PHƯƠNG PHÁP ĐẾM HỒNG CẦU VÀ BẠCH CẦU BẰNG BUỒNG ĐẾM NEUBAUER THÔNG QUA KÍNH HIỂN VI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG - BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP ĐẾM HỒNG CẦU VÀ BẠCH CẦU BẰNG BUỒNG ĐẾM NEUBAUER THÔNG QUA KÍNH HIỂN VI NHĨM GVHD Khóa : Nhóm (Đề tài 5B) : Lê Cao Đăng : 2018-2019 Mục lục Lời cảm ơn I MỤC TIÊU THÍ NGHIỆM II DỤNG CỤ III CÁC PHẦN THỰC HIỆN CHÍNH IV NỘI DUNG THỰC HIỆN V SAI SỐ VI VỆ SINH VÀ THU DỌN VII BÁO CÁO KẾT QUẢ VIII TÀI LIỆU THAM KHẢO 14 Lời cảm ơn Nhóm em xin gửi lời cám ơn chân thành đến thầy Lê Cao Đăng hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để chúng em học hỏi tìm tòi suốt q trình thí nghiệm, tiếp xúc với kiến thức, lĩnh vực bổ ích đáp ứng nhu cầu lao động kĩ sau trường Bên cạnh đó, có khả nghiên cứu làm việc theo nhóm, có khả tự nghiên cứu, học tập, tiếp thu kiến thức lâu dài thích nghi nhanh chóng với mơi trường làm việc đại I MỤC TIÊU THÍ NGHIỆM -Nắm vững nguyên tắc hoạt động, cấu tạo kính hiển vi quang học Sử dụng kính hiển vi quang để quan sát thu nhận hình ảnh mơ thực vật -Hiểu nắm vững phương pháp đếm hồng cầu bạch cầu buồng đếm Neubauer Sử dụng buồng đếm Neubauer đếm số lượng hồng cầu bạch cầu đơn vị thể tích máu II DỤNG CỤ Kính hiển vi Các kính hiển vi gồm nguồn sáng thấu kính Các kính hiển vi có độ khuếch đại khác chế độ quan sát khác Nguồn ánh sáng loại ánh sáng nhìn thấy dùng để phát sáng vật cần quan sát Kính hiển vi đầy đủ gồm vật kính có tiêu cự ngắn đặt gần lam kính thị kính có chức thay đổi tia sáng cho hình ảnh khuếch đại nằm vào võng mạc Hình mơ tả cấu tạo hoạt động kính hiển vi 1-Đế kính hiển vi 4-Thị kính 7-Tụ quang 10-Chỉnh vị trí thị kính 13-Cơng tắc điện 2-Vật kính 5-Ổ quay vật kính 8-Nút chỉnh bàn trượt theo chiều ngang 11-Kẹp giữ lam kính 14-Chỉnh độ sang 3-Bàn trượt 6-Mâm kính 9-Nút chỉnh bàn trượt theo chiều dọc 12-Nút chỉnh thô 15-Nút chỉnh tinh 2.Máy chụp ảnh điện thoại di động 3.Bộ đếm hồng cầu bạch cầu: buồng đếm Neubauer, RBC pipette, WBC pipette, lamen số ▪ Buồng đếm Neubauer: Ngày nay, kỹ thuật thiết bị cho phòng thí nghiệm phát triển, phương pháp sử dụng buồng đếm phổ biến cho việc đếm số lượng tế bào giới Có nhiều loại buồng đếm: Neubauer, Smic, Thoma… Trong thí nghiệm này, buồng đếm Neubauer lựa chọn sử dụng Buồng đếm Neubauer cấu tạo từ kính mỏng, kích thước 30 × 70 𝑚𝑚2 , bề dày mm Hình 2– Buồng đếm Neubauer thương mại Trong buồng đếm, khu vực trung tâm có lưới đếm Các tế bào đếm vị trí Các buồng đếm đôi phổ biến buồng đếm đơn Loại gồm vị trí đếm riêng biệt Loại buồng Neubauer phòng thí nghiệm buồng đếm đơi Khu vực lưới đếm có kích thước × 𝑚𝑚2 Gồm ô vuông chia nhỏ, cạnh 𝑚𝑚 Hình 3- Các vạch đếm buồng đếm Neubauer Trong trường hợp đếm tế bào máu, bạch cầu (WBCs) đếm ô lớn (ơ số 1) góc Các tiểu cầu hồng cầu đếm vng trung tâm Ơ chia làm 25 ô nhỏ với bề rộng 0,2 mm; ô lại chia làm 16 nhỏ ▪ Lamen: Lamen kính hình vuông với bế rộng 22 mm Lamen đặt lên buồng đếm, bao trùm khu vực trung tâm Lamen quy định khoảng không gian cho tế bào đáy buồng đếm lamen Buồng đếm thiết kế cho khoảng cách đáy buồng đếm lamen 0,1 mm Việc lamen bị nhấc lên dung dịch bơm vào buồng đếm có khả xảy Để tránh điều này, số buồng đếm có sử dụng kẹp giữ lamen lại Nếu lamen bị nhấc lên, khoảng cách lamen đáy buồng đếm lớn 0,1 mm Điều ảnh hưởng đến độ xác phép đo ▪ Pipette: Pipette dùng để đưa lượng xác dung dịch vào buồng đếm Trong lịch sử, pipette chế tạo từ thủy tinh Ngày nay, pipette thủy tinh thay micropipette, có dung tích cực đại từ 20, 200 đến 2000 𝜇𝑙 4.Dung dịch Macarno, dung dịch Lazarus 5.Bấm đếm 6.Quả bóp cao su 7.Lanset, kim, bao tay 8.Cồn, bơng gòn, miếng gạt, khăn lau III CÁC PHẦN THỰC HIỆN CHÍNH -Phần 1: Quan sát chụp ảnh mơ thực vật chế độ × 4, × 10, × 40 -Phần 2: Đếm hồng cầu -Phần 3: Đếm bạch cầu IV NỘI DUNG THỰC HIỆN ❖ Phần 1: Quan sát mơ thực vật Dùng kính hiển vi quan sát chụp lại ảnh mô thực vật chế độ chế độ phóng đại vật kính: × 4, × 10, × 40 ❖ Phần 2: Đếm hồng cầu ▪ Dụng cụ: -Kính hiển vi -Máy chụp ảnh điện thoại di động -Bộ đếm hồng cầu bạch cầu: buồng đếm Neubauer, RBC pipette, lamen số -Dung dịch Macarno -Bấm đếm -Quả bóp cao su -Lanset, kim, bao tay -Cồn, bơng gòn, miếng gạt, khăn lau ▪ Chuẩn bị: -Cho dụng cụ cần dùng khai -Dùng miếng gạt lau buồng đếm, lamen -Gắn ống mủ vào RBC pipette -Gắn bóp cao su vào đầu lại ống mủ -Mở nắp kim lanset, cố định kim vào lanset, ấn nhẹ kim vào để lò xo lanset chế độ nén (Chú ý bước phải thực cẩn thận) Sau đậy nắp lanset lại chuyển qua thang bấm số -Lắp thị kính × 10 vào kính hiển vi, cắm dây nguồn ▪ Tiến hành: +Quan sát chụp ảnh buồng đếm Neubauer kính hiển vi: Dùng kính hiển vi, quan sát chụp ảnh buồng đếm Neubauer chế độ × 4, × 10, × 40 +Chuẩn bị dung dịch đếm hồng cầu: -Người thực đeo bao tay vào -Dùng gòn thấm cồn vệ sinh đầu ngón tay người đo, bóp nhẹ cho máu dồn lên -Đặt lanset tiếp xúc đầu ngón cái, bấm nhẹ, dùng tay nặng nhẹ để giọt máu hạt đậu -Dùng RBC pipette hút máu lên đến mức 0,5 (chú ý hút dư trả lại) -Tiếp tục với RBC pipette để hút dung dịch Macarno đến mức 101 Chú ý: khơng để có bọt khí hút máu dung dịch pha -Tháo ống mủ khỏi pipette, dùng ngón ngón trỏ bịt hai đầu pipette, lắc theo chiều dọc pipette -Gắn lại ống mủ vào pipette Chờ phút -Đặt lamen lên buồng đếm vị trí trung tâm buồng đếm Hình 4-Lamen đặt vị trí trung tâm buồng đếm -Bỏ giọt dung dịch pipette khăn -Đặt đầu pipette sát cạnh lamen, từ từ bơm dung dịch buồng đếm, dung dịch lan tỏa phần buồng đếm Trong trường hợp xuất bọt khí lamen bị bung ra, thực lại trình bơm dung dịch Hình 5- Bơm dung dịch vào buồng đếm -Nhẹ nhàng đưa buồng đếm lên kính hiển vi đọc kết +Đếm hồng cầu: Vùng đếm 1: -Đặt kính hiển vi chế độ × 4, kiểm tra xem hồng cầu có trải buồng đếm hay khơng Chụp lại ảnh -Ở chế độ × 10, chuyển đến vng trung tâm (bên có 25 vng, vng có 16 vng nhỏ) Điều chỉnh để thấy rõ nét, chụp hình lại -Dùng bấm đếm, đếm số lượng hồng cầu ô vuông, ô góc ô giữa, ô có 16 ô nhỏ -Chú ý: tế bào nằm đường biên ô vuông, đếm tế bào cạnh cạnh trái ô, HC nằm vào phía 1/2 Đếm theo hình zigzag Hình 6-Đếm số tế bào theo hình zigzag -Ghi lại số lượng tế bào ô vuông thứ Lập lại thao tác cho -Tính số lượng hồng cầu đơn vị thể tích theo cơng thức: 𝑅𝐵𝐶𝑠 4000 ( = × 200) × 𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑡ế 𝑏à𝑜 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 ô 𝑚𝑚3 80 Với 80 4000 : thể tích đếm 200: tỷ lệ dung dịch pha Vùng đếm 2: tiến hành tương tự bước vùng đếm Tính số lượng hồng cầu đơn vị thể tích vùng đếm ❖ Phần 3: Đếm bạch cầu ▪ Dụng cụ: -Kính hiển vi -Máy chụp ảnh điện thoại di động -Bộ đếm hồng cầu bạch cầu: buồng đếm Neubauer, WBC pipette, lamen số -Dung dịch Lazarus -Bấm đếm -Quả bóp cao su -Lanset, kim, bao tay -Cồn, bơng gòn, miếng gạt, khăn lau ▪ Chuẩn bị: -Dùng miếng gạt cồn lau buồng đếm -Gắn ống mủ vào WBC pipette -Gắn bóp cao su vào đầu lại ống mủ -Mở nắp kim lanset, cố định kim vào lanset, ấn nhẹ kim vào để lò xo lanset chế độ nén (Chú ý bước phải thực cẩn thận) Sau đậy nắp lanset lại chuyển qua thang bấm số ▪ Tiến hành: +Chuẩn bị dung dịch đếm bạch cầu: -Người thực đeo bao tay vào -Dùng bơng gòn thấm cồn vệ sinh đầu ngón tay người đo, bóp nhẹ cho máu dồn lên -Đặt lanset tiếp xúc đầu ngón cái, bấm nhẹ, dùng tay nặng nhẹ để giọt máu hạt đậu -Dùng WBC pipette hút máu lên đến mức 0,5 (chú ý hút dư trả lại) -Tiếp tục với WBC pipette để hút dung dịch Lazarus đến mức 11 Chú ý: không để có bọt khí hút máu dung dịch pha -Tháo ống mủ khỏi pipette, dùng ngón ngón trỏ bịt hai đầu pipette, lắc theo chiều dọc pipette -Gắn lại ống mủ vào pipette Chờ phút -Đặt lamen lên buồng đếm cho cạnh lamen trùng cạnh buồng đếm Đặt dụng cụ lên mặt bàn nằm ngang -Bỏ giọt dung dịch pipette khăn -Đặt đầu pipette sát cạnh lamen, từ từ bơm dung dịch buồng đếm, dung dịch lan tỏa phần buồng đếm Trong trường hợp xuất bọt khí lamen bị bung ra, thực lại trình bơm dung dịch -Nhẹ nhàng đưa buồng đếm lên kính hiển vi đọc kết +Đếm bạch cầu: Vùng đếm 1: -Đặt kính hiển vi chế độ × 4, kiểm tra xem bạch cầu có trải buồng đếm hay không Chụp lại ảnh -Ở chế độ × 10, điều chỉnh để thấy rõ nét, chụp lại ảnh -Bạch cầu đếm ô vng lớn (ơ số 1-hình 3), có 16 ô nhỏ Chú ý: tế bào nằm đường biên ô vuông, đếm tế bào cạnh cạnh trái ô, HC nằm vào phía 1/2 Đếm theo hình zigzag -Ghi lại số lượng tế bào ô vuông thứ Lập lại thao tác cho ô -Tính số lượng bạch cầu đơn vị thể tích theo cơng thức: 𝑊𝐵𝐶𝑠 10 = ( × 20) × 𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑡ế 𝑏à𝑜 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝟒 ô 𝑚𝑚 4 Với : thể tích ô đếm 10 20: tỷ lệ dung dịch pha Vùng đếm 2: tiến hành tương tự bước vùng đếm Tính số lượng hồng cầu đơn vị thể tích vùng đếm V SAI SỐ Sai số khoảng 20-30% chấp nhận phương pháp nguồn: sai số pipette, sai số thể tích buồng đếm, sai số tỷ lệ pha mẫu VI VỆ SINH VÀ THU DỌN - Sau tiến hành phép đo nhẹ nhàng lấy kim khỏi lanset, đóng nắp ống kim lanset -Cho ống kim, bơng gòn vào bao tay, cột chặt lại -Lau buồng đếm, lamen cồn khăn lau -Dùng nước rửa pipette bên bên ngoài; rửa ống mủ -Buồng đếm, lamen, pipette, ống mủ để thật đưa vào hộp đựng -Cho tất dụng cụ vào hộp thủy tinh Lanset đưa vào tủ -Dùng khăn cồn lau mặt bàn VII BÁO CÁO KẾT QUẢ Phần 1: Quan sát mơ thực vật Phần 2: Đếm hồng cầu Hình : Tiến trình lấy mẫu hồng cầu quan sát Hình : Buồng đếm Neubauer chế độ x4, x10, x40 Hình : Buồng đếm có tế bào hồng cầu chế độ x4 Hình 10 : Buồng đếm có tế bào hồng cầu chế độ x10 Số lượng hồng cầu đơn vị thể tích: Vùng đếm Vùng đếm Giá trị trung bình 10 RBCs/mm3 4.32 x 106 2.26 x 106 3.29 x 106 RBCs/ml 4.32 x 103 2.26 x 103 3.29 x 103 Phần 3: Đếm bạch cầu Hình 11 : Buồng đếm có tế bào bạch cầu chế độ x4 Hình 12 : Buồng đếm có tế bào hồng cầu chế độ x1 11 Số lượng bạch cầu đơn vị thể tích: Vùng đếm Vùng đếm Giá trị trung bình WBCs/mm3 6.6 x 103 7.2 x 103 6.9 x 103 WBCs/ml 6.6 7.2 6.9 Câu hỏi: Nhận xét kết số lượng hồng cầu bạch cầu đơn vị thể tích máu Kết có phù hợp cho người có sức khỏe bình thường khơng? Mẫu máu lấy nam 20 tuổi, lượng hồng cầu đếm 3.29x106 RBCs/mm3, lượng bạch cầu đếm 6900 WBCs/ Số liệu bị ảnh hưởng lớn sai số trình đo thực thí nghiệm đáng kể nguồn: sai số pipette, sai số thể tích buồng đếm, sai số tỷ lệ pha mẫu, v…v… Mặc khác, lượng hồng cầu bạch cầu trung bình đối tượng khác nhiều lí : vị trí địa lý (đồng hay vùng cao), giới tính (nam hay nữ),… Vì vậy, để đảm bảo số liệu chấp nhận được, ta cần lượng liệu lớn phân loại bệnh nhân khu vực, giới tính Từ đưa chẩn đốn xác để điều trị Giải thích cơng thức tính tỷ lệ hồng cầu bạch cầu thể tích máu - Cơng thức số lượng hồng cầu đơn vị thể tích theo cơng thức: 𝑅𝐵𝐶𝑠 4000 ( = × 200) × 𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑡ế 𝑏à𝑜 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 ô 𝑚𝑚3 80 80 Với 0.052 𝑥 0.1 𝑥 𝑥 16 = thể tích đếm 4000 200 tỷ lệ dung dịch pha - Công thức số lượng bạch cầu đơn vị thể tích theo cơng thức: 𝑊𝐵𝐶𝑠 10 ( = × 20) × 𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑡ế 𝑏à𝑜 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝟒 ô 𝑚𝑚3 4 Với 𝑥 0.1 𝑥 = thể tích đếm 10 20 tỷ lệ dung dịch pha 12 Tại vị trí đếm bạch cầu ô vuông lớn góc, tế bào hồng cầu đếm ô vuông bên ô vuông trung tâm? Đếm hồng cầu vị trí trung tâm hồng cầu có số lượng lớn nên phải đếm nhỏ vị trí trung tâm để thu gọn số lượng cần đếm Còn bạch cầu có tỉ lệ nhỏ nhiều so với hồng cầu nên ta đếm vị trí góc lớn ngồi để hạn chế sai số Giải thích ngun tắc phóng đại kính hiển vi Hình 13 : Sơ đồ tạo ảnh kính hiển vi 𝐴𝐵 → 𝐴1 𝐵1 → 𝐴2 𝐵2 Pha tương phản có ảnh hưởng đến chất lượng hình ảnh quan sát khơng ? Các đối tượng tương phản (mẫu không màu, suốt, không nhuộm) không hấp thu ánh sáng nên quan sát chi tiết Kính hiển vi tương phản pha lợi dụng ánh sáng trực tiếp ánh sáng nhiexu xạ để tăng chất lượng độ rõ mẫu suốt + Phản pha dương : hình ảnh mẫu có màu xám tối màu sáng + Phản pha âm : hình ảnh mẫu có màu sáng so với màu đen 13 VIII TÀI LIỆU THAM KHẢO Cell count with Neubauer champer, Technical note, Oscar Bastidas 2.http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=765&pid=1302&highlight= %C4%91%E1%BA%BFm+h%E1%BB%93ng+c%E1%BA%A7u#pid1302 https://www.youtube.com/watch?v=JzGW9PovzGg 14 ... tạo kính hiển vi quang học Sử dụng kính hiển vi quang để quan sát thu nhận hình ảnh mơ thực vật -Hiểu nắm vững phương pháp đếm hồng cầu bạch cầu buồng đếm Neubauer Sử dụng buồng đếm Neubauer đếm. .. chuyển qua thang bấm số -Lắp thị kính × 10 vào kính hiển vi, cắm dây nguồn ▪ Tiến hành: +Quan sát chụp ảnh buồng đếm Neubauer kính hiển vi: Dùng kính hiển vi, quan sát chụp ảnh buồng đếm Neubauer. .. vùng đếm Tính số lượng hồng cầu đơn vị thể tích vùng đếm ❖ Phần 3: Đếm bạch cầu ▪ Dụng cụ: -Kính hiển vi -Máy chụp ảnh điện thoại di động -Bộ đếm hồng cầu bạch cầu: buồng đếm Neubauer, WBC pipette,