REPORT ON MICROPROPAGATION EXPERIMENT OF SINNINGIA SPECIOSA, CHRYSANTHEMUM SP, LILIUM SP, ARTERMISIA DRACUNCULUSREPORT ON MICROPROPAGATION EXPERIMENT OF SINNINGIA SPECIOSA, CHRYSANTHEMUM SP, LILIUM SP, ARTERMISIA DRACUNCULUSREPORT ON MICROPROPAGATION EXPERIMENT OF SINNINGIA SPECIOSA, CHRYSANTHEMUM SP, LILIUM SP, ARTERMISIA DRACUNCULUSREPORT ON MICROPROPAGATION EXPERIMENT OF SINNINGIA SPECIOSA, CHRYSANTHEMUM SP, LILIUM SP, ARTERMISIA DRACUNCULUSREPORT ON MICROPROPAGATION EXPERIMENT OF SINNINGIA SPECIOSA, CHRYSANTHEMUM SP, LILIUM SP, ARTERMISIA DRACUNCULUS
REPORT ON MICROPROPAGATION EXPERIMENT OF SINNINGIA SPECIOSA, CHRYSANTHEMUM SP, LILIUM SP, ARTERMISIA DRACUNCULUS Nguyễn Võ Minh Trung, Phạm Thanh Hiền, Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Anh Thi Trường Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh ABSTRACT: In this study, we conduct the micropropagation of different plant species, each of which has unique output requirement: adventitious shoot formation for S.Speciosa, callus formation and weight for Chrysanthenum sp, PLBs formation for Lilium sp and lateral shoot induction for Artemisia Drancunculus or Tarragon for short The environment of each species is supplemented with different concentrations of BA and NAA or 2,4D , in which one PGR is kept constant whereas the other varies The requirement for each experiment on those plants are also unique The effects of the plant growth regulator on particular types of specimen of each species are recorded To S.Speciosa, the probable best PGR concentration is BA 2.5mg/l : NAA 0.1 mg/l for the stem sample and BA 1mg/l: NAA 0.1mg/l for the leaf sample To Chrysanthenum sp, the best result is obtained at BA 2mg/l and 2,4-D 1.5mg/l in darkness To Lilium sp, 0.5mg/l of BA and 0.5mg/l of NAA gives the best PLBs formation ratio To Tarragon, The highest shoot and root is formed at the explant with no BA whereas the highest shoot induction ratio is obtained at 0.1 mg/l BA All of this demonstrate to us the importance of PGRs presence and concentration in micropropagation of plant Keyword: Sinningia Speciosa, Chrysanthemum sp, Lilium sp, Artermisia Drancunculus, Tarragon, Plant Growth Regulator, micropropagation, adventitious root, adventitious shoot, lateral shoot, PLBs Giới thiệu Tử la lan ( Sinningia Speciosa) loài thân thảo mọng nước mọc quanh năm thuộc cho Gesneriacea tìm thấy Nam Mỹ Nó gọi Gionxinia trồng rộng rãi khắp giới làm cảnh nhờ có rộng oval lụa, màu sắc sặc sỡ hoa có hình chng đặc sắc.Tuy vậy, khó có lưộng lớn giống khỏe mạnh dù dùng hạt ( tự bất thụ) hay dùng thân củ ( sức sống kém) Vì việc vi nhân giống trở thành phương pháp hữu hiệu để nhân giống rộng rãi loài ây Chi Cúc (danh pháp khoa học: Chrysanthemum sp) chi thực vật có hoa họ Cúc (Asteraceae) Chrysanthemum có nhiều cơng hữu ích cho sống người làm hoa trang trí, làm thuốc chữa bệnh, làm phong phú cho đời sống ẩm thực chí làm thuốc trừ sâu Cúc nhân giống truyền thống việc giâm cành, nhiên phương pháp lâu thay dần nhân giống ống nghiệm với sản lượng cao gấp nhiều lần Lilium sp lồi hoa thân củ có giá trị thương mại cao Lồi có khả nhân giống vơ tính cao phương pháp Việc vi nhân giống PLB giáo sư Dương Tấn Nhựt cộng nghiên cứu cho hệ số nhân giống cao, đồng thời thích hợp cho việc hình thành kiểu nghiên cứu chuyển gene cho Lilium sp Artemisia dracunculus L var sativa, hay ngải giấm hay Tarragon Pháp, loại thảo mộc bất thụ thường xanh có chiều cao feet có thân cành dựng thẳng, có màu xanh đậm, lăng mạ dài đến inch Lá Tarragon Pháp chứa 0,25 đến 1% dầu thơm, 75% methyl chavicol, nguồn gốc hương cam thảo Các loại tinh dầu sử dụng ngành công nghiệp thực phẩm nước hoa ngải giấm sử dụng tươi khơ làm gia vị quan trọng Vì đặc tính bất thụ lồi này, việc nhân giống vơ tính, đặc biệt vi nhân giống lựa chọn Việc ni cấy mơ sản xuất lồi có ưu hạn chế tổn thất điều kiện tự nhiên mầm bệnh Nghiên cứu sau thực loài thực vật để tìm nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật tối ưu mà cụ thể auxin cytokinin cho việc nhân giống phổ thông loài Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu 2.1.1 Môi trường nuôi cấy Bao gồm môi trường Murashige Skoog bổ sung thêm PGRs ứng với loài 2.1.1.1 Murashige Skoog medium Được pha từ stock đa lượng, stock vi lượng, stock sắt, stock vitamin stock inositol o Stock đa lượng MACROELEMENTS Ammonium nitrate 1650.000 mg/l Calcium chloride 332.200 mg/l Magnesium sulphate 180.690 mg/l Potassium nitrate 1900.000 mg/l Potassium phosphate monobasic 170.000 mg/l o Stock vi lượng Boric acid 6.200 mg/l Cobalt chloride hexahydrate 0.025 mg/l Copper sulphate pentahydrate 0.025 mg/l Manganese sulphate monohydrate 16.900 mg/l Molybdic acid (sodium salt) 0.213 mg/l Potassium Iodide 0.830 mg/l Zinc sulphate heptahydrate 8.600 mg/l o Stock sắt EDTA disodium salt dihydrate 37.300 mg/l Ferrous sulphate heptahydrate 27.800 mg/l o Vitamin Nicotinic acid (free acid) 0.5 mg/l Pyridoxine 0.5 mg/l Thiamine hydrochloride 0.1 mg/l Glycine mg/l o Stock Myo-Inositol (Meso-inositol) 100.000mg/l Được pha in situ theo công thức cho 1l môi trường o 50ml stock đa lượng o 1ml stock vi lượng o 5ml stock sắt o 5ml stock meso-inositol o 1ml stock vitamin 2.1.1.2 Mơi trường cho loại mẫu cấy • Với tử la lan: MS + NAA 0.1 mg/l + BA (1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) Nhóm giao làm khảo sát nồng độ BA 1mg/l • Với cúc : MS +BA 2mg/l + 2,4-D (1;1,5; 2; 2,5 mg/l) Nhóm giao làm nồng độ 1mg/l • Với Lili : MS + BA (0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mg/l) + NAA 0,5 mg/l Nhóm giao làm nồng độ 0,3 mg/l • Với ngải giấm : MS + BA (0; 0,05; 0,1; 0,15 mg/l) Nhóm giao làm nồng độ 0mg/l 2.1.1.3 Sucrose agar Sucrose cho vào sau cho khoáng MS PGRs vào Sucrose cho với hàm lượng 30 g/l Chỉnh pH NaOH 0.1M HCl 0.1M lên tới 5.8±0.02 Agar cho vào sau với hàm lượng 5.5g/l 2.1.2 Mẫu cấy Mẫu cấy cung cấp từ ống nghiệm phòng thí nghiệm cơng nghệ tế bào, Khoa Kĩ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh 2.1.3 Dụng cụ • Dao • Kéo • Kẹp • Petri • Ống nghiệm Ø30 20 • Becher 1000ml • Becher 25 ml2 • • • • • • • Ống đong 100ml Phễu nhựa Đũa Khuấy Cá từ Tủ cấy UV Đèn cồn Giếng khử trùng 2.2 Phương pháp tiến hành 2.2.1 Yêu cầu cho loại mẫu cấy 2.2.2 Chuẩn bị môi trường 200ml môi trường chuẩn bị theo công thức Đun khuấy cá từ cho tan agar phân phối vào 20 ống nghiệm cho nhóm có người ( người có ống nghiệm cho lồi cây) 2.2.3 Khử trùng mơi trường, mẫu cấy Môi trường đem khử trùng 121oC 1at 15 phút Mẫu cấy không cần khử trùng nuôi cấy vô trùng sẵn ống nghiệm 2.2.4 Thao tác cắt cấy mẫu • Khử trùng UV tủ cấy: Bật đèn UV 30 phút Sau tắt đèn để thêm phút • Bật giếng khử trùng đạt đến nhiệt độ 250oC • Khử trùng tay chuyển mơi trường petri vào tủ cấy o Mặc áo blouse, xắn tay áo, tháo đồng hồ vật dụng gây nhiễm o Thấm cồn 76o đầy miếng thấm xoa từ bàn tay lên khuỷu tay o Xịt cồn đem bao môi trường vào tủ cấy Bật đèn cồn o Khử trùng dụng cụ phút: Tiến hành lấy thao tác mẫu sau : Tử la lan : cắt mẫu lá, mẫu cuống mẫu thân Lá: chọn phần vừa lớn, cắt đơi xén viền để tạo nhiều vị trí vết thương tiếp xúc với mơi trường mẫu có kích thước 0,5x0,5 cm2 Đặt mẫu ống nghiệm cho mặt tiếp xúc môi trường vết thương tiếp xúc với môi trường mẫu cách thành ống Cuống: Cuống cắt vị trí giao giữ thân, tỉa phần với thân dính mẫu cuống đặt nằm ống nghiệm cho cách thành ống Thân : Chọn phần thân giữa, xén đầu gốc cho mẫu có chiều dài 1cm Lưu ý tránh vị trí nách để tránh sai số chồi bên mẫu thân dài cm đặt nằm ống nghiệm: cách thành ống Cúc: cắt mẫu , mẫu cuống mẫu thân Thao tác cắt tử la lan Mỗi nhóm có nửa số mẫu để ngồi sang theo điều kiện phòng, nửa nhóm để điều kiện phòng khơng chiếu sang Lili: cắt mẫu mẫu vảy Lá: chọn phần vừa lớn, cắt đôi tư, tạo nhiều vết thương cách xen viền cho mẫu có kích thước 0,5x0,5 cm2 Đặt mẫu ống nghiệm cho mặt tiếp xúc môi trường vết thương tiếp xúc với môi trường mẫu cách thành ống Vảy: Vảy róc từ gốc Chọn phần vảy non nằm lớp phía trong, cắt đơi tạo vết thương, kích thước 0,5x0,5 cm2 Đặt mẫu vảy ống nghiệm cho vết thương tiếp xúc với môi trường mẫu cách thành ống Ngải giấm: Cắt mẫu chồi ngọn, mẫu chồi bên Chồi ngọn: Tỉa hết Cắt đặt cắm thẳng vào môi trường Chồi bên: Chọn khoảng 2-3 đốt cắt, tỉa hết đặt cắm thẳng vào môi trường 2.2.5 Nuôi cấy Sau cắt cấy vào môi trường Các mẫu cấy loài ni phòng có độ ẩm 70%, cường độ chiếu sáng 4000 lux, quang chu kỳ (photoperiod) 12h /ngày Tử la lan nuôi cấy tuần, cúc nuôi cấy tuần, lili nuôi cấy tuần, ngải giấm nuôi cấy tuần KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tử la lan • • • • • Mẫu cấy tử la lan tơi có tần suất chồi bất định thấp: Đa số tạo sẹo, ống mẫu bị nhiễm nấm, ống mẫu thân có chồi bên ( tính vào figure 1) So sánh với thành viên nhóm : chị Nguyễn Thị Anh Thi có tần số tạo chồi cao nhất, cộng lại có tần số tạo chồi thấp gần tơi So sánh với nhóm khác : o Tần suất tạo chồi tỷ lệ sống sót mẫu chồi cao nhất: nhóm BA/NAA =10 o Tần suất tạo chồi tỷ lệ sống sót mẫu chồi cuống cao nhất: Nhóm BA/NAA=25 o Tần suất tạo chồi thân cao nhất: BA/NAA =25 ;Tỷ lệ sống sót mẫu chồi thân cao nhất: Nhóm BA/NAA=10 Các nguyên nhân dẫn đến sai số o Kích thước mẫu cấy khác dẫn đến độ tăng sinh khác o Tính ln chồi bên mẫu thân vào kết chung: VD: tơi cắt phần thân có mang nách Sau mẫu thân nhanh chóng đâm chồi bên sớm khoảng tuầnđã thành cụm có Việc tính ln chồi bên gây sai lệch kết yêu cầu đề tài chồi bất định o Cắt không kĩ mẫu cuống: dẫn đến việc dính tế bào thân Các tế bào hay thân có khả phát triển đồng thời nhanh mẫu cuống o Sự xơ cứng chậm phát triển mẫu do: [1] Nhiễm vi sinh vật, virus pha tiềm tàng: Mẫu nhiễm vi sinh vật khơng biểu ngồi theo thời gian, mẫu xuất triệu chứng bị xơ cứng, giảm phát chồi rễ,chậm phát triển Nhiễm vi sinh vật, nấm biểu hiện: gây chết mẫu Nhựa hóa mẫu vết cắt:cản hấp thu dinh dưỡng Các nguyên nhân gây nhiễm mẫu o Quên xắn tay áo, tháo vật dụng đeo tay o Để tay ngồi tủ cấy mà khơng xịt cồn đưa lại vào o Thao tác cấy lâu rườm rà o Ho sổ mũi tủ cấy o Nói chuyện cấy o Mẫu bị nhiễm sẵn: pha tiềm tang virus hay vi khuẩn BIỆN LUẬN Nhìn chung khơng có quy luật cho yếu tố xét với tỷ lệ BA/NAA Tỷ lệ cytokinin/auxin chuẩn để đánh giá khả tạo chồi hay rễ Theo quy ước: Với C/A1 mẫu kích thích tạo chồi Tất nhiên với loài khác chuẩn khơng xác Với tỷ lệ BA/NAA=10 ta thấy số chồi bất định mẫu cao với tỷ lệ mẫu sống sót Với tỷ lệ BA/NAA=15, thơng số có xu hướng giảm Với tỷ lệ BA/NAA=20, Tất thông số đo thấp Nguyên nhân sai số xơ cứng hóa nhiễm mẫu Với tỷ lệ BA/NAA=25, thông số đáng ý chồi từ cuống cao số lượng tỷ lệ sống sót, tiếp thông số thân mặt số lượng chồi Nguyên nhân: Do đáp ứng kích thích PGRs ngoại mơ khác loại mẫu cấy mà khác loại tế bào, cấu trúc mơ, nồng độ dinh dưỡng chất điều hòa Với mẫu lá, cấu trúc phiến mỏng khiến khả hấp thu dinh dưỡng PGRs tốt Với mẫu cuống, tăng sinh hoàn toàn phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng ngoại mô Mẫu thân với loại tế bào cấu trúc cho mạch dẫn nên cần tỷ lệ cytokinin/auxin cao cho kích thích tạo chồi Hình Tử la lan xếp với thứ tự nhóm ứng với thứ tự tăng dần nồng độ BA 3.2 Tạo sẹo từ cúc Mẫu cấy cúc đặc biệt có tần số tạo sẹo thấp lại có nhiều mẫu tạo chồi bất định Nguyên nhân mẫu đặt điều kiện sáng có chất điều hòa nội sinh cộng tác với PGRs ngoại sinh thích hợp cho việc tạo sẹo So sánh với thành viên nhóm, cộng khác để tối tỷ lệ mẫu tạo sẹo lớn Cộng để sáng báo cáo tạo sẹo không tạo chồi bất định So sánh nhóm đa số tạo sẹo tốt tối Nguyên nhân gây nhiễm: giống tử la lan BIỆN LUẬN Kích thước mẫu cấy ảnh hưởng đến khả tạo sẹo Thông thường tạo mô sẹo diễn tốt tối [2] Các mẫu cấy sáng có khối lượng tươi lớn tối có khả quang hợp phần Đồng thời tối, diệp lục tố bị phá hủy mẫu bị cháy phần Hình Cúc xếp với thứ tự nhóm ứng với thứ tự tăng dần nồng độ NAA 3.3 PLB từ cúc Mẫu cấy tơi khơng có dấu hiệu tạo PLB, khoảng mẫu vảy có tạo PLB ống bị nhiễm nấm sợi Nguyên nhân: thao tác lâu, rườm rà gây nhiễm bào tử nấm tiềm tang So sánh với cộng khác: chị Nguyễn Thị Anh Thi có số mẫu vảy cao anh Phạm Tuấn Anh tạo PLB lớn từ mẫu Cộng lại khơng có gi bật So sánh với nhóm khác: So sánh nhóm khác cho mẫu cấy vảy tạo PLB nhiều mẫu cấy Tỷ lệ BA/NAA tối ưu =1 cho tỷ lệ PLB cao mẫu BIỆN LUẬN Theo nghiên cứu Nhut et al [5], nồng độ TDZ=0.5 NAA=0.2 mg/l (tỳ lệ C/A=2.5) cho 23 PLB mẫu cấy Thí nghiệm cho thấy để tạo PLB, ta nên chọn mô nằm gần thân củ loài tạo thân củ lan, lili hay nghệ,… Hình PLB lili sau tuần ni cấy, xếp với thứ tự nhóm ứng với thứ tự tăng dần nồng độ BA 3.4 Ngải giấm Loại mẫu cấy Đỉnh sinh trưởng Nách Số chồi/số mẫu 2/2 Chiều cao chồi (cm) 6.5; Số / mẫu 7/3 1;1;1,6 ; 4;4;1,2;0,3 17;12;12 17;13 Mẫu cấy với mẫu cấy chồi mẫu nách chồi bên cho mẫu phát triển tốt chiều cao, 4/5 mẫu rễ Nguyên nhân: ngải giấm có nồng độ chất PGR nội sinh dồi Auxin từ nách hay đỉnh chồi thúc đẩy vươn cao chồi rễ cytokinin tổng hợp nhiều đỉnh rễ thúc đẩy chồi ( với tần suất thấp có cytokinin ngoại mơ) Các cộng khác có kết So sánh nhóm với : Nồng độ BA tăng số chồi tăng chiều cao chồi số mẫu tạo rễ (không ghi đây) lại giảm Sự tạo rễ chiều dài rễ 2/2 mẫu 4cm;4,5cm 2/3 mẫu 4,5cm; 0,5 cm Hình thái chồi Cao, xanh nhiều Thấp hơn, xanh , nhiều lá, phân nhiều chồi Cây ngải giấm cho dù vi nhân giống chồi đỉnh bên tuần thu kết cao hẳn thí nghiệm khác: 100 % mẫu chồi có mẫu rễ BIỆN LUẬN Theo kết trên, nồng độ cytokinin ngoại sinh có tác động đối kháng tác dụng với auxin: Ngăn ưu đỉnh, tăng chồi bên, cản rễ Nhiều tài liệu hợp thức khẳng định tác dụng [3] Nồng độ cytokinin cần cho tăng sinh chồi phụ thuộc vào loại mẫu cấy độ tuổi mẹ Mẫu cấy già, nồng độ cytokinin cần cho phát sinh hình thái nhiều Với nồng độ cytokinin q ao kích thích nhiều chồi nhỏ kéo dài, làm cho bị biến dạng làm cho chồi chứa nước [4] KẾT LUẬN Hình Ngải giấm sau tuần nuôi cấy,được xếp với thứ tự nhóm ứng với thứ tự tăng dần nồng độ BA Tỷ lệ BA/NAA 25 với nồng độ NAA 0.1 mg/l thích hợp việc tăng sinh chồi bất định tử la lan để thúc đẩy sẹo tốt cần nuôi cấy tối với nồng độ chất điều hòa tốt cho việc tạo mẫu BA 2mg/l 2,4-D 1,5 mg/l PLB tạo từ vảy lilium phát triển tối ưu tỷ lệ BA/NAA =1 với NAA 0.5 mg/l Đối với ngải giấm, muốn mẫu cấy phát triển cao khơng cần bổ sung PGR đễ kích ứng chồi bên nhiều, BA 0.1 mg/l tốt Kết chưa phải tối ưu thao tác lượng giới hạn mẫu, thời gian giới hạn, khơng có tính thống kê điều kiện ni cấy coi chuẩn LỜI CẢM ƠN Chúng xin cảm ơn thạc sĩ Võ Thanh Phúc, thầy Nguyễn Minh Thiện tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho sử dụng sở vật chất BioLab 117 B2 trường Đại học Bách Khoa TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bhojwani, S S., & Dantu, P K (2013) Micropropagation In Plant Tissue Culture: An Introductory Text (pp 245–274) Springer India https://doi.org/10.1007/978-81-322-1026-9_17 [2], [4] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên Công nghệ tế bào (pp.166, 109) Nhà xuất Đại học Quốcg ia Thành phố Hồ Chí Minh [3] Edwin F George et al Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition Volume The Background (Chapter 6) Springer [5] an Nhut, Duong & Nguyen, Trinh-Don & Nguyen, Vu & Nguyen, Thien & Thi Thu Thuy, Dang & Duy, Nguyen & Teixeira da Silva, Jaime (2006) Advanced technology in micropropagation of some important plants (pp.325-335) ... cung cấp từ ống nghiệm phòng thí nghiệm cơng nghệ tế bào, Khoa Kĩ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh 2.1.3 Dụng cụ • Dao • Kéo • Kẹp • Petri • Ống nghiệm Ø30 20 • Becher... gây sai lệch kết u cầu đề tài chồi bất định o Cắt khơng kĩ mẫu cuống: dẫn đến việc dính tế bào thân Các tế bào hay thân có khả phát triển đồng thời nhanh mẫu cuống o Sự xơ cứng chậm phát triển... https://doi.org/10.1007/978-81-322-1026-9_17 [2], [4] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên Công nghệ tế bào (pp.166, 109) Nhà xuất Đại học Quốcg ia Thành phố Hồ Chí Minh [3] Edwin F George et al