần đây, chỉ thị phân tử DNA đã được đưa vào sử dụngphổ biến trong chọn tạo giống cây trồng Trong đó cây lúa là cây trồng được cácnhà nghiên cứu quan tâm.Với những kết quả đạt được, vai trò của chỉ thị DNA đãđược khẳng định là công cụ hữu ích giúp các nhà chọn tạo giống rút ngắn thờigian tạo giống mới theo mục tiêu chất lượng, năng suất, chống chịu sâu bệnh.Một số chỉ thị được sử dụng trong chọn tạo giống

2.2.3.1.Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA: Chỉ thị đa hình chiều dài các đoạn cắtgiới hạn - RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism):

Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiêncứu lập bản đồ gen liên quan đến bệnh ở người (Bostein, et al, 1980) Nguyên lý

kỹ thuật của RFLP dựa trên phân tử DNA được cắt thành các đoạn bởi enzymecắt giới hạn, sau đó phân tách các đoạn DNA theo chiều dài băng diện di Nếu sốđoạn ít thì có thể nhận biết ngay bằng điện di trên nền gel Nếu bộ gen lớn cácđoạn cắt quá nhiều và chênh nhau không nhiều về kích thước khó phát hiện thìcần phải lai DNA để xác định

Đối với thực vật chỉ thị này lần đầu tiên được áp dụng trong nghiên cứugen kiểm soát tổng hợp rRNA trong vùng cấu trúc nhân của lúa mì (Apple andDvorak, 1982) Ở lúa chỉ thị RFLP được sử dụng nhiều trong lập bản đồ QTLscho các tính trạng chất lượng và năng suất lúa (Lin et al,1994,1995), các genkháng đạo ôn (Hittalmani et al, 1995), gen kháng rầy nâu (Hirabayashi andOgawa, 1995), các gen kháng bệnh bạc lá (Yoshimura et al, 1992; 1998; Yer and

Mc Couch , 2004; He et al, 2006) và nhiều tính trạng khác như khả năng chịuhạn, mặn Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, có khả năng biểu hiện tất cả cácalen của cùng một locus gen, do vậy có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp

tử và dị hợp tử Đây là điểm ưu việt của loại chỉ thị RFLP Hạn chế của phươngpháp này là tốn thời gian, cần có mẫu dò đánh dấu và enzyme cắt giới hạn, đòihỏi trang thiết bị phòng thí nghiệm nhiều, và đặc biệt cần một lượng lớn DNA

2.2.3.2 Chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật chuỗi trùng phân (Polymerase ChainReaction - PCR)

Chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật phản ứng trùng phân, được Kary Mullisphát minh năm 1985 và đã nhanh chóng được sử dụng hầu hết các phòng thínghiệm trên toàn thế giới Phản ứng dựa trên nguyên tắc tổng hợp DNA nhờenzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu) với sự có mặt của DNA khuôn

Hai sợi mới DNA tạo thành sẽ trở thành DNA khuôn cho chu kỳ tiếp theo Saumỗi chu kỳ số lượng các sợi DNA được tăng lên gấp đôi Đến khoảng 35-50 chu

kỳ phụ thuộc vào nguồn dNTP, số bản sao của phân tử DNA phản ứng PCR sẽkhông tăng ( gọi là điểm tới hạn) và chu trình PCR kết thúc (Saiki and Gelfand,1989) Tùy theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉthị đặc trưng bao gồm STS, RADP, SSR, AFLP, SNP, cụ thể như sau:

a Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites) chỉ thị dựa trên phản ứng PCR, lầnđầu tiên được nêu ra bởi Olson năm 1989 để nghiên cứu lập bản đồ gen ở ngườingay sau khi kỹ thuật PCR ra đời ( Olson et al., 1989) Loại chỉ thị này được đưa

ra nhờ việc xác định trình tự 2 đầu mỗi đoạn của mẫu dò dùng trong RFLP pháthiện được đa hình liên kết gen, chọn một đoạn đặc hiệu để thiết kế mồi dùng chophản ứng PCR Đây là loại chỉ thị đồng trội có thể phân biệt được gen ở trạngthái đồng hợp tử và dị hợp tử Trình tự mồi STS phát hiện sự biến ddooriowrmức allen của gen trong phân tử DNA Nhược điểm của chỉ thị STS đòi hỏi phảibiết trước được một vài trình tự DNA của gen

b Chỉ thị RAPD (Radom Amplified Polymorphic DNA): Lọai chỉ thị nàydựa trên phản ứng PCR, nhân bội những đoạn ADN trong hệ gen, sử dụng đoạnmồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (radom primer) dài khoảng 9- 10 Nucleotit dưới nhiệt độ

các đoạn DNA có 2 đầu chặn biên được nhân lên bởi cùng mồi đơn nhưng ngượcchiều, được phân tách bằng điện di trên gel agarose Vì vậy không phân biệtđược thể dị hợp tử Đây là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trộiRFLP Mặc dù vậy chỉ thị này vẫn là công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ditruyền ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại.Lợi thế của chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (Williams et

al, 1990) Do chỉ thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiệnphản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được, nên người ta khắc phục bằng cách

nhân dòng những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kếnhững đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu va gọi là chỉ thịSCARs( Sequence- Characterized Amplified Region).

c AFLP (Amplified Fragment length Polymorphism) đây là loại chỉ thịđược sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tửliên kết gen Kỹ thuật tạo ra các loại chỉ thị này gọi là nhân chọn lọc những đoạncắt giới hạn (SRFA) Phương pháp này có thể phát hiện sự có mặt của nhữngđoạn cắt giới hạn bất kỳ (Vos et al,1995) Nguyên lý SRFA gồm 3 bước cơ bảnnhư sau:

- Bước 1: DNA hệ gen được cắt bằng một hoặc hai loại enzyme sinh racác mảnh cắt có một đầu là trình tự cắt hiếm và một đầu là trình tự cắt thường

- Bước 2: Nhân bội những đoạn cắt giới hạn với mồi đặc hiệu bổ sung vớitrình tự của bộ thích ứng và trình tự giới hạn của enzyme

- Bước 3: Điện di các sản phẩn của phản ứng PCR nhờ hệ thống chạy điện

di trên gel Thông thường 50-100 mảnh cắt giới hạn được nhân lên

Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so vớicác kỹ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi Lượng DNA tổng số tiêu tốn cho kỹthuật này lại rất ít Đây là phương pháp có hiệu quả cả trong nghiên cứu đa dạng

di truyền và tìm chỉ thị liên kết, lập bản đồ gen

d SSR (Simple Sequence Repeates hay Microsatellite) nghiên cứu đa hìnhnhững đoạn DNA lặp lại đơn giản, đơn vị lặp 1-6 Nu Bản chất đa hình SSRđược sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồichặn biên 2 đầu với trình tự của vùng lặp lại Chỉ thị được nghiên cứu lần đầutiên trên người (Hamada and Kakunaga, 1982) Ở thực vật tần số và số lượngSSR đã được xác định trên cây rừng nhiệt đới, cây bắp cải (Lagercrantz et al,1993), lúa mì (Roder et al, 1995) và 34 giống cây trồng khác (Morgante andOliveri, 1993) Hiện nay nghiên cứu sàng lọc thư viện genome lúa cho thấy cókhoảng 25.000 chỉ thị SSR Chỉ thị này được sử dụng nhiều trong nghiên cứu đadạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen với độ chính xác cao, đơngiản và rẻ tiền (Mc Couch et al., 2002)

e Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphisms): chỉ thị đa hìnhnucleotide đơn có thể phân biệt sự khác nhau trong phân tử DNA ở mức độ từngnucleotide: A, T hoặc G trong cấu trúc di truyền giữa các cá thể hoặc NST Chỉ

SNP ( Liu,2007) và cứ ở lúa 200- 700bp xuất hiện 1 SNP (Nasu et al.,2002).Hiện nay, ứng dụng của chỉ thị SNP đang rất phổ biến trong lĩnh vực nghiên cứu

về di truyền, lập bản đồ gen và xem xét tương quan cua các gen liên kết trên toàn

bộ genome tới các tính trạng nghiên cứu

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG BỆNHBẠC LÁ

2.3.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá trênthế giới

Đã có nhiều kết quả ứng dụng chỉ thị DNA thành công trong chọn tạo giốnglúa Việc sử dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ xác định cá thể nhân trong lai quy tụ, laibackcross (MABC) và sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc (MAS) giúp chotạo giống lúa mang một hay nhiều gen kháng với vi khuẩn gây bệnh bạc lá

Tại IRRI, sử dụng MABC trong lai quy tụ đã tạo được dòng đẳng gen mangcác gen kháng từ nền di truyền của giống IR24, đây là nguồn vật liệu quý để tiếnhành nghiên cứu và chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ở các quốc gia trên thếgiới Gần đây, các nhà nguyên cứu thuộc IRRI cũng đã tiến hành lai quy tụ nhiềugen kháng vào cùng một giống lúa, đặc biệt như IRBB64 mang 4 gen kháng Xa4,xa5, Xa7 và Xa21, dòng IRBB63 mang các gen xa5, Xa7, xa13 (Lee et al., 2006).Tại Trung Quốc, sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa khángbệnh bạc lá, đặc biệt trong chọn tạo giống lúa lai Luo et al., (2012) sử dụngphương pháp MABC trong lai quy tụ để chuyển gen kháng Xa4, Xa21, Xa27 vàdòng phục hồi Mianhui725 và 9311 Kết quả tạo được dòng phục hồi mới 9311mang gen kháng Xa27, dòng WH421, XH2431 trên nền di truyền của dòngMianhui725 mang các gen kháng Xa4 và Xa21 Huang et al., (2012) sử dụng 10chỉ thị liên kết trong lai tạo và chọn lọc đã quy tụ được 4 gen Xa7, Xa21, Xa22,Xa23 và dòng phục hồi Huahui1035 Kết quả đã đưa ra được một số dòng phụchồi mang gen kháng như HBQ809 và HBQ810 mang gen kháng Xa23 khángđược 11 chủng vi khuẩn bạc lá ở Trung Quốc Dòng phục hồi HBQ807, HBQ808mang gen kháng Xa22 kháng được 6/11 chủng

Tại Hàn Quốc, tác giả Jeong et al., (2009) đã sử dụng chỉ thị SNP và STS

để khảo sát gen kháng bạc lá trong tập đoàn vật liệu trong các giống lúa thơmphục vụ cho lai tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá Kết quả cho thấy dòng lúathơm TALLI và IRRIM46 mang gen kháng Xa4, xa5, xa13 và Xa21.dònghyangmibyeolhos, Ir841-85-1-2 và Jasmine85 mang gen Xa1, Xa4, xa5; dòng

Yekywin Yinkya Hmwe và Khao dawk Mali 105 mang các gen Xa1, Xa4 vàXa21 Kết quả là cơ sở cho việc xây dựng các tổ hợp lai trong chương trình chọntạp giống lúa thơm mang nhiều gen kháng bệnh bạc lá tại Hàn Quốc.

Tại Ấn Độ, sử dụng chỉ thị phân tử cải tạo tính kháng bệnh bạc lá và khảnăng chống đổ của giống Basmati Type 3, tác giả Rajpurohit et al., (2010) đã tiếnhành chuyển gen kháng bệnh bạc lá xa13, Xa2, gen bán lùn sd-1 và giống lúa nàythông qua backcross Kết quả chọn lọc kiểu gen bằng chỉ thị phân tử cùng với

T3-7 mang đồng hợp tử các gen xa13, Xa21 sd-1 Tác giả Bharani et al., (2010) đã

sử dụng giống lúa có năng suất cao nhưng mẫn cảm với bệnh bạc lá đang đượctrồng ở Ấn Độ là ADT43 và ADT47 lai với dòng IRBB60 mang 3 gen khángxa5, xa13 và Xa21 Bằng sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng trên,nhóm tác giả đã chon được 89 cá thể ở thế hệ F3 ở tổ hợp lai ADT43 x IRBB60.mang cả 3 gen kháng trên và thể hiện tính kháng tốt với 2 chủng vi khuẩn gâybệnh phổ biến ở Ấn độ trong điều kiện đánh giá nhân tạo và điều kiện đòngruộng Tác giả Lalitha et al (2010, 2013) đã sử dụng chỉ thị phân tử trong lai quy

tụ và chọn lọc để cải tiến khả năng kháng bệnh bạc lá của giống Mahsuri và dòng

bố mẹ lúa lai PRR78, KMR3 với các gen kháng Xa4, xa5, xa13, Xa21 Kết quảđánh giá quy tụ với 16 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến ở Ấn Độ, cácdòng mang gen đều cho khả năng kháng tốt với các chủng kháng bệnh Tác gảYadla et al (2013) sử dụng chỉ thị phân tử trong lai backcross và chọn lọc đểchuyển gen kháng bệnh bạc lá Xa21 và gen kháng đạo ôn Pi54 từ giống Mashurivào dòng duy trì IR58025B mang cả hai gen kháng Xa21 và Pita54 Các dòngnày được sử dụng vào cac tổ hợp lúa lai 3 dòng ở Ấn Độ

Tại Pakistan, Ulah et al (2012) đã sử dụng chỉ thị phân tử liên kết để kiểmtra nguồn gen kháng bệnh Xa4, xa5, Xa7 và xa13 trên 52 mẫu giống lúa Basmatibản địa và 5 mẫu giống lúa Basmati cải tiến Kết quả cho thấy hầu hết các mẫugiống bản địa và cải tiến đều chứa gen Xa7, 10 mẫu giống Basmati bản địa chứa

2 gen kháng xa5 và Xa7; Xa7 & Xa12; xa5 & xa13 Sử dụng các mẫu giống lúabản địa chứa 2 gen lặn xa5, xa13 trong phép lai Basmati 385 và Basmati 2000chứa 2 gen trội Xa4 và Xa7, bằng sử dụng phân tử liên kết với 4 gen kháng nàycùng với việc đánh giá quy tụ khả năng kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh,nhóm tác giả đã chọn ra một số dòng lúa Basmati mới mang cả 4 gen kháng trên

và kháng tốt với các chủng vi khuẩn gây bệnh tại Pakistan

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá cũngđược tiến hành tại Philipine Nhóm tác giả Suh et al (2013) đã tiến hành laichuyển gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa21 từ dòng IRBB57 sang giống lúaJaponica Mangeumbye Bằng sử dụng cỉ thị phân tử chọn lọc từ các cá thể phân

ly tại thế hệ BC3F5, nhóm tác giả đã chọn được 3 dòng lúa mang cả 3 gen Xa4,xa5, Xa21 với khả năng kháng cao với 18 chủng vi khuẩn Năng suất và chấtlượng, đặc điểm nông học khác của các dòng kháng mới này tương tự như dang

mẹ Mangeumbye

Tại Thái Lan, công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá cũng đượcquan tâm nhiều đặc biệt là sử dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ trong lai quy tụ và chọnlọc Nhóm nghiên cứu của Pinta sử dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ trong lai quy tụ vàchọn lọc thành công các dòng lúa mang đồng thời hai gen kháng đạo ôn (Pita) vàgen kháng bạc lá (xa5) (Pita et al., 2013) Các phép lai kép được tiến hành từdòng đẳng gen RD6 mag gen kháng đạo ôn với các dòng lúa của Thái Lan nhưP0489 và Jao Hom Nin, sau đó được lai với dòng mang gen kháng bệnh bạc láIR62266 mang gen kháng xa5 Hỗ trợ chỉ thị phân tử trong lai quy tụ và trong

gen kháng đạo ôn và kháng bạc lá xa5 Những dòng này được sử dụng làm vậtliệu cho chương trình tạo giống lúa kháng bệnh ở Thái Lan

2.3.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ởViệt Nam

Nhìn chung các ống lúa hiện nay đang trồng đều có thể bị nhiễm bệnh bạc

lá nhưng ở mức độ khác nhau và tác hại cũng khác nhau Thông thường cácgiống lúa địa phương cũ như: Di Hương, Tám thơm nhiễm nhẹ, còn các giốngnhập nội đều bị nhiễm nặng như: HT1, Q5, Bắc Thơm 7, NN8, CR203, CR101 Một số giống lúa lai như: Nhị ưu 838, Tạp giao, Thục Hưng, bị nhiễm bệnhbạc lá rất nặng

Phương pháp chọn giống kháng bệnh bạc lá phổ biến và quan trọng nhấtcho đến nay là phương pháp lai hữu tính Phương pháp này tiến hành lai giữa cácgiống có chứa gen kháng, sau đó chọn lọc các thế hệ phân ly Bằng phương phápnày nhiều giống kháng bệnh đã được tạo ra Khả năng kháng bạc lá thường dođơn gen quy định, vì vậy việc sử dụng phương pháp lai lại để chuyển gen kháng

là rất hiệu quả Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng một giống lúa tốtnhưng không mang gen kháng cần thiết để lai lại với một giống mang gen kháng

hữu hiệu Sau một số lần chọn lọc và lai lại liên tục, giống mới được tạo thànhgần như mang toàn bộ nguồn gen tốt của cây lai lại và mang thêm được genkháng mong muốn Trong quá trình lai lại, có thể kết hợp với tự phối, chọn lọccác dạng phân ly để đẩy nhanh quá trình tạo dòng thuần.

Tại Việt Nam, nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạogiống lúa cũng đã được tiến hành trong những năm gần đây Viện Nghiên cứu vàphát triển cây trồng thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam (VNUA) đã sử dụngchỉ thị phân tử để cải tiến giống lúa thơm BT7 kháng bệnh bạc lá với gen Xa21,nhưng kết quả chưa được đánh giá cao Tại trung Tâm Bảo tồn và Phát triểnNguồn gen Cây trồng, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã chọn tạo thành cônggiống lúa NV1 và N91 chứa gen kháng bệnh bạc lá Xa7 bằng việc sử dụngphương pháp lai truyền thống kết hợp với chỉ thị phân tử chọn lọc trong quần thểF2 Hai giống này đã được Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nôngthôn công nhận giống Quốc gia Giống lúa T65 và T23 chứa gen Xa4, giốngNV3 chứa gen Xa7 cũng chọn tạo bằng việc kết hợp giữa phương pháp truyềnthống và chỉ thị phân tử, ba giống này đã được công nhận cho sản xuất thử Tạicác tỉnh phía nam, Nguyen et al (2005) đã sử dụng chỉ thị RM144 liên kết vớiXa4, chỉ thị RM122 liên kết với xa5 và chỉ thị RG136 liên kết với gen xa13 đểchọn các dong lúa mang gen kháng bệnh bạc lá như OM2517, OM5636,OMCS2000, DS2002

Bệnh lá lúa được phát hiện lần đầu tiên ở Việt Nam sau năm 1954 trên cácgiống lúa địa phương cao cây, nhưng vẫn ở mức độ gây hại không nghiêm trọng Khi phong trào thâm canh phát triển, đặc biệt là việc gieo trồng các giống lúamới chọn tạo có năng suất cao, chịu phân tốt, kết hợp với sử dụng nhiều phânbón hóa học là nguyên nhân chính gây nên bệnh bạc lá phát triển và lan tràntrong cả vụ xuân và vụ mùa miền Bắc Việt Nam

Trong ba năm 2001- 2003 nhóm nghiên cứu bệnh bạc lá ở Học viện Nôngngiệp Việt Nam đã phân lập và bảo quản được 154 isolate vi khuẩn Xoo thu thập

ở 11 tỉnh miền Bắc Việt Nam trên 27 giống lúa, đã xác định một số gen hữu hiệuliên kết với chủng bạc lá ở các tỉnh miền Bắc là gen Xa4, Xa5, Xa7, Xa21 NarutoFuniya et al (2002) đã xác định được miền Bắc Việt Nam tồn tại ít nhất 10 chủng

vi khuẩn Xoo

Năm 2005, Phan Hữu Tôn và cs đã ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện 4gen kháng bệnh bạc lá từ 500 mẫu giống địa phương Việt Nam và thu được: 56mẫu giống chứa gen Xa4, 36 mẫu giống chứa gen xa5, 16 mẫu giống chứa gen

Phan Hữu Tôn và cs (2001) đã dùng PCR để chọn lọc gen kháng và kếthợp với nuôi cấy bao phấn, kết quả đã chọn ra được một số giống kháng bệnh tốtnhư: SS-2; 10091; 10119 đồng thời nhóm tác giả từ năm 2001- 2002 đã thuthập được 385 mẫu lá bệnh từ 28 giống lúa trồng ở 11 tỉnh thành thuộc hệ thốngsông Hồng, sông Lô, sông Gấm Bằng phương pháp nuôi cấy đơn tế bào kết hợpvới kỹ thuật PCR đã phân lập 10 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

từ 154 isolate và xác định được chúng thuộc 10 chủng vi khuẩn gây bệnh khácnhau đánh số từ 1-10 Trong đó chủng 2 gồm 3 chủng phụ là 2A, 2A’và 2B ,chủng 3 bao gồm 3 chủng phụ 3A, 3A’và 3B, chủng 5 gồm 5A, 5B , chủng 7gồm chủng 7A, 7A’ (Phan Hữu Tôn và cs., 2005)

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- 136 mẫu giống lúa địa phương thu thập được lưu trữ tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Bảng 3.1 Danh sách các giống lúa địa phương sử dụng trong nghiên cứu

- 10 chủng bạc lá đã phân lập, được bảo quản tại phòng thí nghiệm Bộmôn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinhhọc, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

Bảng 3.2 Danh sách 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá

- Các giống lúa BT7, KD18, IR24, IRBB4, IRBB5, IRBB7 sử dụng làm giống đối chứng

- Các chỉ thị phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5 và Xa7 thông tin được tổng hợp ở bảng 3.3

Xa4 Npb181 11

F: ATCGATCGATCTTCACGAGGR: GTGCTATAA AAGGCATTCGGGF: GAG

CGATGTAATGTCATCAGTGC

Yoshimura

et al , 1992Blair andxa5 RM122 5

Xa7 P3 6

R:GGAAGGAGG TATCCG CTTTGTTGGAC

F: CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT R:

Mc Couch,1997Taura et al.,2004

- Các thiết bị máy móc cần thiết khác.

3.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Địa điểm: Tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng vàKhu thí nghiệm Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng, Học việnNông nghiệp Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu : Từ tháng 1/2016 đến tháng 7/2016

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen kháng bạc lá hữu hiệu Xa4, xa5, Xa7

Nội dung 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo với 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá

Nội dung 3: Phân loại giống (Phân loại loài phụ, phân loại nếp, tẻ), đánh giá đặc điểm nông sinh học, các yếu tố cấu thành năng suất và chất lượng gạo.3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện các gen kháng bệnh bạc lá3.4.1.1 Quy trình tách chiết DNA

- Thành phần đệm chiết DNA được tổng hợp ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Thành phần của dung dịch chiết tách DNA

- Thành phần đệm TE pha loãng và bảo quản DNA được tổng hợp tại bảng 3.5

Bảng 3.5 Thành phần dung dịch TE để bảo quản DNA

Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ

dịch làm việc V = 50mlTris- HCl 1M 10 mM 0,5mlEDTA 0,5M 1 mM 0,1ml

H2O 49,4ml

- Quy trình tách chiết DNA: theo phương pháp của Zheng và cs (2003) có cải tiến.

+ Thu lá non, thường lấy lá vào sáng sớm, cho vào ống nghiệm và ghi tên.+ Cắt 0,5g lá thành các mẩu nhỏ bằng kéo vô trùng vào trong cối sứ đãđược khử trùng đặt trên đá lạnh

+ Cho vào cối 400µl dung đệm chiết tách DNA và nghiền nát cho đến khidung dịch chuyển thành màu xanh, đây là quá trình phá vỡ tế bào lúa

+ Thêm 400µl đệm chiết vào cối rồi chuyển vào ống eppendoff đã đượcđánh dấu ghi tên sẵn từng giống

+ Thêm 700µl dung dịch Chloroform: phenol: isoalcolhol (25:24:1) ly tâm

+ Chuyển phần dung dịch phía trên vào ống eppendoff mới , thêm 600µl

+ Loại bỏ phần dung dịch phía trên, lấy DNA kết tủa phía dưới Rửa bằngethanol 70% để làm khô tự nhiên bằng cách ống nghiệm lên giấy thấm

3.4.1.2 Phản ứng PCR

+ Thành phần phản ứng PCR 20 μl gồm: 10 μl PCR master mix (2X), 1 μlPrimer Forward, 1 μl Primer Revese, mẫu và 7,0 μl nuclease-Free water, 1,0 μlDNA;

+ Chu kỳ nhiệt nhân phản ứng PCR:

- PCR của gen Xa4 và Xa 7 được thực hiện theo chu kì nhiệt như sau: 94ºCtrong 4 phút, 34 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 56ºC trong 1 phút, 72º trong 2 phút,

và 72 º C trong 7 phút

- PCR của gen xa5 được thực hiện theo chu kì nhiệt: 94ºC trong 4 phút, 34chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, 72º trong 1 phút 50 giây, và 72 º Ctrong 7 phút

+ Sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 2% Bản gel được nhuộm bằngethidium bromide và chụp ảnh dưới tia UV