Nghiên cứu một vài yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu vỏ quýt và thí nghiệm tác dụng kháng khuẩn trên vi khuẩn gây bệnh e coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT VÀI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT TINH DẦU VỎ QUÝT VÀ THÍ NGHIỆM TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH E.COLI Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Nguyễn Thị Thu Hương Sinh viên thực Nguyễn Thị Tuyết mai MSSV: 1215100009 : Lớp: 12HSH01 TP Hồ Chí Minh, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM NGHIÊN CỨU MỘT VÀI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT TINH DẦU VỎ QT VÀ THÍ NGHIỆM TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH E.COLI Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực MSSV: 1215100009 : Nguyễn Thị Tuyết Mai Lớp : 12HSH01 TP Hồ Chí Minh, 2014 BM05/QT04/ĐT Khoa: Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên giao đề tài (sĩ số nhóm 1) Nguyễn Thị Tuyết Mai MSSV: 1215100009 Lớp: 12HSH01 Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tên đề tài : NGHIÊN CỨU MỘT VÀI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT TINH DẦU VỎ QUÝT VÀ THÍ NGHIỆM TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH E.COLI Các liệu ban đầu : Các yêu cầu chủ yếu : Xác định thời gian làm héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trích ly Xác định thời gian trích đến hàm lượng tinh dầu trích ly Xác định ảnh hưởng dung môi đến hiệu suất trích ly tinh dầu Xác định ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu / dung môi P.E Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ quýt vi khuẩn E.coli phương pháp đục lỗ thạch Kết tối thiểu phải có: 1) Xác định thời gian làm héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trích ly 2) Xác định thời gian trích đến hàm lượng tinh dầu trích ly 3) Xác định ảnh hưởng dung mơi đến hiệu suất trích ly tinh dầu 4) Xác định ảnh hưởng tỉ lệ tối nguyên liệu / dung mơi P.E 5) Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ quýt vi khuẩn E.coli phương pháp đục lỗ thạch Ngày giao đề tài: ……./…… /……… Ngày nộp báo cáo: ……./…… /……… Chủ nhiệm ngành (Ký ghi rõ họ tên) TP HCM, ngày … tháng … năm ……… Giảng viên hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) Giảng viên hướng dẫn phụ (Ký ghi rõ họ tên) LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, thực sở nghiên cứu lý thuyết thực nghiệm trình bày đồ án tốt nghiệp hướng dẫn chỉnh sửa giảng viên hướng dẫn Em xin cam đoan không chép đồ án hình thức Nếu phát có gian lận em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm TP.HCM, ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thị Tuyết Mai LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: • Ban giám hiệu Trường Đại học Cơng Nghệ TP HCM, Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường tất Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trường • Giảng viên hướng dẫn tận tình dạy, hướng dẫn sửa chữa sai sót cho em suốt q trình thực đồ án tốt nghiệp • Tập thể lớp 12HSH01 gắng bó, giúp đỡ tơi suốt 1,5 năm học vừa qua • Cuối cùng, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, yêu thương động viên lúc khó khăn đặc biệt tin tưởng yêu thương TP HCM, ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thị Tuyết Mai MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG .vi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Kỹ thuật canh tác thu hái quýt 1.2 Tình hình trồng phát triển quýt nước ta giới 12 1.2.1 Tình hình trồng phát triển quýt nước ta 12 1.2.2 Tình hình trồng phát triển quýt giới 13 i 1.3 Tìm hiểu chung tinh dầu 13 1.3.1 Những nét đặc trưng tinh dầu 13 1.3.2 Tính chất lý hóa tinh dầu 15 1.4 Một số phương pháp tách chiết tinh dầu 16 i 1.4.1.Phương pháp chưng cất lôi nước 16 1.4.2 Phương pháp ly trích chiếu xạ vi sóng 19 1.5 Đánh giá chất lượng tinh dầu phương pháp hóa lý 22 1.5.1 Xác định tiêu cảm quan 22 1.5.2 Xác định vị 22 1.5.3 Xác định mùi 22 1.5.4 Xác định tiêu hóa - lý 22 1.6 Tổng quan phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro 27 1.6.1 Mục đích 27 1.6.2 Những yếu tố ảnh hưởng 27 1.6.3 Một số phương pháp thử in vitro 28 1.7 Ứng dụng tinh dầu vỏ quýt 29 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.1 Vật liệu nghiên cứu 31 2.2 Hóa chất dụng cụ 31 2.2.1 Hóa chất 31 2.2.2 Dụng cụ 31 2.3 Địa điểm thực thí nghiệm 33 2.4 Nội dung nghiên cứu 33 2.4.1 Thí nghiệm xác định thời gian làm héo nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trích ly 33 ii 2.4.2 Thí nghiệm xác định thời gian trích ly đến hàm lượng tinh dầu trích ly 33 2.4.3 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng dung môi đến hiệu suất trích ly tinh dầu 34 2.4.4 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu / dung môi P.E đến hàm lượng trích ly tinh dầu 34 2.4.5 Thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ quýt phương pháp đục lỗ thạch 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Tinh dầu vỏ quýt 36 3.2 Kết xác định thời gian làm héo nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trích ly 36 3.3 Kết xác định thời gian trích ly đến hàm lượng tinh dầu trích ly 37 3.4 Kết xác định ảnh hưởng dung mơi đến hiệu suất trích ly tinh dầu 38 3.5 Kết ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu / dung môi đến hàm lượng trích ly tinh dầu 39 3.6 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ quýt phương pháp đục lỗ thạch 40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 iii Mẫ u th Tinh dầu sau chưng cất bảo quản lạnh 40C Du ng d ịch kháng sinh đố i ch ứn g viên kháng sinh Amoxcillin với hàm lượng 500 mg pha 125 ml dung dịch đệm phosphate pH = Dịch kháng sinh sau pha tiến hành lọc qua màng lọc vơ trùng Sau hút 0,025ml kháng sinh qua vô trùng tẩm lên miếng giấy lọc hình tròn hấp khử trùng có đường kính 0,8 cm Như miếng giấy lọc có hàm lượng kháng sinh tương ứng 10 μg theo tiêu chuẩn quốc tế 2.4.5.2 Tiến hành - Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn loại nồng độ Sau tiến hành cấy trang mơi trường khô bề mặt thạch - Sử dụng ống đục lỗ đục lỗ, lỗ cách đặn khoảng 2cm - Dùng micropipet chuyển 0.1 ml mẫu tinh dầu vào lỗ thạch - Cuối ta đặt miếng giấy lọc tẩm kháng sinh vào đĩa petri Lưu ý: - Mỗi nồng độ vi khuẩn ta tiến hành lặp lại lần - Các đĩa tiến hành xong đem ủ 37oC - Theo dõi xuất kích thước vòng kháng khuẩn thời gian 12h, 24 h, 36 h Hình 2.7 Phương pháp đục lỗ thạch môi trường đặc CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tinh dầu vỏ quýt Tinh dầu vỏ quýt sau tiền hành chưng cất thu tinh dầu chất lỏng suốt khơng màu (hình3.1) Tinh dầu vỏ qt có mùi thơm đặc trưng dịu, nhẹ nhàng dễ chịu có vị the Hình 3.1 Tinh dầu vỏ quýt 3.2 Kết xác định thời gian làm héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trích ly Qua q trình chưng cất vỏ quýt làm héo nhiệt độ 50 oC khoảng thời gian h, h, h, h Kết bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết khảo sát thời gian làm héo nguyên liệu T h i h h h h K , ế t m l , m l , m l , m l 3.5 2.5 1.5 0.5 1h 2h 3h 4h Hình 3.2 Biểu đồ xác định thời gian làm héo nguyên liệu Biệnluận: Ở thời gian h vỏ quýt làm héo nhiệt độ 50 oC tối ưu Ta thu lượng tinh dầu cao thí nghiệm với 3,5 ml tinh dầu Kết cho ta thấy thời gian làm héo ngắn hay lâu ảnh hưởng đến lượng tinh dầu thu Nếu q ngắn hàm lượng nước nhiều lâu làm thất thoát bớt tinh dầu 3.3 Kết xác định thời gian trích ly đến hàm lượng tinh dầu Tiến hành khảo sát tinh dầu thu khoảng thời gian tương ứng 1h, 1,5 h, h chưng cất ta cho 300 ml nước cất vào Bảng 3.2 Kết khảo sát thời gian trích ly tinh dầu T h i p K , ế t m l q , m l , m l , m l 3.5 2.5 1.5 0.5 0.5h 1h 1.5h 2h Hình 3.3 Biểu đồ xác định thời gian trích ly Biện luận: Thời gian trích ly tinh dầu h cho số ml tinh dầu chưng cất nhiều Nếu thời gian ngắn 0,5 1h ta thu chưa hết tinh dầu Ta trích ly khoảng thời gian h ta thu hết tinh dầu 100 g vỏ 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng dung mơi đến hiệu suất trích ly tinh dầu Dung mơi có ảnh hưởng đến chưng cất tinh dầu Để thu nhiều tinh dầu ta cần lựa chọn loại dung môi hợp lý Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi D P N A u e K t Biện luận: Dựa vào kết tinh dầu ta thấy dung môi P.E (Ete dầu hỏa) cho hàm lượng tinh dầu nhiều so với n – hexan acetone Điều cho thấy dung mơi thích hợp để chưng cất loại tinh dầu P.E Dung mơi có dộ phân cực thấp nên hồn tồn có khả lơi kéo tinh dầu khỏi tế bào bới tinh dầu hợp chất có tính thân dầu có độ phân cực thấp N-hexan acetone mơi có độ phân cực thấp trung bình nên chưa có khả ly trích lượng tinh dầu lớn 3.5 Kết xác định tỉ lệ ảnh hưởng nguyên liệu/dung môi P.E Sau lựa chọn dung môi thích hợp P.E ta tiến hành thử nghiệm tỉ lệ ngun liệu dung mơi nhằm tìm thể tích dung mơi hợp lý để ly trích khối lượng nguyên liệu cụ thể Bảng 3.4 Kết tỉ lệ ảnh hưởng nguyên liệu/dung môi P.E T ỷ l K ế ml t Biện luận: Vậy với tỉ lệ : ta thấy tỉ lệ ta thu tinh dầu nhiều tỉ lệ khác Nếu với tỉ lệ : thỉ hàm lượng dung mơi q ta không thu tinh dầu nhiều với tỉ lệ : hàm lượng tinh dầu tương đương với tỉ lệ 1: tốn dung môi mà không thu tinh dầu nhiều 3.6 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ quýt phương pháp đục lỗ thạch Tiến hành khảo sát vòng kháng khuẩn 24 h đến 36 h ta thấy có xuất vòng vơ khuẩn kích thước vòng vơ khuẩn E.coli Bảng 3.5 Kích thước vòng kháng khuẩn 36h E K 10 í 10 10 c h C C C h ư cm Biện luận: Sau ngày theo dõi ta thấy vòng vơ khuẩn xuất tốt 24 h với nồng độ vi khuẩn 108 0,8 cm, 107 2,1 cm 106 2,2 cm Từ 24 h đến 36 h thời gian kéo dài vòng vơ khuần nhỏ lượng tinh dầu bay vi khuẩn mạnh sống có khả phát triển lại lượng tinh dầu ta khơng nhiều để kháng mạnh Vậy ta thấy có xuất vòng vơ khuẩn tức tinh dầu vỏ quýt có khả kháng vi khuẩn E.coli CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau tiến hành thí nghiệm nhóm chúng tơi rút số kết luận : Ch ưn g cấ t lô i cu ốn h i n ướ c: Thời gian làm héo nguyên liệu vòng 2h cho hàm lượng tinh dầu tối ưu Trích ly thời gian 2h cho hàm lượng tinh dầu nhiều Ch ưn g cấ t vớ i du ng mô i du ng mô i: Dung môi thu tinh dầu tối ưu P.E Tỉ lệ nguyên liệu /dung môi thích hợp : V ò ng ng khu ẩn : Tinh dầu có tính kháng khuẩn kháng E.coli đường kính vòng kháng khuẩn xuất rõ mạnh vòng 24 h đến 36 h 4.2 Kiến nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm ngắn, thiết bị hóa chất sử dụng phòng thí nghiệm có hạn nên chúng tơi xin đưa số kiến nghị Còn nhiều loại dung môi chưa khảo sát nhằm nghiên cứu hiệu suất trích ly tinh dầu Cần tiến hành trích ly phương pháp nhiều phương pháp khác kết hợp vi sóng dung mơi để khảo sát hàm lượng tinh dầu Cần thử nghiệm mơ hình thực nghiệm để đánh giá tác dụng dược lý tinh dầu vỏ quýt TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn Cục Bảo Vệ Thực Vật 2006 Quản lí dịch hại tổng hợp có múi hướng dẫn sinh thái Thành Phố Hồ Chí Minh: NXB Nơng Nghiệp [2] Dương Phước An, Huỳnh Thị Bích Tuyền, Nguyễn Ngọc Khơi, Khảo sát hoạt tính giải lo âu số tinh dầu từ vỏ chi Citrus họ Rutacece Y Hoc TP Hồ Chí Minh [3] Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y dược [4] Đỗ Chung Võ cộng sự, Những tinh dầu Việt Nam, khai thác, chế biến, ứng dụng, NXB KHKT HN, 1996 [5] Đường Hồng Dật 2003 Nghề làm vườn ăn ba miền.Hà Nội: NXB Nông Nghiệp Hà Nội [6] Lê Ngọc Thạch (2003), Tinh dầu, NXB ĐHQG TP Hồ Chí Minh [7] Nguyễn Kim Phi Phụng Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, 2007 [8] Nguyễn Minh Hồng (2006), Khảo sát tinh dầu vỏ trái giống Citrus họ rutaceae Đề tài nghiên cứu khoa học cấp sở, Đại học Mở Tp HCM [9] Nguyễn Năng Vinh, Kỹ thuật khai thác sơ chế tinh dầu, Nhà xuất Nông Nghiệp, năm 1978 [10] Nguyễn Thị Thu Cúc 2000 Biện pháp phòng trị rùng nhện gây hại ăn trái (Cam, Quýt, Chanh, Bưởi).Cần Thơ: Nhà sách Thành Nghĩa [11] Vũ Ngọc Lộ (1996), Những tinh dầu Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật Tài liệu tiếng anh [12] Cordell G.A, Biodiversity and drug discovery symbiotic relationship, Phytochemistry 55, 2005 [13] George A Burdock, Fenaroli's handbook of flavor ingredients edition, CRC Press, 2004 [14] Glen O brenchbill, An essential Oil guide, Fragrance Books INC, New Jersey, USA, 2009 Tài liệu internet [15] http://duoclieu.net/Dlieuhoc/chuongontap.html [16] http://tinhdau.vn [17] http://http://thuvienluanvan.com [18] http://whq.libdoc.who.int/publiccations/1998/9241530057/limonene [19] http://www.khoahoc.com.vn/doisong/moi-truong/26214/biến vỏ cam thành nhiên liệu chất kháng khuẩn [20] http://Baovecaytrong.com PHỤC LỤC Môi trường thạch thường TSA (cao thịt pepton bản) Pepton : 10g NaCl : 5g Cao thịt : 5g Thạch : 20g (2% Agar) Nếu đổ đĩa : Sau hấp, để nguội 45 - 500C đổ 20ml/đĩa Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,7 – 6,8) Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hòa tan định mức đến 1000 ml Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O 71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan định mức đến 1000 ml Dung dịch đệm phosphate có pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b) định mức đến 200ml 93 92 90 10 87 12 85 15 81 18 77 22 73 26 68 31 62 37 56 53 51 49 Độ đục chuẩn (McFarlan) Độ đục chuẩn 0,5 Mcfarland sẵn có thị trường Hoặc tự chuẩn bị cách trộn: Dung dịch BaCl2.2H2O 1%: 0,5 ml Dung dịch H2SO4 1%: 99,5 ml Môi trường tăng sinh E.coli Môi trường TSB ( Trypticase Soy Broth) Trypticase peptone : 17 g Phytone peptone : g NaCl : g K2HPO4 : 2,5 g Glucose : 2,5 g Nước cất đến : lít Làm nóng lắc nhẹ để hòa tan, hấp khử trùng 1210C, atm, 15 phút ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM NGHIÊN CỨU MỘT VÀI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT TINH DẦU VỎ QUÝT VÀ THÍ NGHIỆM TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH E. COLI Ngành... đề tài : NGHIÊN CỨU MỘT VÀI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT TINH DẦU VỎ QUÝT VÀ THÍ NGHIỆM TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH E. COLI Các liệu ban đầu : ... dụng, sử dụng múi, chưa chế biến tận dụng tinh dầu từ vỏ Xuất phát từ thực tế nói nhóm chúng tơi tiến hành tìm hiểu nghiên cứu vài yếu tố ảnh hưởng đến trình chưng cất tinh dẩu vỏ quýt thử nghiệm