Slide Kĩ thuật chuyển gen

Nguyên lý: một đoạn gen mong muốn được khai thác, sau đó chúng được tháo tác các yếu tố cần thiết để chuyển vào hệ gen nhân của tế bào nhận. Gen chuyển có khả năng biểu hiện và di truyền ổn định ở thế hệ sau, đó là nguyên lý của công nghệ này. ADN gen chuyển được tạo ra bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn và ligase, gen từ những loại khác nhau có thể được kết hợp lại trong ống nghiệm để tạo thành cấu trúc gen chuyển. Cấu trúc gen chuyển

Trang 1

KĨ THUẬT CHUYỂN GEN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM

KHOA SINH HỌC

Cô Nguyễn Thị Hằng Kĩ Thuật Di Truyền Nhóm 6

Trang 3

NỘI DUNG

A NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ KĨ THUẬT CHUYỂN GEN

B CÁC BƯỚC TRONG KĨ THUẬT CHUYỂN GEN

C VECTOR VÀ ENZYME GIỚI HẠN SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT CHUYỂN GEN

I TẠO ADN TÁI TỔ

HỢP

II ĐƯA ADN TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO NHẬN

III KIỂM TRA SỰ SÁT NHẬP VÀ BIỂU HIỆN CỦA GEN CHUYỂN

V ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT CHUYỂN GEN

D BÀI BÁO “CHUYỂN GEN TÍCH LŨY SẮT TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG SANG CÂY DỨA NHỜ VECTOR VI KHUẨN AGROBACTERIUM”

Trang 4

I Kĩ thuật chuyển gen là gì?

A NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN TRONG

Trang 5

I KĨ THUẬT CHUYỂN GEN LÀ GÌ?

Trang 6

• Kỹ thuật chuyển gen (ghép gen) là kỹ thuật đưa 1 gen lạ vào tế bào chủ, làm cho gen

lạ tồn tại ở các plasmid hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với

bộ gen tế bào chủ nhằm tạo ra giống sinh vật mới.

Trang 7

GMO- Genetically modified

organism ( Sinh vật biến đổi gen )

Các sinh vật có gen bị biến đổi

hoặc tiếp nhận những gen mới

từ các sinh vật khác nhờ tác

động của con người.

GMF- Genetically modified food ( Thực phẩm biến đổi gen ) Thực phẩm có nguồn gốc một phần hoặc toàn bộ từ sinh vật biến đổi

gen.

GMO và GMF là gì??

Trang 8

Một số sản phẩm biến đổi gen tiêu biểu

Trang 9

2 Quy trình

Kĩ thuật chuyển gen gồm những bước cơ bản sau:

1 Tạo ADN tái tổ hợp

2 Đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận

3 Kiểm tra sự sát nhập của gen và biểu hiện của gen

*Quy trình của kĩ thuật chuyển gen giống với tạo dòng nhưng có mục đích khác nhau Kĩ thuật chuyển gen nhằm tạo ra giống sinh vật mới.

Trang 10

3 Nguyên lí

Một đoạn gen mong muốn được khai thác, sau đó chúng được thao tác các yếu tố cần thiết để chuyển vào

hệ gen nhân của tế bào nhận Gen chuyển có khả năng biểu hiện và di truyền ổn định ở thế hệ sau.

Trang 11

II GEN CHUYỂN

Trang 12

Gen chuyển là các gen mã hóa tính trạng mong muốn được tách chiết từ các sinh vật khác như động vật,

thực vật, vi sinh vật chúng mã hóa các tính trạng số lượng, chất lượng (như sản lượng sữa, thịt), hay mã

hóa một số thành phần bổ sung.

Trang 13

Giống cà chua Flavr Savr với một gen bất hoạt làm cho cây không

sản xuất polygalacturonaza, loại enzyme kích hoạt quá trình thối của quả cà chua

Đu đủ có gen kháng Virus gây bệnh đốm vòng.

Trang 14

Cây cải dầu được chuyển gen có khả năng chống lại một số loại thuốc diệt cỏ nhất định

Đậu tương được chuyển gen làm tăng sức đề kháng với côn

trùng và nấm, làm phong phú thêm các loại vitamin, hàm lượng

chất béo và protein

Trang 15

Cấu trúc khác cần gắn

Các marker chọn lọc:

- Chỉ thị chọn lọc (gen mã hóa một protein khư đ c của hóa chất bổ sung trong môi trương nuôi cấy, ô sẽ bảo vệ ADN

ngoại lai khỏi nhân tố chọn lọc mà thông thường sẽ tiêu diệt hoặc ngăn chặn sự phát triển của nó).

- Sàng lọc (gen mã hóa một protein cho một đặc điểm dễ nhận dạng để có thể xác định đoạn gen cần chuyển đã

thành công hay chưa) giúp chọn ra những tế bào đã chuyển gen thành công

Trang 16

Marker chọn lọc dương nhằm chọn lọc những tế bào đã nhận được cấu trúc gen chuyển (ở dạng tự do

hay đã được sát nhập vào bộ gen tế bào chủ) thường là các gen kháng kháng sinh

Marker chọn lọc âm thường được sử dụng: HSV-tk, dt và hprt để chọn lọc tế bào không tồn

tại gen chuyển hay 1 gen nào đó bên trong.

Trang 17

Khi nuôi cấy trong môi trường chọn lọc chứa ampicillin và tetracyline thì những mô hay tế bào chứa plasmid pBR322 sẽ

sống sót.

Trang 18

HSV tk (Virus herpes simplex virus thymidine kinase type 1)

Enzyme mã hóa HSVtk có khả năng phosphoryl hóa một

số chất tương tự nucleoside (ví dụ: ganciclovir), gây chất

ức chế sao chép DNA

Trang 19

Gen báo cáo (reporter gen) : những gen mã hóa cho các protein dễ phát hiện giúp báo cáo vai trò hoạt động của gen, được chèn vào “bên sườn” của gen chuyển Dựa vào sự biểu hiên của gen báo cáo giúp đánh giá

sự điều hòa của gen chuyển trong tế bào hay mô

Trang 20

GFP, viết tắt từ Green Fluorescent Protein, là một loại protein bao gồm 238 amino acid, được dùng

thông dụng trong sinh học và hoá sinh học Protein phát ra ánh sáng huỳnh quang màu xanh cây khi

đặt dưới ánh đèn cực tím.

Trang 21

Polylinker:

Ở cuối các cấu trúc gen chứa một số vị

trí nhận diện của các enzyme cắt giới

hạn Cho phép cấu trúc gen chèn vào

những vector.

Trang 22

ADN gen chuyển được tạo ra bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn và ligase, gen từ những loại khác nhau có thể được kết hợp lại trong ống nghiệm để tạo thành cấu trúc gen chuyển

ATG: Vị trí bắt đầu phiên mã

SIG: Trình tự dấu hiệu

AAA: (polylinker) đuôi poly A

Trang 23

II NGUYÊN LÍ SINH HỌC

Trang 24

Tổ hợp gen cần chuyển phải được chèn

chính xác vào vị trí cần thiết đồng thơi

khống chế được những tác động tiêu

cực của mô chủ.

Tổ hợp gen cần chuyển phải được chèn

chính xác vào vị trí cần thiết đồng thơi

Số lượng cá thể nhận gen chuyển phải được khuếch đại (di truyền cho thế hệ con cái) để di truyền hiệu quả gen chuyển.

Gen chuyển phải được biểu hiện trong tế bào chủ.

Gen chuyển phải vào được trong

tế bào nhận và phải diễn ra sự dung hợp giữa gen tế bào vào gen chuyển.

Gen chuyển phải vào được trong

tế bào nhận và phải diễn ra sự dung hợp giữa gen tế bào vào gen chuyển.

Trang 25

BƯỚC 1 TẠO ADN TÁI TỔ HỢP

Trang 26

1 ADN tái tổ hợp là gì?

ADN tái tổ hợp là các phân tư ADN được tạo ra từ hai hay nhiều

phân đoạn ADN xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau.

Ví dụ: Hai vector là plasmid, phage λ được cài mảnh DNA lạ để tạo ra DNA tái tổ hợp

Trang 27

Mục đích

Trang 28

* Những yêu cầu của ADN tái tổ hợp

- ADN tái tổ hợp phải đạt được những yêu cầu cần thiết của một vector chuyển gen.

- ADN tái tổ hợp phải có hoạt tính khi đưa vào tế bào chủ.

- ADN tái tổ hợp phải có những dấu hiệu dễ phát hiện và dễ quan sát sự hoạt động và biểu hiện của gen tái tổ hợp.

Trang 29

Nối ADN vào vector với sự

có mặt của enzyme ADN

ligase

Các bước tạo ADN tái tổ hợp

Trang 30

ADN chứa gen cần nghiên cứu

(ADN lạ) cũng được thu nhận từ

tế bào sinh vật được chiết tách

và làm sạch và kiểm tra theo phương pháp chiết tách ADN

ADN (vector) thường là ADN

plasmid và ADN phage Chúng

được thu nhận chủ yếu từ tế

bào vi sinh vật, được tách và làm

sạch theo phương pháp chiết

tách ADN plasmid, ADN virus

1 Chọn nguyên liệu

Trang 31

2 Gia công đoạn ADN cần chuyển với sự tham gia của enzyme giới hạn

RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: là những enzyme cắt hạn chế ở những vị trí xác định Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay ở bên trong hay cạnh trình tự nhận biết

Chúng chỉ cần ion Mg +2 và không cần năng lượng ATP

- Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử ADN và cắt ADN thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu lệch (dính)

Trang 32

3 Nối ADN vào vector với sự có mặt của

enzyme ADN ligase

Nối các đoạn ADN vào vector chuyển gen để tạo ADN tái tổ hợp Phản ứng nối được thực hiện nhờ enzyme ADN

ligase

ADN ligase – chất keo phân tử: enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh ADN bằng cách tạo cầu

nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh nhau

Gồm nối đầu bằng và nối đầu lệch.

Trang 33

Nối đầu bằng

Trang 34

Nối đầu lệch

Trang 35

BƯỚC 2 ĐƯA VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO NHẬN

Trang 36

Kỹ thuật Calcium phosphate

Chuyển gen qua liposome

Trang 37

II Đưa ADN vào tế bào nhân

1. Kỹ thuật Calcium phosphate (calcium phosphate technique)

Nguyên tắc: khả năng ẩm bào của phức hợp ADN – calcium

phosphate

Trang 38

Trang 39

Ứng dụng:

- Chuyển gen vào các tế bào xoma nuôi cấy

- Chuyển các dòng genome vào tế bào đích

- Nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của ung thư

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc

ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp

Nhược điểm: hiệu quả sát nhập và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp.

Trang 40

2 Chuyển gen qua liposome

Nguyên tắc: sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-ADN.

Chú thích hình

Trang 41

Sơ đồ Hoạt động của vector

liposome

Trang 42

Ưu điểm: gen chuyển không hợp nhất vào genome chủ; hiệu quả tốt đối với cả tế bào in vitro và in vivo; mang

được các ADN có kích thước rất lớn; độ tinh khiết cao; không gây miễn dịch

Nhược điểm: sự biểu hiện gen chuyển thường nhất thời, có thể bị ức chế bởi các thành phần của huyết thanh.

Trang 43

3 Vi tiêm

Nguyên tắc: một lượng nhỏ ADN được tiêm trực tiếp vào tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ

học dưới kính hiển vi

Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân

của trứng thụ tinh

Video:

https://www.youtube.com/watch?v=R2OVe1qx444

https://www.youtube.com/watch?v=xHvyICRM6FQ

Trang 44

3 Vi tiêm

Sự thành công đầu tiên trong nghiên cứu tạo chuột chuyển

gen bằng phương pháp vi tiêm vào tiền nhân đã được công

bố vào năm 1980 (Gordon, 1980)

Trang 45

Kính hiển vi soi ngược

Máy vi điều chỉnh

Trang 46

3 Vi tiêm

- Nạp gen vào kim tiêm

- Lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác

- Chuyển gen vào trứng tiền nhân

- Ấp và đánh giá bằng mắt trong một vài tiếng

Trang 47

Trang 48

3 Vi tiêm

Ưu điểm:

- Đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương đối cao

- Hiệu quả nhất trên động vật có vú và hiện là phương pháp chủ yếu được sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi

Trang 49

4 Biến nạp (Transformation)

Biến nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng ADN Trong biến nạp, ADN trần từ một tế bào vi khuẩn (thể cho) này được truyền sang tế bào vi khuẩn khác (thể nhận)

Nguyên tắc: Muốn đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ phải làm cho màng sinh chất tế bào nhận bị biến đổi sau đó ủ

với một tỉ lệ giữa vector tái tổ hợp với tế bào chủ đã xử lý

Trang 50

Cơ chế phân tử của quá trình biến nạp

Trang 51

3 hình thức:

1 Làm cho màng sinh chất bị biến đổi nhờ hóa biến nạp

2 Làm cho màng sinh chất bị biến đổi nhờ điện biến nạp

3 Biến nạp gen nhờ polyetylen glycol (PEP)

Trang 52

Ưu điểm:

- Tần số biến nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao

- Có thể chuyển gen vào tế bào protoplast của bất kỳ loại cây nào (lúa, ngô, đại mạch…)

Nhược điểm:

- Việc tái sinh cây protoplast còn rất khó khăn ở một số loài cây

Trang 53

5 Tải nạp (Transduction)

Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, trong đó quá trình chuyển gen và tái tổ hơp gen ở vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage)

Tiêu chuẩn virus làm vector chuyển gen:

+ Hệ gen của virus phải là ADN

+ Không gây tác hại đáng kể cho thực vật

+ Có khả năng tải được đoạn ADN gắn vào

Trang 54

5 Tải nạp (Transduction)

Gồm:

- Tải nạp chung (Genral transduction)

Ưu điểm: Virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật.

Trang 56

6 Chuyển gen nhờ vector là virus

Nguyên tắc

Virus được sử dụng để lây nhiễm vào tế bào giai đoạn sớm của phôi trước khi được chuyển ghép vào con mẹ

Trang 57

6 Chuyển gen nhờ vector là virus

Ưu điểm: Bất kỳ loại virus nào cũng có thể được sử dụng làm

vector để chuyển vật liệu di truyền vào trong tế bào

Nhược điểm: Tỉ lệ sống của các động vật chuyển gen sơ sinh rất

thấp

Nhược điểm: Tỉ lệ sống của các động vật chuyển gen sơ sinh rất thấp.

Trang 58

7 Chuyển gen bằng súng bắn gen

Nguyên tắc:

- Sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tăng tốc độ các hạt

- Sử dụng các hạt tungsten đường kính rất nhỏ hoảng 1 micromet ( có thể là các hạt kim loai nặng như vàng, bạc…) được bao bọc ADN và bắn trực tiếp vào tế bào

Trang 59

7 Chuyển gen bằng sung bắn gen

Nguyên lý hoạt động của sung bắn gen:

Sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tăng tốc độ các

hạt

Trang 60

Ưu điểm

• Thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô

• Các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao

• Cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn

• Ứng dụng đa dạng: tạo thực vật chuyển gen, tiêm chủng vaccine di truyền,

liệu pháp gen tự sát, sự điều biến miễn dịch,…

Nhược điểm

Cây chuyển gen khó tái sinh, hiệu quả thấp, đòi hỏi thiết bị đắt tiền, chi phí vật tư đắt (hạt vàng, volfram…)

Trang 61

BƯỚC 3

KIỂM TRA SỰ SÁT NHẬP VÀ BIỂU HIỆN CỦA GEN CHUYỂN

Trang 62

PCR để sàng lọc sơ bộ

Southern blot khẳng

định kết quả sàng lọc

ban đầu của PCR

Dot blot và slot blot dùng song song định lượng tương đối một loại ADN đặc trưng bằng phương

pháp phân tử và đánh dấu phóng xạ

1 Kiểm tra sự sát nhập của gen chuyển

Trang 63

Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua protein

Phát hiện sự biểu hiện gen thông qua mARN

2 Xác định sự biểu hiện của gen chuyển

Bước cuối cùng và quan trọng nhất

1)

2)

Trang 64

1 Thu nhận protein

2 Phân tích kích thước protein bằng điện di

3 Các vạch lai với kháng thể chuyên biệt (lai phân

tử)

2.2.1 Phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua protein của gen được dịch mã

Sử dụng trong trường hợp kháng thể của protein gen chuyển có sẵn, phát hiện sự biểu hiện protein có thể được tiến hành bằng phương pháp Western blot, ELISA, RIA

Trang 65

2.2.1.1 Kỹ thuật miễn dịch enzyme (ELISA)

Trang 66

a Phương pháp ELISA trực tiếp

• Khó khăn và tốn kém trong việc lựa chọn kháng thể cho phản ứng.

• Không linh hoạt trong việc lựa chọn các cơ chất gắn.

• Tín hiệu khuếch đại thu được thấp

Sư dụng một kháng thể có gắn cơ chất enzyme sẽ liên kết trực tiếp với kháng nguyên

trên bề mặt đĩa phản ứng.

Trang 67

b Phương pháp ELISA gián tiếp

Ưu điểm

• Linh hoạt trong việc sử dụng các kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất.

• Linh hoạt và dễ dàng trong việc lựa chọn kháng thể sơ cấp cho phản ứng.

• Hoạt động miễn dịch của kháng thể sơ cấp có thể phát huy tối đa vì không bị ảnh hưởng bởi cơ chất đánh dấu.

• Thời gian thực hiện phản ứng lâu hơn.

Một kháng thể thứ cấp sẽ được bổ sung và bắt cặp đặc hiệu với kháng thể sơ cấp đã bắt cặp với kháng nguyên Kháng thể thứ cấp

có gắn cơ chất sẽ phát tín hiệu khuếch đại khi xảy ra phản ứng bắt cặp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu.

Định dạng
Số trang	113
Dung lượng	27,66 MB