kĩ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) là kỹ thuật đưa 1 gen lạ (1 đoạn phan tử ADN hoặc RNA) vào tế bào chủ, làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của cơ thể chuyển gen. Mục đích tạo ra giống sinh vật mới. Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) là kỹ thuật đưa 1 gen lạ (1 đoạn phan tử ADN hoặc RNA) vào tế bào chủ, làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của cơ thể chuyển gen. Mục đích tạo ra giống sinh vật mới. Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) là kỹ thuật đưa 1 gen lạ (1 đoạn phan tử ADN hoặc RNA) vào tế bào chủ, làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của cơ thể chuyển gen. Mục đích tạo ra giống sinh vật mới.

5 Nguyễn Thị Hương Lài

GIẢNG VIÊN: CÔ NGUYỄN THỊ HẰNG

Môn: KĨ THUẬT DI TRUYỀN

KĨ THUẬT CHUYỂN GEN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM

KHOA SINH HỌC

A KHÁI NIỆM VỀ KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ GEN CHUYỂN

1. Khái niệm kỹ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) là kỹ thuật đưa 1 gen lạ (1 đoạn phan tử ADN hoặcRNA) vào tế bào chủ, làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn vào

bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen tế bào chủ Gen lạ trong tế bào chủ

hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của cơ thể chuyển gen Mục đích tạo ra giống sinh vật mới.

- Kĩ thuật chuyển gen gồm những bước cơ bản sau:

1 Tạo ADN tái tổ hợp

2 Đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận

3 Kiểm tra sự sát nhập của gen và biểu hiện của gen

Quy trình của kĩ thuật chuyển gen giống với tạo dòng nhưng có mục đích khác nhau Kĩthuật chuyển gen nhằm tạo ra giống sinh vật mới

Nguyên lý: một đoạn gen mong muốn được khai thác, sau đó chúng được tháo tác các

yếu tố cần thiết để chuyển vào hệ gen nhân của tế bào nhận Gen chuyển có khả năngbiểu hiện và di truyền ổn định ở thế hệ sau, đó là nguyên lý của công nghệ này

2. Gen chuyển

Gen chuyển là các gen mã hóa tính trạng mong muốn được tách chiết từ các sinh vậtkhác như động vật, thực vật, vi sinh vật chúng mã hóa các tính trạng số lượng, chấtlượng (như sản lượng sữa, thịt), hay mã hóa một số thành phần bổ sung

Cấu trúc của gen chuyển bao gồm 2 trình tự chính: Trình tự mã hóa cho phân tửprotein (transgen – gen chuyển) và trình tự điều hòa (promoter và enchancer)

Để biểu hiện protein trong mô chuyên biệt, cấu trúc gen phải chứa trình tự điều hòathích hợp, có khả năng phiên mã trực tiếp trong mô Vùng điều hòa có chiều dài khoảng100bp, kết hợp với các nhân tố cis hoặc trans để tham gia quá trình phiên mã (khởi độnghay kết thúc quá trình phiên mã

Enhancer: một đoạn ADN ngắn, có thể gắn với protein (còn gọi là nhân tố hoạt độngtrans), làm tăng mức độ phiên mã của gen mục tiêu trong 1 nhóm gen, không phụ thuộcvào vị trí định hướng của gen

*Ngoài ra còn nhiều cấu trúc khác cần gắn vào gen chuyển

- Các marker chọn lọc: khi gen chuyển vào tế bào, chúng được nuôi cấy để sau đósàng lọc, chọn ra những tế bào đã được biến nạp hoặc tải nạp thành công Gồm 2 loại:

+ Các marker chọn lọc dương (sản phẩm của gen chọn lọc) được sử dụng hiệu quảtrong hầu hết các gen chuyển, nhằm chọn lọc những tế bào đã nhận được cấu trúc genchuyển (ở dạng tự do hay đã được sát nhập vào bộ gen tế bào chủ)

+ Các marker chọn lọc âm thường đươc sử dụng: HSV-tk, dt và hprt để chọn lọc tếbào không tồn tại gen chuyển hay 1 gen nào đó bên trong

- Gen báo cáo (reporter gen) là những gen mã hóa cho các protein dễ phát hiện giúpbáo cáo vai trò hoạt động của gen, được chèn vào “bên sườn” của gen chuyển Dựa vào

sự biểu hiện của gen báo cáo giúp đánh giá sự điều hòa của gen chuyển trong tế bào haymô

- Polylinker: Ở cuối các cấu trúc gen có thể được biến đổi để hình thành cácpolylinker chứa một số vị trí nhận diện của các enzyme cắt giới hạn Polylinker cho phépcấu trúc gen chèn vào những vector, nhằm mục đích nhân dòng và kiểm tra

ADN gen chuyển được tạo ra bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn và ligase,gen từ những loại khác nhau có thể được kết hợp lại trong ống nghiệm để tạo thành cấutrúc gen chuyển

Cấu trúc gen chuyển

ATG: Vị trí bắt đầu phiên mã

SIG: Trình tự dấu hiệu

AAA: đuôi poly A

- Gen chuyển phải được biểu hiện trong tế bào chủ

- Số lượng cá thể nhận gen chuyển phải được khuếch đại (di truyền cho thế hệ con cái) để

di truyền hiệu quả của gen chuyển

- Tổ hợp gen cần chuyển phải được chèn chính xác vào vị trí cần thiết đồng thời khống chếđược những tác động tiêu cực của mô chủ

B CÁC BƯỚC TRONG CHUYỂN GEN

I Tạo ADN tái tổ hợp

1 Khái niệm chung

- ADN tái tổ hợp (recombinant ADN) được dùng để chỉ các phân tử ADN được tạo ra

từ hai hay nhiều phân đoạn ADN xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau

* Những yêu cầu của ADN tái tổ hợp

- ADN tái tổ hợp phải đạt được những yêu cầu cần thiết của một vector chuyển gen

- ADN tái tổ hợp phải có hoạt tính khi đưa vào tế bào chủ

- ADN tái tổ hợp phải có những dấu hiệu dễ phát hiện trong quần thể vi khuẩn Và dễquan sát sự hoạt động và biểu hiện của gen tái tổ hợp

2 ADN tái tổ hợp được thực hiện như thế nào?

Các bước cơ bản thực hiện ADN tái tổ hợp

2.1 Chọn nguyên liệu

- ADN được chọn làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường là ADN plasmid vàADN phage Chúng được thu nhận chủ yếu từ tế bào vi sinh vật, được tách và làm sạchtheo phương pháp chiết tách ADN plasmid, ADN virus

- ADN chứa gen cần nghiên cứu (ADN lạ) cũng được thu nhận từ tế bào sinh vật đượcchiết tách và làm sạch và kiểm tra theo phương pháp chiết tách ADN

2.2 Gia công đoạn ADN cần chuyển với sự tham gia của enzyme RE kiểu II

RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: là những enzyme cắt ở những vị trí xác địnhchúng có một số ưu điểm: Hầu như chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảmnhiệm việc cải biên Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay ở bên tronghay cạnh trình tự nhận biết Chúng chỉ cần ion Mg +2 và không cần năng lượng ATP

- Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử ADN và cắt ADN thành haimảnh dạng đầu bằng hay đầu dính

Hiệu quả cắt của enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như hàmlượng của enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH và độ tinh khiết của ADN

2.3 Nối ADN vào vector với sự có mặt của enzyme ADN ligase

Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối các đoạn ADN vào vector chuyển gen đểtạo vector tái tổ hợp có mang ADN lạ Phản ứng nối được thực hiện nhờ enzyme ADNligase

ADN ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh ADN bằng cách tạocầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh nhau

(Hình 6-2) Trong sinh học phân tử, người ta coi ADN ligase như một chất keo phân tử

để kết dính các mẫu ADN lại với nhau.

2.3.1 Nối đầu bằng

Nối đầu bằng được xảy ra khi haiđoạn ADN đầu bằng đứng cạnh

nhau Dưới tác dụng của enzyme

ligase, liên kết phosphodiester

giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH)

được hình thành và hai nucleotide

được nối lại với nhau

2.3.2 Nối đầu lệch

Đầu tiên, hai mảnh ADN đầu

lệch do có những bazơ bổ sung

nên chúng tiến gần lại nhau để tạo

liên kết hydro giữa các bazơ nitơ bổsung Sau đó, hai nucleotide của haiđầu nối tạo liên kết este giữa OH

(3’) và P (5’) dưới tác dụng của

enzyme ADN ligase

=> Nhờ sử dụng các enzyme cắt giới hạn và ligase, gen từ những loài khác nhau có thểđược kết hợp lại trong ống nghiệm để tạo thành cấu trúc gen chuyển

II Đưa ADN vào tế bào nhân

1 Kỹ thuật Calcium phosphate (calcium phosphate technique)

Nguyên tắc: khả ẩm bào của phức hợp ADN – calcium phosphate.

Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) được phát triển đầu tiên đểxác định sự lây nhiễm của ADN virus (Graham,1973)

Hiện nay được sử dụng rông rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp của ADN viruscũng như ADN tách chiết từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer,1980)

Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận với các chất đồng kết tủa ADN và calciumphosphate Kết tủa này bám vào tế bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩmbào (Loyter, 1982) Trong tế bào, các phân tử ADN ngoại lai nằm trong không bào đượctạo thành do ẩm bào và lysosome nhưng rất ít ADN đi đến nhân và hợp nhất vào genomechủ

Hình: Phức hợp ADN-calcium phosphate

Kỹ thuật này vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứu chuyển gen vào các tế bào somanuôi cấy và đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích Bên

cạnh đó, biến nạp ADN tách chiết từ các tế bào ung thư vào các tế bào nhận không ungthư đã cho thấy đây là phương pháp duy nhất để nghiên cứu sự kiểm soát di truyền củaung thư

Ưu điểm: đơn giản, protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp

không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc ổn định và quan trọng trong việcthiết kế vector virus tái tổ hợp

Nhược điểm: hiệu quả biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp.

2 Chuyển gen qua liposome

Nguyên tắc: sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-ADN.

Hình 2.1: Cấu trúc tổng quát của Lipid cation

Hình 2.2: Cấu trúc tổng quát của DOPE (L-diolecyl phosphatidyllethanolamine)

Hình 2.3: Phức hợp Liposome-ADN.

Hình 2.4: Sơ đồ Hoạt động của vector liposome.

- Lipid cation được trộn với một lipid trung tính như L-dioleoyl ethanolamine (DOPE)

phosphatidyl Phần cation của phân tử lipid kết hợp với ADN tích điện âm và kết quả là chứa đầy ADNtrong phức hợp liposome-ADN

- Nhờ cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân.DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vai trò của nó là phóng thích cácphức hợp này từ endosome cũng như làm cho sự dung hợp của màng tế bào phía ngoàivới phức hợp liposome-ADN xảy ra dễ dàng

Ưu điểm: gen chuyển sẽ không hợp nhất vào genome chủ, có hiệu quả tốt đối với

cả tế bào in vitro và in vivo, có thể mang được các ADN có kích thước rất lớn, độ tinhkhiết cao, không gây miễn dịch, có thể sử dụng với các tế bào mà biến nạp bằng kỹ thuậtcalcium phosphat không có hiệu quả

Nhược điểm: sự biểu hiện gen chuyển thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành

phần của huyết thanh có thể xảy ra

3 Phương pháp vi tiêm

Sự thành công đầu tiên trong nghiên cứu tạo chuột chuyển gen bằng phương pháp vitiêm vào tiền nhân đã được công bố vào năm 1980 (Gordon, 1980)

Hình 3.1: Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân của trứng thụ tinh

Cho đến nay, trong các kỹ thuật chuyển gen vào động vật thì phương pháp vi tiêmdung dịch ADN vào hợp tử là phương pháp có hiệu quả nhất trên động vật có vú và hiện

là phương pháp chủ yếu được sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi

Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền phôicủa hợp tử hoặc các tế bào tiền phôi của hạt phấn

Nguyên tắc: một lượng nhỏ ADN được tiêm trực tiếp vào tế bào phôi trần hoặc tế

bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi

- Dung dịch gen chuyển

- Gen chuyển được xen vào trong một vector plasmid và tạo dòng trong E.coli

- Các vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp được phát hiện trong môi trườngnuôi cấy có thuốc kháng sinh do plasmid mang các gen kháng thuốc đặc hiệu

- Các vi khuẩn sống sót được sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng thích hợp

và plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển sẽ được sao chép mỗi khi tế bào vi khuẩn phânchia

- Sau đó, hàng triệu bản sao của plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển được táchchiết từ các tế bào vi khuẩn này và các đoạn gen chuyển được tách ra từ plasmid tái tổhợp nhờ sử dụng enzym hạn chế

- Ðể tinh sạch, gen chuyển được điện di trên gel agarose

- Hoà tan gen chuyển trong dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA;dung dịch TE ) và tính nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang phổ kế

- Nồng độ dung dịch ADN sử dụng cho vi tiêm thường là 1-5 µg/ml

- Trước khi chuyển vào phôi, gen chuyển được kiểm tra sự biểu hiện trong các tếbào nuôi cấy bằng sự chuyển nhiễm (transfection)

vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhânbằng cách vặn nhẹ syringe Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng to và trở nên sáng hơn thìdừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra

- Trứng tiền nhân sau khi tiêm được di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước khi tiêmtrứng tiền nhân tiếp theo

- Mỗi một nhóm trứng tiền nhân đã hoàn thành được chuyển sang một đĩa môitrường khác để ấp và đánh giá bằng mắt trong một vài tiếng

- Sau đó tất cả các trứng tiền nhân được nhìn thấy rõ ràng và được chuyển vào ốngdẫn trứng của con cái nhận

Thỏ 1907 218 (11,4%) 28 (1,5%)Cừu 1032 73 (7,1%) 1(0,1%)

- Đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính xác nên hạn chế số lượng tế bào vitiêm và ngoài ra còn có thể làm tổn thương đến tế bào phôi do tác nhân cơ học gây ra khithực hiện.

- Sự xâm nhập của gen chuyển vào ADN tế bào vật chủ là một quá trình ngẫunhiên và xác suất để gen chuyển xen vào vị trí ADN vật chủ mà sẽ cho phép nó biểu hiện

là thấp

4 Biến nạp (Transformation)

Nguyên tắc: Muốn đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ được phải làm cho màng

sinh chất tế bào nhận bị biến đổi sau đó ủ với một tỉ lệ giữa vector tái tổ hợp với tế bàochủ đã xử lý

Biến nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng ADN Trong biếnnạp, ADN trần từ một tế bào vi khuẩn (thể cho) này được truyền sang tế bào vi khuẩnkhác (thể nhận) Biến nạp xảy ra khi vi khuẩn nhận ADN ngoại lai và hấp thu vào trong tếbào Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ do bị tan (lysis), ADN vòng tròn của chúng thoát ra môitrường thành các đoạn thẳng với chiều dài khác nhau, có khả năng gây biến nạp cho các

tế bào nhận khác

Biến nạp được nghiên cứu kĩ nhất ở các vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae và ở một số nhóm vi khuẩn khác.

Hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào 3 yếu tố:

+ Tính dung nạp của tế bào nhận

+ Kích thước của đoạn ADN ngoại lai

+ Nồng độ của ADN

4.1 Cơ chế phân tử

Hình 4.1: Sơ đồ diễn biến của quá trình biến nạp ở cấp độ phân tử

a. ADN bám vào b Thâm nhập c Bắt cặp và tái tổ hợp d –Tế bào biến nạp

4.2 Quá trình gồm các giai đọan chủ yếu

– Sự phân hủy ADN tế bào cho: ADN tế bào cho có thể là của tế bào tự nhiên bị

phân hủy hoặc trong thí nghiệm bị gây chế bằng nhiệt độ cao hay tác nhân phá vỡ tế bào

– ADN bám vào bề mặt tế bào: Protein gắn vào ADN.

– Thâm nhập của ADN: Sợi ADN mạch kép của dòng vi khuẩn S sau khi chui qua màng tế bào của dòng R thì một mạch S sẽ bịnucleaz của tế bào cắt, còn lại một mạch

nguyên

– Bắt cặp (Synapsis)và tái tổ hợp: Nhờ sự hỗ trợ của protein RecA ADN của thể

nhận R sẽ biến tính tách rời 2 mạch ở 1 đoạn dễ bắt cặp với đoạn ADN thể cho S vừachui vào

Sao chép: Sau khi bắt cặp tạo đoạn lai R - S, phân tử ADN sao chép tạo ra 2 sợi,

một sợi kép R-R và sợi kép khác có mang đoạn ADN thể nhận S-S Kết quả cuối cùng làđọan gen của SIII chèn vào bộ gen tế bào nhận Sau phân bào thì một dòng tế bào nhậnđược ADN ngoại lai vào bộ gen - tế bào được biến nạp Tế bào đã được biến nạp sinh sảntạo dòng nhận RII mới

4.2.1 Làm cho màng sinh chất bị biến đổi nhờ hóa biến nạp

- Phương thức kinh điển để biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.Coli

+ B1: Các tế bào chủ được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở thành tế bào khả biếngiúp cho chúng dễ tiếp nhận ADN plasmid

+ B2: ADN plasmid đưa vào bằng cách shock nhiệt nhanh (40-50giây)

+ B3: Các tế bào biến nạp được chọn lọc bằng phương pháp chọn lọc dương tínhtrên đĩa agar chứa môi trường LB với kháng sinh thích hợp Mỗi khuẩn lạc trên đĩa khángsinh đại diện cho một thể biến nạp đơn

+ B4: Bổ sung thêm cơ chất NST cho β – galactosidase (X- gal)

=> Các tế bào chứa plasmid mang ADN ngoại lai có thể xác định bằng mắt

4.2.2 Làm cho màng sinh chất bị biến đổi nhờ điện biến nạp

- Đây là kĩ thuật hiệu quả nhất để biến nạp vi khuẩn

- Hai thông số quan trọng là loại tế bào vi khuẩn và tần số xung điện cần thiết

Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên màng

sinh học của tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ ADN tái tổ hợp dễ dàng

- Hiệu suất khoảng 108 - 109 thể biến nạp/μg plasmid

- Phương pháp này đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền

4.2.3 Biến nạp gen nhờ polyetylen glycol (PEP)

- Là phương pháp chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ đã được xử lý bằngpolyetylen glycol (PEG)

- Để tạo tế bào trần người ta ủ tế bào với PEG nồng độ 30 – 40%

- Đây là phương pháp hiệu quả cao đối với tế bào thực vật Bằng phương pháp nàyngười ta đã nhận được các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua nhiềuthế hệ

Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao Có thể

chuyển gen vào tế bào protoplast của bất kỳ loại cây nào Đặc biệt loai cây có giá trịkinh tế cao như: lúa, ngô, đại mạch

Nhược điểm: Việc tái sinh cây protoplast còn rất khó khăn ở một số loài cây.

5 Tải nạp (Transduction)

Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn chosang vi khuẩn nhận, trong đó quá trình chuyển gen và tái tổ hơp gen ở vi khuẩn nhờ thựckhuẩn thể (Bacteriophage).

Thực nghiệm đã chứng minh được tải nạp ở E.Coli qua phage λ, pha P1 và ở Bacillus subtilis qua phage SP10 thì tải nạp cho hiệu quả cao hơn.

Tiêu chuẩn virus làm vector chuyển gen:

+ Hệ gen của virus phải là ADN

+ Không gây tác hại đáng kể cho thực vật

+ Có khả năng tải được đoạn ADN gắn vào

Tuy nhiên phương pháp này ít được sử dụng

Ưu điểm: Virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật.

* Tải nạp gồm: tải nạp chung và tải nạp chuyên biệt

5.1 Tải nạp chung (Genral transduction)

Tải nạp chung xảy ra khi phage mang bất kì gen nào của vi khuẩn A chuyển sang vi

khuẩn B

Tải nạp chung (genralized transduction) có các đặc điểm:

- Thường do phage kiểu P1 thực hiện.

- Bất kì gen nào của vi khuẩn cũng đều được tải nạp.

- Tải nạp có được do gói nhầm ADN của tế bào chủ khi phage trưởng thành.

- Các thể tái tổ hợp đơn bội được tạo ra.

5.2 Tải nạp chuyên biệt (Special transduction)

Tải nạp chuyên biệt hay hạn chế (restricted transduction) là trường hợp chỉ mang một vài gen nhất định, nó có 4 đặc điểm:

- Những gen được chuyển nằm sát chỗ prophage gắn vào.

- Chỉ prophage kiểu λ thực hiện.

- Do kết quả sự cắt sai của prophage khi tách khỏi nhiễm sắc thể của tế bào chủ.

- Các vi khuẩn tái tổ hợp có thể lưỡng bội một phần.

6 Chuyển gen nhờ vector là virus

Nguyên tắc: Virus được sử dụng để lây nhiễm vào tế bào giai đoạn sớm của phôi

trước khi được chuyển ghép vào con mẹ

Nhiều nhóm trong số đó, các papovavirus, adenovirus, retrovirus được sử dụng vàonhững mục đích chuyên biệt Ðể sử dụng làm vector, các phần khác nhau của genomevirus được thay thế bằng gen cấu trúc quan tâm; các virus được sử dụng phải an toàn,không gây bệnh

Các cơ thể chuyển gen sinh ra ở dạng khảm Gen chuyển chỉ có thể di truyền đượcnếu retrovirus hợp nhất vào một số tế bào sinh dục

Khi gen chuyển đã hợp nhất trong các tế bào sinh dục thì được gọi là thể khảm dòngmầm và sau đó được lai cùng dòng khoảng 10-20 thế hệ cho đến khi thu được các độngvật chuyển gen đồng hợp tử và gen chuyển có mặt ở trong tất cả mọi tế bào Ở giai đoạnnày, phôi mang gen chuyển có thể được đông lạnh và được bảo quản cho các quá trìnhcấy chuyển về sau

Ưu điểm: Bất kỳ loại virus nào cũng có thể được sử dụng làm vector để chuyển vật

liệu di truyền vào trong tế bào

Nhược điểm: Tỉ lệ sống của các động vật chuyển gen sơ sinh rất thấp.

Hình 6.1 Chuyển gen ở chuột nhờ vector là virus.

7 Chuyển gen bằng súng bắn gen

Nguyên tắc: sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tăng tốc độ các hạt.

Sử dụng các hạt tungsten đường kính rất nhỏ hoảng 1 micromet ( có thể là các hạtkim loai nặng như vàng, bạc…) được bao bọc ADN và bắn trực tiếp vào tế bào

Dùng phổ biến nhất trong chuyển gen các loài ngũ cốc.

Hình 8.1: Nguyên lý hoạt động cúa súng bắn gen

Ưu điểm: thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào

được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mongmuốn Ứng dụng đa dạng: tạo thực vật chuyển gen, tiêm chủng vaccine di truyền, liệupháp gen tự sát, sự điều biến miễn dịch, …

Nhược điểm: Cây chuyển gen khó tái sinh, hiệu quả thấp, đòi hỏi thiết bị đắt tiền, chi

1 Kiểm tra sự sát nhập của gen chuyển

- Công việc này tốn nhiều thời gian và công sức, bao gồm từ bước thu nhận mô, táchchiết ADN, xác định sự hiện diện của gen chuyển trong bộ gen Một số phương phápthường được sử dụng là PCR, Southern blot, dot blot, sot blot

+ Sử dụng PCR để sàng lọc sơ bộ hàng trăm, hàng ngàn cá thể được chuyển gen, sau đó

sử dụng các phương pháp Southern blot để khẳng định kết quả sàng lọc ban đầu của PCR.+ 2 phương pháp Dot blot và slot blot cũng dùng song song để định lượng tương đối mộtloại ADN đặc trưng nào đó cũng bằng phương pháp lai phân tử và đánh dấu phóng xạ

2 Xác định sự biểu hiện của gen chuyển

- Kiểm tra sự biểu hiện của gen là bước cuối cùng và quan trọng nhất Có hai cách đánhgiá sự biểu hiện của gen ngoại lai trong cơ thể vật chủ:

+ Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua protein

+ Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua mARN

2.2 Một số phương pháp xác định sự biểu hiện của gen chuyển

2.2.1 Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua protein của gen được dịch mã

- Sử dụng trong trường hợp kháng thể của protein gen chuyển có sẵn, phát hiện sự biểuhiện protein có thể được tiến hành bằng phương pháp Western blot, ELISA, RIA

1 Thu nhận protein

2 phân tích kích thước protein bằng điện di

3 Các vạch lai với kháng thể chuyên biệt (lai phân tử)

=> Sự tồn tại các bắt cặp đặc hiệu của kháng thể và protein trên bảng điện di sẽ dựđoán được sự biểu hiện của gen chuyển

2.2.1.1 Kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA)

- Nguyên lý của kỹ thuật ELISA

Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) là một phương pháp sinh hoá

sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặckháng nguyên trong một mẫu; ELISA được sử dụng như một công cụ chẩn đoán y học vàbệnh lý học thực vật, cũng như kiểm soát chất lượng trong các ngành công nghiệp khácnhau

Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể vàgồm các bước cơ bản sau:

• Kháng nguyên – antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt

• Kháng thể – antibody (KT) biết trước được “rửa” qua bề mặt đó Kháng thể nàyđược gắn kết với ezyme

• Thêm vào một cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu

có thể xác định được

a Phương pháp ELISA trực tiếp

Sử dụng một kháng thể có gắn cơ chất enzyme sẽ liên kết trực tiếp với kháng nguyên trên

bề mặt đĩa phản ứng

Các bước tiến hành kĩ thuật ELISA trực tiếp

Ưu điểm:

• Nhanh, vì chỉ sử dụng một kháng thể

có gắn cơ chất à hạn chế tối đa các

thao tác khi thực hiện phản ứng

• Loại bỏ được phản ứng chéo của

kháng thể thứ cấp

Nhược điểm:

• Hoạt động miễn dịch của kháng thể sơcấp có thể bị ảnh hưởng xấu bởienzyme hoặc cơ chất gắn,

• Khó khăn và tốn kém trong việc lựachọn kháng thể cho phản ứng

• Không linh hoạt trong việc lựa chọn

các cơ chất gắn

• Tín hiệu khuếch đại thu được thấp

b Phương pháp ELISA gián tiếp

Trong phương pháp này, một kháng thể thứ cấp sẽ được bổ sung và bắt cặp đặc hiệu vớikháng thể sơ cấp đã bắt cặp với kháng nguyên Kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất sẽ pháttín hiệu khuếch đại khi xảy ra phản ứng bắt cặp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu

Các bước tiến hành kĩ thuật ELISA gián tiếp

Ưu điểm:

• Linh hoạt trong việc sử dụng các kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất

• Linh hoạt và dễ dàng trong việc lựa chọn kháng thể sơ cấp cho phản ứng

• Hoạt động miễn dịch của kháng thể sơ cấp có thể phát huy tối đa vì không bị ảnhhưởng bởi cơ chất đánh dấu

• Độ nhạy cao

• Linh hoạt trong việc sử dụng cơ chất

Nhược điểm:

• Có thể xảy ra phản ứng chéo với các kháng thể thứ cấp à độ đặc hiệu của phản ứng

bị ảnh hưởng

• Thời gian thực hiện phản ứng lâu hơn

c Phương pháp ELISA “Sandwich”

Một kháng thể gắn sẽ được sử dụng để gắn với kháng thể sơ cấp, tiếp theo kháng thể thứcấp có gắn cơ chất enzyme được bổ sung để bắt cặp với kháng thể thứ cấp trong phảnứng Tín hiệu khuếch đại thu được khi có sự bắt cặp kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu

2.2.1.2 Kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA)

Nguyên tắc chung của phương pháp định lượng miễn dịch phóng xạ là dựa trên sự

gắn cạnh tranh giữa hormon tự nhiên (hormon trong máu cần định lượng) và hormonđánh dấu phóng xạ với kháng thể đặc hiệu Mức độ gắn của hai loại hormon này vớikháng thể tỷ lệ thuận với nồng độ ban đầu của chúng: Đo phức hợp hormon gắn đồng vịphóng xạ-kháng thể bằng máy đếm phóng xạ rồi dựa vào đường cong chuẩn ta có thể tínhđược lượng hormon có trong dịch cần định lượng

Dựa trên tính đặc hiệu cao của phản ứng miễn dịch trong đó chất cần định lượng đóngvai trò là KN cùng với KN đồng nhất về miễn dịch nhưng được đánh dấu bằng đồng vị