kĩ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) là kỹ thuật đưa 1 gen lạ (1 đoạn phan tử ADN hoặc RNA) vào tế bào chủ, làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của cơ thể chuyển gen. Mục đích tạo ra giống sinh vật mới. Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) là kỹ thuật đưa 1 gen lạ (1 đoạn phan tử ADN hoặc RNA) vào tế bào chủ, làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của cơ thể chuyển gen. Mục đích tạo ra giống sinh vật mới. Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) là kỹ thuật đưa 1 gen lạ (1 đoạn phan tử ADN hoặc RNA) vào tế bào chủ, làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của cơ thể chuyển gen. Mục đích tạo ra giống sinh vật mới.

KĨ THUẬT CHUYỂN GEN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM KHOA SINH HỌC Môn: KĨ THUẬT DI TRUYỀN GIẢNG VIÊN: CƠ NGUYỄN THỊ HẰNG NHĨM Lê Thị Trinh Huỳnh Thị Anh Thơ Dương Thị Đào Nguyễn Ngọc Như Nguyễn Thị Hương Lài Mục lục A KHÁI NIỆM VỀ KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ GEN CHUYỂN Khái niệm kỹ thuật chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) kỹ thuật đưa gen lạ (1 đoạn phan tử ADN RNA) vào tế bào chủ, làm cho gen lạ tồn plasmid tế bào chủ gắn vào gen tế bào chủ, tồn tái với gen tế bào chủ Gen lạ tế bào chủ hoạt động tổng hợp protein đặc hiệu, gây biến đổi đặc điểm có làm xuất đặc điểm thể chuyển gen Mục đích tạo giống sinh vật - Kĩ thuật chuyển gen gồm bước sau: Tạo ADN tái tổ hợp 2 Đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận Kiểm tra sát nhập gen biểu gen Quy trình kĩ thuật chuyển gen giống với tạo dòng có mục đích khác Kĩ thuật chuyển gen nhằm tạo giống sinh vật Nguyên lý: đoạn gen mong muốn khai thác, sau chúng tháo tác yếu tố cần thiết để chuyển vào hệ gen nhân tế bào nhận Gen chuyển có khả biểu di truyền ổn định hệ sau, nguyên lý công nghệ Gen chuyển Gen chuyển gen mã hóa tính trạng mong muốn tách chiết từ sinh vật khác động vật, thực vật, vi sinh vật chúng mã hóa tính trạng số lượng, chất lượng (như sản lượng sữa, thịt), hay mã hóa số thành phần bổ sung Cấu trúc gen chuyển bao gồm trình tự chính: Trình tự mã hóa cho phân tử protein (transgen – gen chuyển) trình tự điều hòa (promoter enchancer) Để biểu protein mô chuyên biệt, cấu trúc gen phải chứa trình tự điều hòa thích hợp, có khả phiên mã trực tiếp mơ Vùng điều hòa có chiều dài khoảng 100bp, kết hợp với nhân tố cis trans để tham gia trình phiên mã (khởi động hay kết thúc trình phiên mã Enhancer: đoạn ADN ngắn, gắn với protein (còn gọi nhân tố hoạt động trans), làm tăng mức độ phiên mã gen mục tiêu nhóm gen, khơng phụ thuộc vào vị trí định hướng gen *Ngồi nhiều cấu trúc khác cần gắn vào gen chuyển - Các marker chọn lọc: gen chuyển vào tế bào, chúng nuôi cấy để sau sàng lọc, chọn tế bào biến nạp tải nạp thành công Gồm loại: + Các marker chọn lọc dương (sản phẩm gen chọn lọc) sử dụng hiệu hầu hết gen chuyển, nhằm chọn lọc tế bào nhận cấu trúc gen chuyển (ở dạng tự hay sát nhập vào gen tế bào chủ) + Các marker chọn lọc âm thường đươc sử dụng: HSV-tk, dt hprt để chọn lọc tế bào không tồn gen chuyển hay gen bên - Gen báo cáo (reporter gen) gen mã hóa cho protein dễ phát giúp báo cáo vai trò hoạt động gen, chèn vào “bên sườn” gen chuyển Dựa vào biểu gen báo cáo giúp đánh giá điều hòa gen chuyển tế bào hay mơ - Polylinker: Ở cuối cấu trúc gen biến đổi để hình thành polylinker chứa số vị trí nhận diện enzyme cắt giới hạn Polylinker cho phép cấu trúc gen chèn vào vector, nhằm mục đích nhân dòng kiểm tra ADN gen chuyển tạo cách sử dụng enzyme cắt giới hạn ligase, gen từ loại khác kết hợp lại ống nghiệm để tạo thành cấu trúc gen chuyển Cấu trúc gen chuyển ATG: Vị trí bắt đầu phiên mã SIG: Trình tự dấu hiệu AAA: poly A Các nguyên lý sinh học - Tạo điều kiện sinh lý sinh hóa, hoăc cưỡng để hệ tế bào chủ chấp nhận yếu tố lạ - (gen chuyển), tránh thải loại Gen chuyển phải vào tế bào nhận phải diễn dung hợp gen tế bào - vào gen chuyển Gen chuyển phải biểu tế bào chủ Số lượng cá thể nhận gen chuyển phải khuếch đại (di truyền cho hệ cái) để - di truyền hiệu gen chuyển Tổ hợp gen cần chuyển phải chèn xác vào vị trí cần thiết đồng thời khống chế tác động tiêu cực mô chủ B CÁC BƯỚC TRONG CHUYỂN GEN I Tạo ADN tái tổ hợp Khái niệm chung - ADN tái tổ hợp (recombinant ADN) dùng để phân tử ADN tạo từ hai hay nhiều phân đoạn ADN xuất xứ từ nguồn gốc khác * Những yêu cầu ADN tái tổ hợp - ADN tái tổ hợp phải đạt yêu cầu cần thiết vector chuyển gen - ADN tái tổ hợp phải có hoạt tính đưa vào tế bào chủ - ADN tái tổ hợp phải có dấu hiệu dễ phát quần thể vi khuẩn Và dễ quan sát hoạt động biểu gen tái tổ hợp ADN tái tổ hợp thực nào? Các bước thực ADN tái tổ hợp 2.1 Chọn nguyên liệu - ADN chọn làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường ADN plasmid ADN phage Chúng thu nhận chủ yếu từ tế bào vi sinh vật, tách làm theo phương pháp chiết tách ADN plasmid, ADN virus - ADN chứa gen cần nghiên cứu (ADN lạ) thu nhận từ tế bào sinh vật chiết tách làm kiểm tra theo phương pháp chiết tách ADN 2.2 Gia công đoạn ADN cần chuyển với tham gia enzyme RE kiểu II RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: enzyme cắt vị trí xác định chúng có số ưu điểm: Hầu có kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc cải biên Mỗi enzyme cắt vị trí phù hợp định trước bên hay cạnh trình tự nhận biết Chúng cần ion Mg +2 không cần lượng ATP - Các enzyme gặp chuỗi đích phân tử ADN cắt ADN thành hai mảnh dạng đầu hay đầu dính Hiệu cắt enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác hàm lượng enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH độ tinh khiết ADN 2.3 Nối ADN vào vector với có mặt enzyme ADN ligase Bước kĩ thuật di truyền nối đoạn ADN vào vector chuyển gen để tạo vector tái tổ hợp có mang ADN lạ Phản ứng nối thực nhờ enzyme ADN ligase ADN ligase enzyme xúc tác phản ứng nối hai mảnh ADN cách tạo cầu nối phosphodiester đầu 5’(P) đầu 3’(OH) hai nucleotide đứng cạnh (Hình 6-2) Trong sinh học phân tử, người ta coi ADN ligase chất keo phân tử để kết dính mẫu ADN lại với 2.3.1 Nối đầu Nối đầu xảy hai đoạn ADN đầu đứng cạnh Dưới tác dụng enzyme ligase, liên kết phosphodiester đầu 5’(P) đầu 3’(OH) hình thành hai nucleotide nối lại với 2.3.2 Nối đầu lệch Đầu tiên, hai mảnh ADN đầu lệch có bazơ bổ sung nên chúng tiến gần lại để tạo liên kết hydro bazơ nitơ bổ sung Sau đó, hai nucleotide hai đầu nối tạo liên kết este OH (3’) P (5’) tác dụng enzyme ADN ligase => Nhờ sử dụng enzyme cắt giới hạn ligase, gen từ lồi khác kết hợp lại ống nghiệm để tạo thành cấu trúc gen chuyển II Đưa ADN vào tế bào nhân Kỹ thuật Calcium phosphate (calcium phosphate technique) Nguyên tắc: khả ẩm bào phức hợp ADN – calcium phosphate Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) phát triển để xác định lây nhiễm ADN virus (Graham,1973) Hiện sử dụng rông rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp ADN virus ADN tách chiết từ tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980) Kỹ thuật yêu cầu ủ tế bào nhận với chất đồng kết tủa ADN calcium phosphate Kết tủa bám vào tế bào sau hấp thụ vào tế bào qua trình ẩm bào (Loyter, 1982) Trong tế bào, phân tử ADN ngoại lai nằm không bào tạo thành ẩm bào lysosome ADN đến nhân hợp vào genome chủ Hình: Phức hợp ADN-calcium phosphate Kỹ thuật vơ có giá trị nghiên cứu chuyển gen vào tế bào soma nuôi cấy sử dụng nhiều để chuyển dòng genome vào tế bào đích Bên cạnh đó, biến nạp ADN tách chiết từ tế bào ung thư vào tế bào nhận không ung thư cho thấy phương pháp để nghiên cứu kiểm soát di truyền ung thư Ưu điểm: đơn giản, protocol dễ thực hiện, tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, biểu gen thời ổn định quan trọng việc thiết kế vector virus tái tổ hợp Nhược điểm: hiệu biến nạp mức độ biểu gen chuyển thấp Chuyển gen qua liposome Nguyên tắc: dung hợp màng tế bào phía ngồi với phức hợp liposome-ADN Hình 2.1: Cấu trúc tổng quát Lipid cation Hình 2.2: Cấu trúc tổng quát DOPE (L-diolecyl phosphatidyllethanolamine) 10 D BÀI BÁO CHUYỂN GEN TÍCH LŨY SẮT TRONG CÂY ĐẬU TƯƠNG SANG CÂY DỨA NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM Chuyển gen ferritin vào Agrobacterium Nguyên tắc: dựa khả xâm nhiễm tế bào thực vật cách chuyển đoạn ADN Agrobacterium (1 chi vi khuẩn Gram âm H.J Conn thiết lập, sử dụng để chuyển gene ngang gây khối u thực vật) vào tế bào thực vật Hình 9.1: Tạo thực vật chuyển gen phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens) loài nghiên cứu phổ biến chi Hình 9.2: Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Ðể khai thác sử dụng A tumefaciens vector chuyển gene nhà khoa học loại bỏ gene gây khối u gene mã hoá opine T - ADN thay vào marker chọn lọc, trì vùng bờ phải bờ trái TADN gen vir Gene chuyển xen vào vùng bờ T-ADN Nó chuyển vào tế bào trở nên hợp với nhiễm sắc thể tế bào thực vật - Hình thành vết đứt vị trí vùng biên phải RB đoạn T- ADN - Đoạn gene sau tách khỏi plasmid nhờ hình thành đoạn đứt thứ hai Đoạn đứt thường không cố định plasmid khác - Trong axit nucleic trống tạo plasmid lấp đầy theo nguyên tắc bổ sung axit nucleic đoạn T- ADN tách bám protein bám sợi đơn (SSBP) Nhờ phức hợp với SSBP mà đoạn gen T- ADN chuyển vào nhiễm sắc thể chủ Nuôi cấy khuẩn lạc Agrobacterium - Khuẩn lạc Agrobacterium đơn độc nuôi qua đêm YENB lỏng (0,75% chiết xuất men bia, 0,8% nước dùng dinh dưỡng) vừa bổ sung 50 mg/l kanamycin 27 °C lắc 150 vòng / phút - Sau đó, tiến hành nuôi cấy liên tục OD600nm xấp xỉ 0,1 - Tiếp tục nuôi cấy 4-5 điều kiện tương tự đạt 0,6-1,6,0 OD600nm - Sản phẩm nuôi cấy pha loãng tới nồng độ 0.1 0.2 sử dụng để lây nhiễm mầm Gây nhiễm Agrobacterium vào mầm dứa - Cách lấy mẫu mầm dứa: Chồi nách dứa + Cắt lấy phần gốc (leaf base) - cm + Cắt nhỏ phần gốc 0.5 - 1cm - Đưa dung dịch chứa khuẩn lạc Agrobacterium chuyển gen nồng độ 0.1-0.2 mầm chồi dứa vào môi trường MS có bổ sung ACS 100 μM để gây nhiễm - Các mẫu sau gây nhiễm thấm khô kỹ tờ giấy tiệt trùng, trồng tiếp ngày môi trường Pin-1 củng cố gerite 0,2% - Sau đồng canh tác mầm chuyển sang môi trường đặc (với gerite 0,2%) Pin-1 bổ sung cefotaxime (400 mg/l) trì ngày - Tiếp tục nuôi cấy rễ mầm phát triển đạt cm (sau tuần) - Cây chuyển gen cứng cáp chuyển vào nhà kính cốc giấy chứa đất trồng trọt có chất lượng tốt tiệt trùng Tách chiết ADN từ gây nhiễm Agrobacterium chuyển gen - Mẫu xử lý RNAse (100 μg/ml) 37 °C giờ, sau chiết xuất ADN phenolchloroform kết tủa cồn Bước 1: Phá màng tế bào màng nhân (TB eukaryote) - Mục đích: Phá màng TB màng nhân - Phá vỡ tế bào thực vật phương pháp vật lí hay hóa học • Phương pháp: nghiền TB hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarkosyl) proteinase (proteinase K)  phá vỡ màng TB màng nhân, giải phóng ADN mơi trường đồng thời phân hủy protein liên kết với ADN  SDS (sodium dodecyl sulfate): Chất tẩy rửa, làm gãy liên kết không cộng hóa trị  Sarkosyl: Hòa tan protein màng  Proteinase K: Enzyme phân cắt protein (protease) Lưu ý: Do tế bào thực vật có vỏ cellulose, nên phải nghiền nitơ lỏng 196oC, giúp làm cho vách cellulose trở nên giòn hơn, dễ vỡ hơn, đồng thời bảo vệ ADN phóng thích từ nhân khơng bị tiêu hủy protease tế bào Bước 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu, chủ yếu protein - Mục đích: Loại bỏ thành phần ADN - Dùng dd phenol: chloroform  làm biến tính protein • Phenol-Chloroform khơng tan nước làm biến tính protein  Protein bị tủa gặp phenol  ADN không bị tủa phenol nên tan nước  Sau li tâm, thu phần nước phía ống nghiệm chứa ADN hòa tan, phần protein kết tủa, phần đáy ống nghiệm tạp chất lẫn khác Bước 3: Tủa nucleic acid - Mục đích: • • • Thu nhận nucleic acid dạng cô đặc Bảo quản tránh tác dụng enzyme phân huỷ nucleic acid Hòa tan nucleic acid lại dd theo nồng độ mong muốn  Tủa ethanol (ethylic alcohol) - Điều kiện: • • • Mơi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao) Vethanol : V mẫu = 2,5 :  Lượng dư ethanol làm kết tủa hoàn toàn ADN Nhiệt độ thấp  Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tạo kết tủa - Sau tạo tủa ethanol, đem dd li tâm  thu ADN cô đặc (pellet) Phân tích phân tử dòng dứa biến đổi gen phản ứng chuỗi polymerase - ADN sau tách chiết tiến hành PCR + Các mồi sử dụng cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là: 5′GGATCCAACAATGGCTCTTGCTCCATCCAAAGTT3′ 5′GAGCTCGGCTATTCAAGATTAAGCAGCATC3′ Một mẫu 50-ng tổng số ADN sử dụng để phân tích PCR với thể tích phản ứng 50 μl chứa × Taq polymerase đệm, 100 μM dNTP, μM lượng mồi U lượng Taq polymerase Quy trình  Bước Chuẩn bị - Chuẩn bị vật liệu: đoạn ADN đặc hiệu, đoạn mồi, polymerase, nucleotide tự - do, dung dịch đệm Cho vật liệu vào ống nghiệm plastic, sau đặt ống nghiệm vào máy luân nhiệt  Bước Phản ứng PCR - Là phản ứng theo nhiều chuỗi chu kì nối tiếp Một chu kì bao gồm giai đoạn: + Giai đoạn biến tính: nóng chảy 94 °C phút để tách ADN thành sợi + đơn, 30 chu kỳ khuếch đại bao gồm 94 °C phút Giai đọan lai ghép: ADN mồi bắt cặp với sợi đợn ADN ban đầu thực nhiệt độ 58 °C 1,5 phút, 72 °C phút + Giai đoạn tổng hợp ADN: Taq polymerase điều khiển gắn tiếp nu vào sau ADN mồi với mạch khuôn ADN ban đầu, phần khuếch đại cuối thực nhiệt độ 72 °C 10 phút  Một chu kỳ bao gồm bước lặp lặp lại nhiều lần lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước Đây khuếch đại theo cấp số nhân, kết cuối phản ứng PCR sau n chu kỳ phản ứng ta có 2n phân tử ADN mạch kép nằm đoạn mồi  Bước Thu nhận ADN Các sản phẩm hiển thị cách sử dụng gel SYBR bảo vệ ADN (Invitrogen, USA) gel agarose 2% Kết quả: - Phân tích PCR sáu dòng dứa chuyển gen có tính chất cho cấu trúc cho thấy khuếch đại đoạn 780 cặp bazơ tương ứng với kích thước dự kiến ferritin đậu tương, vắng mặt khơng biến đổi gen (Hình 3a, b) Hình a) Phân tích PCR chuyển gen pSF hiển thị khuếch đại băng đoạn 780 cặp bazơ cụ thể gen ferritin đậu tương + Làn 1 kb thang đo + cực dương, không biến đổi + 4–9 mẫu biến đổi gen b) Phân tích PCR chuyển gen pEFE-SF cho thấy khuếch đại dải băng 780 cặp bazơ cụ thể gen ferritin đậu tương + Làn 1 kb thang đo + kiểm sốt biểu + khơng biến đổi +làn 4–9 mẫu biến đổi gen riêng lẻ Phân tích PCR phiên mã ngược tìm dòng có khả chuyển gen thành cơng - Sáu dòng chọn sau PCR tiếp tục phân tích phiên mã ngược (RT) –PCR để xác định biểu tính trạng gen chuyển (Q trình RT-PCR: RNA chuyển thành cADN nhờ enzyme phiên mã ngược Mồi sử dụng giai đoạn mồi ngược PCR, bắt cặp ngẫu nhiên với trình tự ngắn cADN, sau cADN khuếch đại nhờ taq polymerase.) - RNA tổng số phân lập từ dòng chuyển gen khơng chuyển gen, sử dụng RNeasy mini kit cho thực vật (Qiagen, USA) - Một lượng 1-μg trích từ tổng số RNA sử dụng để tổng hợp cADN cách sử dụng hệ thống cMaster RT-PCR (Eppendorf, Hoa Kỳ) 10 microlit cADN dùng làm mẫu cho PCR với mồi đặc hiệu ferritin đậu tương với điều kiện cho phân tích PCR giống miêu tả Biểu tính trạng xác định khuếch đại đoạn 780 cặp bazơ Kết quả: - Đảo ngược phiên mã (RT) -PCR xác nhận biểu gen chuyển Một dải ferritin cụ thể 780 cặp bazơ quan sát thấy chuyển gen hai cấu trúc, vắng mặt dạng khơng biến đổi (Hình 4) Hình Phiên mã ngược phản ứng chuỗi polymerase cho thấy biểu gen ferritin cách khuếch đại 780 cặp bazơ cADN chuyển gen + Làn 1 kb thang đo + khơng chuyển gen + kiểm sốt biến đổi + 4–5 mẫu biến đổi gen riêng lẻ pSF + 6–7 biến thể riêng lẻ pEFE-SF Phân tích đánh dấu Southern PCR dòng RT-PCR-dương tính - Các phương pháp xác định PCR RT-PCR phân tích hệ gen lai ghép Southern xác nhận tích hợp ổn định gen chuyển Gắn nhãn DIG cho ferritin cADN cho thấy lai tạo hai dòng pSF pEFESF, chúng vắng mặt không chuyển đổi Dòng pSF chuyển đổi số cho thấy tích lũy ba dòng chuyển đổi từ PEFE-SF cho thấy tích hợp bốn gen chuyển (Hình 5) Hình 5: Phân tích gen Southern blot chuyển gen ADN hệ gen phân cắt HindIII lai với đầu dò gắn nhãn DIG cho ferritin đậu tương cADN + Làn 1 kb thang đo, + plasmid kiểm soát biểu + khơng chuyển gen kiểm sốt biểu + chuyển gen dòng pSF-4 + chuyển gen dòng pEFE-SF-6 - Sau PCR RT-PCR thu hai dòng chuyển gen biểu cao (pSF dòng EFE-SF dòng 6) - Hai dòng nhân lên phân tích cách lai ghép Southern để xác nhận ổn định tích hợp gen ferritin để xác định số lượng - CTAB chuẩn giao thức sử dụng để phân lập cắt nhỏ ADN gen In vết ADN lên màng nylon (Hybond N +; Amersham-Pharmacia, USA) sau tách gel thực theo hướng dẫn nhà sản xuất - ADN (10–20 μg) phân lập từ dòng chuyển gen độc lập cắt nhỏ với Hind III ADN phân cắt điện di gel agarose TAE 1% chuyển sang màng Hybond N + (Amersham Pharmacia Biotech, Vương quốc Anh) sử dụng công thức chuẩn - Những ADN lai với đoạn đầu dò ngẫu nhiên gắn DIG có 780 cặp bazơ thu PCR khuếch đại pSF với mồi đề cập Xác định dấu hiệu hóa học phép lai tạo hiển thị phản chiếu phóng xạ Ước lượng số lượng sắt kẽm dòng chuyển gen cách sử dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử - Dụng cụ thủy tinh sử dụng cho quang phổ hấp thụ nguyên tử rửa tráng axit nitric pha lỗng sấy khơ 12 trước sử dụng - Đĩa thủy tinh ủ lò khơng khí nóng 140 °C 12 - 10 gram mô tươi thu thập từ ống nghiệm chuyển đến đĩa petri thủy tinh - Đối với mẫu, 0.250 g mô khô chuyển đến bình hình nón 250 ml phân cắt 30 ml axit nitric đậm đặc axit percloric theo tỷ lệ 5: 1, tương ứng Các bình giữ đĩa nóng điều chỉnh đến 80 °C đun 2-6 thấy khói trắng axit perchloric - Các mẫu để nguội lọc qua giấy lọc Whatman (số 40) vào bình định mức 25 ml thể tích mẫu điều chỉnh đến 25 ml nước MilliQ vô trùng - Các mẫu chuẩn bị phân tích máy quang phổ hấp thụ nguyên tử than chì PerkinElmer HGA 400 Dung dịch tiêu chuẩn chứa sắt (1–5 μg/ml) kẽm (0,2–1,5 μg/ml) chuẩn bị sử dụng cho quang phổ hấp thụ nguyên tử để vẽ đường cong tiêu chuẩn Kết quả: Sự tăng cường tích lũy hàm lượng sắt kẽm dòng dứa biến đổi gen quan sát phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử - Trong điều kiện in vitro, 574 μg/g DW sắt ghi nhận dòng chuyển gen chuyển đổi với pSF biểu cassette (expression cassette: khả biểu gen chuyển), tăng gấp 5,03 lần tích lũy sắt so với khơng biến đổi (Bảng 1) Cùng dòng cho thấy nồng độ tích lũy kẽm đến 192,01 μg/g DW tăng gấp 2,44 lần so với khơng chuyển gen Sự tích lũy tăng gấp 3,65 lần sắt tăng gấp 2,0 lần kẽm thu chuyển gen với biểu pEFESF cassette (Bảng 2) Số S Nồng độ Fe Trung bình Nồng độ Zn Trung bình (μg / g / dw) tăng gấp (μg / g / dw) tăng gấp SF-1 479.52±2.27 4.21 188.12±0.52 SF-2 452.37±3.92 3.96 172.75±0.68 SF-3 487.12±2.39 4.26 188.51±1.23 SF-4 574.36±3.02 5.03 192.01±2.12 SF-5 502.98±3.71 4.41 158.53±0.85 SF-6 469.75±1.92 4.11 185.51±1.36 ĐỐI CHỨNG 114.12±2.02 78.61±0.13 (cây không biến đổi) Bảng Hàm lượng sắt kẽm chuyển gen pSF Số S Nồng độ Fe (μg Trung / g / dw) tăng gấp EFE- SF-1 251.62±2.33 2.21 2.39 2.19 2.39 2.44 2.01 2.35 bình Nồng độ Zn Trung (μg / g / dw) tăng gấp 119.81±3.07 1.52 bình EFE- SF-2 218.74±3.39 1.91 122.95±0.15 1.56 EFE- SF-3 336.06±2.68 2.94 124.01±2.18 1.57 EFE- SF-4 331.83±4.06 2.91 123.17±1.56 1.56 EFE- SF-5 371.25±2.74 3.25 145.02±2.39 1.84 EFE- SF-6 410.22±2.16 3.65 161.23±3.25 2.05 ĐỐI CHỨNG 114.12±2.02 78.61±0.13 Bảng Hàm lượng sắt kẽm chuyển gen pEFESF - Tương tự nghiên cứu tích lũy 574,36 μg/g sắt 192,01 μg/g kẽm vùng khởi động ubiquitin sử dụng, sử dụng vùng khởi động EFE dẫn đến tích lũy 410,22 μg/g sắt 161,23 μg/g kẽm dứa chuyển gen Như đề xuất nghiên cứu họ điều tra khác biệt mức độ tích lũy sắt kẽm chuyển gen sức biểu vùng khởi động sử dụng Tuy nhiên, nghiên cứu cơng trình gần chuối cho thấy mức độ tích lũy cao cách tăng mức biểu gen ferritin đậu tương cách sử dụng vùng khởi động mạnh mẽ chuyển gen Hơn nữa, mức độ tích lũy tương tự đạt loại trái cung cấp RDA theo yêu cầu lần sử dụng Nỗ lực tiến hành theo hướng nghiên cứu để xác định tăng cường tích lũy sắt kẽm q trình chuyển gen dứa Tài liệu tham khảo Tài liệu “Công nghệ sinh học người động vật”, Phạm Kim Ngọc Phạm Văn Phúc “Sinh học phân tử”, Hồ Huỳnh thị Thùy Dương Trang web: Ứng dụng vi sinh vật biến đổi gen xử lý môi trường: http://iae.vn/NewDetails/ung-dung-vi-sinh-vat-bien-doi-gen-trong-xu-ly-moi-truong-2505 Top 13 Methods of Gene Transfer (With Diagram): http://www.biotechnologynotes.com/gene-cloning/top-13-methods-of-gene-transfer-withdiagram/469 Thực phẩm biến đổi gen: https://www.slideshare.net/nambenho14/thc-phm-bd-gen-1-1 “Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen vi khuẩn agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi aspergillus oryzae” http://repository.vnu.edu.vn/bitstream/VNU_123/17298/1/01050003177.pdf Marker chọn lọc sử dụng công nghệ tạo GM chiến lược cải tiến https://text.123doc.org/document/4278399-marker-chon-loc-su-dung-trong-cong-nghetao-cay-gm-va-cac-chien-luoc-cai-tien.htm ... KHÁI NIỆM VỀ KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ GEN CHUYỂN Khái niệm kỹ thuật chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) kỹ thuật đưa gen lạ (1 đoạn phan tử ADN RNA) vào tế bào chủ, làm cho gen lạ tồn plasmid... thuật chuyển gen gồm bước sau: Tạo ADN tái tổ hợp 2 Đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận Kiểm tra sát nhập gen biểu gen Quy trình kĩ thuật chuyển gen giống với tạo dòng có mục đích khác Kĩ thuật chuyển. .. yếu tố lạ - (gen chuyển) , tránh thải loại Gen chuyển phải vào tế bào nhận phải diễn dung hợp gen tế bào - vào gen chuyển Gen chuyển phải biểu tế bào chủ Số lượng cá thể nhận gen chuyển phải khuếch