Xạ đen; tạo lá cây Bắt ruồi; gieo hạt và tạo rễ Bông cải xanh. Kết quả thu được, đối với cây Dứa, môi trường thích hợp để nhân chồi là môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mgL; đối với cây Xạ đen, môi trường thích hợp để nhân chồi là môi trường MS có bổ sung BA 0,6 mgL và không sử dụng inositol; đối với cây Bắt ruồi, môi trường thích hợp cho việc tạo chồi là môi trường 13MS bổ sung 1mgL Kinetin; đối với Bông cải xanh môi trường gieo hạt là môi trường MS không bổ sung chất
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHCN THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ TẾ BÀO Nguyễn Thị Huế Thi*, Hồ Kim Ngân, Phùng Thị Trâm, Nguyễn Thị Minh Thương, Võ Thanh Phúc Trường Đại Học Bách Khoa- ĐHQG TPHCM TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro đối tượng Xạ đen (Ehrretia asperula), Dứa (Ananas comosus), Cây Bắt ruồi (Dionaea muscipula), Bông cải xanh ( Brassica oleracea var.italica) Tạo chồi Dứa, Xạ đen; tạo Bắt ruồi; gieo hạt tạo rễ Bông cải xanh Kết thu được, Dứa, mơi trường thích hợp để nhân chồi mơi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/L; Xạ đen, mơi trường thích hợp để nhân chồi mơi trường MS có bổ sung BA 0,6 mg/L không sử dụng inositol; Bắt ruồi, môi trường thích hợp cho việc tạo chồi mơi trường 1/3MS bổ sung 1mg/L Kinetin; Bông cải xanh môi trường gieo hạt môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, mơi trường tạo rễ môi trường MS bổ sung 1,6 mg/L IBA Từ khóa: Ehrretia asperula, Ananas comosus, Dionaea muscipula, Brassica oleracea var.italica, Chữ viết tắt: BA – 6-benzyladenine; IBA – indole-3-butyric acid; MS – Murashige Skoog (1962) MỞ ĐẦU Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro thuật ngữ mô tả phương pháp nuôi cấy phận thực vật (tế bào đơn, mơ, quan) ống nghiệm có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp muối khống, vitamin, đường chất điều hòa sinh trưởng thực vật điều kiện vô trùng Đây coi phương pháp ưu việc nay,được sử dụng để bảo quản nhân nhanh giống quý, có giá trị kinh tế cao Hiện nay, phương pháp ngày phổ biến công tác giống trồng Bằng phương pháp nuôi cấy mô, sau thời gian ngắn tạo lượng sinh khối lớn, có hệ số nhân giống cao Đặc biệt nguồn ngun liệu ni cấy bệnh sản phẩm nhân giống hoàn toàn bệnh https://tailieu.vn/doc/ch-ong-ii-cong-nghe-nuoi-cay-mo-va-te-bao-thuc-vat-nhan-giong-in-vitro-573760.html https://tailieu.vn/doc/bai-6-ung-dung-cong-nghe-nuoi-cay-mo-te-bao-1563206.html Trong nghiên cứu này, chúng tơi làm thí nghiệm đối tượng: Xạ đen (Ehrretia asperula), Dứa (Ananas comosus), Bắt ruồi (Dionaea muscipula), Bông cải xanh ( Brassica oleracea var.italica) Cây dứa (Ananas comosus): việc nghiên cứu nhân giống in vitro nhằm tạo nguồn với số lượng lớn đồng mặt di truyền, không nhiễm bệnh Đồng thời, tạo nguồn giống dứa kiểng đáp ứng cho nhu cầu chơi kiểng http://www.vjol.info/index.php/sphcm/article/viewFile/17508/15536 Cây Xạ đen (Ehrretia asperula): loại dược liệu có tác dụng phòng ngừa hỗ trợ điều trị số loại bệnh Xạ đen giúp thể nhiệt giải độc, hỗ trợ điều trị bệnh viêm nhiễm, tiểu đường, máu nhiễm mỡ, dùng giảm đau, tăng sức đề kháng thể Trong nghiên cứu gần đây, người ta phát xạ đen có hoạt chất Fanavolnoid, Quinon có tác dụng phòng chống ung thư làm tế bào ung thư hóa lỏng dễ tiêu Xạ đen có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư vòm họng, ung thư dày, ung thư phổi, ung thư dày, ung thư phổi, ung thư thực tràng nhiều bệnh ung thư khác Vì vậy, nhu cầu Xạ đen nước ta năm qua lớn , dẫn đến nguy cạn kiệt tự nhiên Việc tạo nguồn giống lớn, chất lượng cao phục vụ cho việc trồng Xạ đen làm dược liệu cần thiết TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHCN http://vnuf.edu.vn/documents/454250/1795798/2.B%C3%B9i%20V%C4%83n%20Th%E1%BA%AFng%2C%20V %C5%A9%20Quang%20Nam.pdf?fbclid=IwAR3Dx93o05W4tX6WFmmwgnQASuPJwFf6Z8PQBGBTs8QkqKDEptvsmE7kRc http://tuaf.edu.vn/khoacnsh/bai-viet/nghien-cuu-ky-thuat-nhan-giong-in-vitro-cay-xa-den-ehretia-asperula-zoll-mor13525.html http://soha.vn/xa-den-co-chua-khoi-ung-thu-khong-dung-nghe-don-thoi-hay-nghe-chuyen-gia-dong-y-ly-giai2018081523511221.htm Cây Bắt ruồi (Dionaea muscipula ): ăn thịt lâu năm chi đơn loài thuộc họ Droseracea Hầu hết ăn thịt phát triển toàn giới bắt ruồi Venus tự nhiên phát triển vùng giới hạn bờ biển phía Đơng USA (Slack, 1981) Cây bắt ruồi Venus dùng nhiều năm nguồn điều chế thuốc chống ung thư nhiều hợp chất thứ cấp dùng thuốc miễn dịch, chống co giật, chống nắng, phá thai chất ức chế synthetase chitin (Finnie Staden, 1993; Pakulski Budzianowski, 1996) Do đặc tính bẫy trùng, có ứng dụng trang trí tiềm cho mục đích dược phẩm, nhu cầu trồng lồi ln gia tăng Kỹ thuật ni cấy mơ thực vật đóng vai trò quan trọng bảo tồn vi nhân giống giống có nguy tuyệt chủng hay bờ tuyệt chủng https://www.sbc-vietnam.com/san-pham/hoa-chat-dung-cu-nuoi-cay-mo-thuc-vat/vi-nhan-giong-cay-bay-ruoivenus-bang-nuoi-cay-cho.aspx? fbclid=IwAR3WSL1u3pqIBl8BdbQa07tLehEKXhtzjzQSiBRD2Ha7dxpVsRiy8BkEaig https://www.sbc-vietnam.com/san-pham/hoa-chat-dung-cu-nuoi-cay-mo-thuc-vat/vi-nhan-giong-cay-bay-ruoivenus-bang-nuoi-cay-cho.aspx Bông cải xanh ( Brassica oleracea var.italica): cải xanh loại rau Các phận mọc mặt đất sử dụng để làm thuốc Bông cải xanh sử dụng để ngăn ngừa ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư bàng quang ung thư dày Một số người sử dụng để thúc đẩy hiệu hệ miễn dịch Vì việc nhân giống bơng cải xanh để tạo nguồn rau sạch, cung cấp chất dinh dưỡng chữa bệnh cho người ngày ý https://vi.thehealthylifestyleexpo.com/broccoli-23898 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Các mẫu thực vật Xạ đen, Dứa, Bắt ruồi, Bơng cải xanh cung cấp phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học- Đại học Bách Khoa- Đại học quốc gia Tp.HCM Hạt giống rau mầm cải xanh thí nghiệm cung cấp công ty TNHH-TM Trang Nông Chồi cải xanh ngày tuổi sử dụng để tạo rễ bất định Phương pháp TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHCN Môi trường nuôi cấy: môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) bổ sung thêm sucrose 30g, agar 6g, chất điều hòa sinh trưởng theo nghiệm thức thí nghiệm, pH môi trường điều chỉnh 5,8±0,1 trừ môi trường bắt ruồi pH 5,5±0,1 trước đem hấp khử trùng nhiệt độ 121ºC áp suất atm thời gian 20 phút Điều kiện ni cấy: thí nghiệm thực phòng thí nghiệm Sinh Học, sở Lý Thường Kiệt; quang kỳ 12 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2500±500 lux, nhiệt độ 27±3ºC, độ ẩm 75±10% Bố trí thí nghiệm : TN1: Nghiên cứu ảnh hưởng BA lên sinh trưởng khả nhân chồi giống Dứa Thí nghiệm bố trí với nghiệm thức Mỗi nghiệm thức mơi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA nồng độ 0,5mg/L inositol Theo dõi tiêu sau tuần nuôi cấy: Chiều cao chồi (cm), số chồi (chồi/mẫu), tỉ lệ mẫu tạo chồi (%), đặc điểm chồi (đánh giá cảm quan) TN2: Nghiên cứu ảnh hưởng BA lên sinh trưởng khả nhân chồi Xạ đen Thí nghiệm bố trí với nghiệm thức Mỗi nghiệm thức mơi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA nồng độ 0,2-1 mg/L không sử dụng inositol Theo dõi tiêu sau tuần nuôi cấy: Chiều cao chồi (cm), số chồi (chồi/mẫu), tỉ lệ tạo chồi (%), số lượng lá/mẫu cấy, đặc điểm chồi (đánh giá cảm quan) TN3: Nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến sinh trưởng khả tạo chồi Bắt ruồi Thí nghiệm bố trí với nghiệm thức Mỗi nghiệm thức mơi trường 1/3MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Kinetin nồng độ 0-2 mg/L inositol Theo dõi tiêu sau tuần nuôi cấy: tỷ lệ tạo (%), số mới/ mẫu cấy, đặc điểm (đánh giá cảm quan) TN4: Gieo hạt cải xanh Ở ngồi phòng cấy, hạt Bơng cải xanh lắc xà phòng khoảng 30 giây Sau đó, rửa vòi nước Khi vào tủ cấy, hạt Bơng cải xanh chuyển sang chai vơ trùng Tiếp hạt lắc với nước javel 7% + giọt tween 20 phút để làm giảm sức căng bề mặt Rửa hạt với nước cất vô trùng lặp lại q trình lần Sau tiến hành cấy hạt môi trường MS Sau tuần lấy mầm thu đem tạo rễ bất định TN5: Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến sinh trưởng khả rễ Bơng cải xanh Thí nghiệm bố trí với nghiệm thức Mỗi nghiệm thức mơi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng IBA nồng độ 1,6 mg/L inositol Theo dõi tiêu sau tuần nuôi cấy: số rễ (rễ/mẫu), chiều dài rễ (cm), tỉ lệ mẫu rễ (%), đặc điểm rễ (đánh giá cảm quan) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng BA lên hình thành chồi Dứa Mẫu Tỉ lệ tạo chồi (%) Số chồi/ mẫu cấy Chiều chồi(cm) cao Màu sắc 100 5,5 Chồi (5,5cm) màu xanh đậm 100 5,0 Chồi TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHCN (5,0cm): màu xanh đậm 100 5,5 Chồi (5,5cm): màu xanh đậm Bảng 1: Ảnh hưởng BA đến tạo chồi Dứa sau tuần nuôi cấy Thí nghiệm sử dụng BA nồng độ 0,5 mg/L để kích thích q trình hình thành chồi giống Dứa ( bảng 1) Sau tuần nuôi cấy, mẫu cấy tạo chồi Tuy nhiên có hình thành chồi mà khơng tạo chồi bất định mẫu cấy Kết thu có sai lệch q trình hủy đỉnh khơng thành cơng bước thao tác Môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA tốt cho việc nhân nhanh chồi (tỷ lệ hình thành chồi 100%)(bảng 1) Như biết Cytokinin đóng vai trò thành lập chồi quan ni cấy mơ, đồng thời kích thích chồi nách, phân chia tế bào, ức chế lão hóa lá, thành lập mơ sẹo tăng trưởng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Ngoài ra, với diện cytokinin gỡ bỏ tượng ưu phối hợp với chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin Theo Bùi Trang Việt (2002) [1], tỉ lệ auxin/cytokinin cao giúp tạo rễ, auxin/cytokinin thấp giúp tạo chồi Do đó, hầu hết thí nghiệm chúng tơi sử dụng tỉ lệ auxin/cytokinin thấp nên tái sinh chồi dễ dàng Theo kết nghiên cứu Amin (2005) [7], tái sinh chồi từ mô sẹo nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA 1,0mg/l NAA 0,1mg/l cho tỉ lệ tái sinh chồi 100%, với số lượng chồi chiều cao chồi tương ứng 18,5 chồi/mẫu 5,28cm (Alvard, 1993) [6] Trong thí nghiệm này, tỉ lệ mẫu tạo chồi cao 100%, số chồi chiều cao chồi đạt 3,8 chồi/mẫu 1,02 cm Có khác biệt nguồn vật liệu cấy ban đầu thí nghiệm khác nên thu kết khác 1a 1b 1c Hình 1: 1a-1b-1c mẫu cấy Dứa sau tuần nuôi cấy http://www1.vnua.edu.vn/tapchi/Upload/30102014-tc%20so%207(8).pdf Ảnh hưởng BA đến hình thành chồi mẫu cấy Xạ đen TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHCN Ở nghiệm thức mơi trường ni cấy có khả tạo cụm chồi khả tạo chồi mẫu 100% Tuy nhiên, bổ sung BA với nồng độ khác cho khả tạo chồi khác ( bảng 2) Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi Số chồi/mẫu cấy (%) Chiều cao chồi Màu sắc Số lượng lá/mẫu cấy (cm) 100 0,8 Xanh non 5.67 100 0,57 Xanh non 100 0,9 Xanh non 100 0,73 Xanh non Trung bình 100 2,75 0,75 Xanh non 6,17 Bảng 2: Kết sau tuần nuôi cấy xạ đen môi trường MS bổ sung 0,6 mg/L BA Thí nghiệm sử dụng BA để kích thích q trình phát sinh chồi Xạ đen sau tuần nuôi cấy kết thu (bảng 3) BA (mg/L) Tỉ lệ tạo chồi(%) Số chồi/mẫu cấy Hình thái ( màu sắc ) 0,2 100 2,00 Xanh nhạt 0,4 100 2,25 Xanh nhạt 0,6 89 2,40 Xanh nhạt 0,8 100 2,00 Xanh nhạt 1,0 100 1,93 Xanh nhạt Bảng 3: Kết sau tuần nuôi cấy xạ đen mơi trường MS có bổ sung 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/L BA Nghiệm thức bổ sung BA 0,6mg/L cho tỉ lệ tái sinh chồi 89%, số lượng chồi cao 2,4 chồi/mẫu Trong đó, nghiệm thức lại có tỉ lệ tạo chồi 100%, số chồi cao 2,25 chồi/ mẫu BA 0,4mg/L thấp 1,93 chồi/ mẫu BA 1mg/L Khi nồng độ BA tăng khả tạo chồi nhân nhanh gia tăng nồng độ BA cao hạn chế hình thành nhân nhanh chồi, nồng độ tối ưu cho việc nhân nhanh chồi với Xạ đen 0,6 mg/L BA Tuy nhiên tỷ lệ tạo chồi mẫu cấy Xạ đen bổ sung 0,6mg/L thấp nguồn vật liệu đầu thao tác cấy dẫn đến kết TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHCN 2a 2b 2c 2d Hình 2: 2a-2b-2c-2d mẫu cấy Xạ đen sau tuần nuôi cấy Tạo mầm cải xanh Mẫu cấy Tỉ lệ hạt nảy mầm Hình thái hạt nảy mầm hạt nhiễm (%) (%) hạt không nhiễm, không nảy mầm Chiều cao Màu sắc (cm) (%) 50,00 0,00 50,00 3,85 66,67 0,00 33,33 1,50 50,00 25,00 25,00 1,65 25,00 0,00 75,00 3,60 Trung bình 47,92 6,25 45,83 2,65 Tạo rễ bất định cải xanh Sau tuần nuôi cấy tạo rễ bất định, ta thu kết quả: Nghiệm thức Tỉ lệ rễ (%) 50 33,33 40 Tỉ lệ thân rễ (%) 0 16,67 33,33 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHCN Theo kết thu Amin cộng (2005) [7], chồi dứa in vitro cảm ứng tạo rễ mơi trường ½ MS với nồng độ khác chất NAA, IBA IAA Rễ hình thành tốt mơi trường MS có bổ sung 0,2mg/l IBA 0,2mg/l NAA (Alvard, 1993) [6] Cũng tương tự kết (Atique, 2003) [8], chuyển chồi dứa in vitro vào nuôi cấy môi trường rắn có bổ sung NAA IBA riêng lẻ, phối trộn NAA IBA chồi cho rễ Tuy nhiên, chồi dứa nuôi cấy môi trường có bổ sung phối trộn NAA IBA cho kết tốt chồi dứa nuôi cấy môi trường bổ sung riêng lẻ NAA IBA (Duval, 2001) Ảnh hưởng nồng độ Kinetin lên tạo chồi Bắt ruồi Nghiệm thức Tỉ lệ tạo Số /mẫu Hình thái mẫu cấy cấy Chiều dài (%) (cm) Màu sắc 100 17 0,62 Xanh non 100 0,51 Xanh non 100 11 0,61 Xanh non, đỉnh màu hồng nhạt 100 10 0,68 Xanh non Trung bình 100 11 0,605 Xanh non Bảng 5: Sự hình thành mẫu cấy bắt ruồi môi trường MS 1/3 bổ sung nồng độ 1mg/L Kinetin sau tuần nuôi cấy Mẫu cấy bổ sung Kinetin 1mg/L nhận thấy có thêm nhiều mới, trung bình 11 lá/mẫu cấy chiều dài ngắn nồng độ Kinetin cao Các thí nghiệm sơ nhân chồi tốt môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Các ảnh hưởng hàm lượng môi trường MS lên nhân chồi từ đoạn cắt chồi kiểm tra với môi trường 1/3, 1/6, 1/9 MS không bổ sung cytokinin hay auxin Nhân chồi bị ảnh hưởng lớn hàm lượng môi trường MS Nhân chồi tốt môi trường 1/3 MS (19.55 chồi/mẫu) thấp môi trường 1/9 MS Chiều dài dài môi trường 1/3 MS (dài 2.85 cm) ngắn môi trường 1/9 MS sau tuần nuôi cấy Các liệu không tương đồng với kết Beebe (1980) dùng môi trường MS cho nhân chồi từ nuôi cấy Dionaea muscipula Ellis Khác biệt có lẽ đến từ khác lồi mô nuôi cấy (chồi với lá, trưởng thành với non) sử dụng pH biết đến ảnh hưởng đến hấp thụ môi trường nhân chồi (Parliman cộng sự, 1982a), ảnh hưởng pH môi trường (3.5, 4.5, 5.5 6.5) kiểm tra môi trường 1/3 MS bổ sung 2.3 µM kinetin pH tối ưu cho việc nhân chồi kéo dài chồi pH 5.5 ức chế nghiêm trọng mơi trường có tính acid Rễ phát triển tốt pH 5.5 6.5 không phát triển pH thấp Các liệu tương đương với liệu trước Hutchinson (1984) số chồi cao môi trường pH 5.5 Parliman cộng (1982a) nuôi cấy thân rễ mẫu Dionaea muscipula Ellis môi trường pH 4.9 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHCN 4a 4b 4c 4d Hình 4: 4a-4b-4c-4d mẫu cấy Bắt ruồi KẾT LUẬN ... ruồi, Bông cải xanh cung cấp phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học- Đại học Bách Khoa- Đại học quốc gia Tp.HCM Hạt giống rau mầm bơng cải xanh thí nghiệm cung cấp công ty TNHH-TM Trang Nông Chồi cải... theo nghiệm thức thí nghiệm, pH mơi trường điều chỉnh 5,8±0,1 trừ môi trường bắt ruồi pH 5,5±0,1 trước đem hấp khử trùng nhiệt độ 121ºC áp suất atm thời gian 20 phút Điều kiện ni cấy: thí nghiệm. .. cấy: thí nghiệm thực phòng thí nghiệm Sinh Học, sở Lý Thường Kiệt; quang kỳ 12 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2500±500 lux, nhiệt độ 27±3ºC, độ ẩm 75±10% Bố trí thí nghiệm : TN1: Nghiên cứu ảnh