Xác định methanol, ethanol và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong rượu và huyết tương người

TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ NGÂN XÁC ĐỊNH METANOL, ETANOL VÀ CÁC SẢN PHẨM CHUYỂN HÓA CỦA CHÚNG TRONG RƢỢU VÀ HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ NGÂN XÁC ĐỊNH METANOL, ETANOL VÀ CÁC SẢN PHẨM CHUYỂN HÓA CỦA CHÚNG TRONG RƢỢU VÀ HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Hóa Phân Tích Mã số: 60440118 HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Tạ Thị Thảo TS Phạm Quang Trung Hà Nội – 2018 LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, xin đƣợc thể lòng biết ơn trân trọng tới PGS.TS Tạ Thị Thảo TS Phạm Quang Trung tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo toàn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai, đặc biệt anh chị bạn đồng nghiệp Phòng xét nghiệm – Trung tâm Chống độc giúp đỡ tạo điều kiện cho đƣợc học tập nhƣ làm nghiên cứu suốt thời gian qua Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hố Học, trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, đặc biệt thầy cô môn Hố Phân tích nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cám ơn khoa Hóa Pháp – Viện Pháp y Quốc gia giúp đỡ cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hoá K27, đặc biệt ngƣời bạn nhóm hố phân tích K27 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt q trình tơi học tập thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên, chia sẻ suốt trình thực luận văn Hà Nội, ngày tháng Học viên Nguyễn Thị Ngân năm 201 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH 10 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .12 ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan metanol etanol .3 1.1.1 Giới thiệu chung metanol etanol .3 1.1.2 Chuyển hóa metanol etanol thể, chế gây độc .5 1.1.2.1 Chuyển hóa metanol etanol thể .5 1.1.2.2 Cơ chế bệnh sinh ngộ độc metanol 1.1.3 Liều gây độc .9 1.1.4 Triệu chứng ngộ độc metanol 10 1.2 Các phƣơng pháp phân tích metanol, etanol sản phẩm chuyển hóa 11 1.2.1 Các phƣơng pháp phân tích phòng thí nghiệm .11 1.2.2 Các phƣơng pháp xác định nhanh metanol 13 1.2.3 Phƣơng pháp 1H – NMR 19 1.2.3.1 Nguyên tắc phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 19 1.2.3.2 Sơ đồ khối nguyên tắc hoạt động .20 1.2.3.3 Nguyên tắc định tính định lƣợng phổ 1H - NMR 20 1.2.3.4 Nghiên cứu loại tín hiệu dung mơi nƣớc .21 1.2.3.5 Ƣu nhƣợc điểm phƣơng pháp so với sắc ký 23 1.2.3.6 Một số nghiên cứu định lƣợng phổ 1H- NMR 23 1.3 Các kỹ thuật tủa protein xử lý mẫu sinh học 25 1.4 Tổng kết chung phần tổng quan 26 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Trang thiết bị hoá chất .28 2.1.1 Hoá chất 28 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ .31 2.2 Đối tƣợng phân tích 32 2.2.1 Chất phân tích 32 2.2.2 Mẫu nghiên cứu 32 2.2.2.1 Loại mẫu 32 2.2.2.2 Chuẩn bị mẫu phân tích .33 2.3 Phƣơng pháp phân tích 33 2.3.1 Phƣơng pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử 33 2.3.2 Phƣơng pháp thử nhanh metanol 34 2.3.3 Phƣơng pháp định lƣợng metanol, etanol sản phẩm chuyển hóa 1H – NMR 36 2.3.3.1 Quy trình đo mẫu triệt tiêu dung môi 36 2.3.3.2 Phƣơng pháp định lƣợng theo công thức 36 2.3.3.3 Phƣơng pháp định lƣợng theo đƣờng chuẩn 37 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Nghiên cứu xác định nhanh methanol phƣơng pháp (UV - Vis) 38 3.1.1 Khảo sát điều kiện để thử nhanh metanol phƣơng pháp quang 38 3.1.1.1 Lựa chọn thuốc thử tạo phức màu .38 3.1.1.2 Lựa chọn chất oxy hóa .39 3.1.1.3 Xác định bƣớc sóng hấp thụ cực đại 40 3.1.1.4 Ảnh hƣởng lƣợng dung dịch axit chromotropic 0,1% lên độ hấp thụ quang 41 3.1.1.5 Xác định thời gian oxi hóa metanol 42 3.1.1.6 Xác định thời gian tạo phức màu .42 3.1.2 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn xác định metanol phƣơng pháp đo quang phòng thí nghiệm .43 3.2 Nghiên cứu chế tạo test kit thử nhanh metanol rƣợu 45 3.2.1 Ảnh hƣởng nồng độ etanol 45 3.2.2 Ảnh hƣởng lƣợng chất oxy hóa KMnO4 – H3PO4 .46 3.2.3 Xây dựng thành phần kit thử metanol rƣợu 47 3.2.3.1 Ảnh hƣởng chất độn 47 3.2.3.2 Thành phần thuốc thử kit thử methanol rƣợu 48 3.2.4 Ảnh hƣởng thứ tự thêm thuốc thử đến độ hấp thụ quang cuả kít thử metanol rƣợu .48 3.2.5 Khảo sát thời gian ổn định màu phức sử dụng kit thử 49 3.2.6 Ảnh hƣởng hàm lƣợng fomandehit rƣợu 50 3.2.7 Quy trình khoảng hoạt động kít thử nhanh metanol rƣợu 51 3.2.6.1 Chế tạo kít thử metanol rƣợu .51 3.2.6.2 Quy trình thử metanol rƣợu 51 3.2.6.3 Khoảng hoạt động bảng màu kit thử metanol rƣợu 52 3.2.7 Đánh giá độ xác dùng kit thử metanol rƣợu 55 3.3 Xây dựng test kit huyết tƣơng .56 3.3.1 Ảnh hƣởng protein huyết tƣơng .56 3.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng lƣợng KMnO4 30g/l lƣợng protein thay đổi 57 3.3.3 Khảo sát thời gian ổn định màu phức sử dụng kit thử metanol huyết tƣơng ngƣời .58 3.3.4 Quy trình xác định khoảng hoạt động xác định metanol huyết tƣơng 59 3.3.5.1 Chế tạo kít thử metanol huyết tƣơng 59 3.3.5.2 Quy trình thử metanol huyết tƣơng 60 3.3.5.3 Khoảng tuyến tính bảng màu kit thử metanol huyết tƣơng .60 3.3.6 Đánh giá độ xác dùng kit thử metanol huyết tƣơng 62 3.4 Nghiên cứu định lƣợng etanol, metanol chất chuyển hóa 1H– NMR 64 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng dung môi 64 3.4.2 Nghiên cứu định lƣợng chất .65 3.4.2.1 Nhận dạng chất qua phổ H1 – NMR 65 3.4.3.2 Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính xác định chất 1H - NMR 67 3.4.4 Nghiên cứu định lƣợng etanol metanol chất chuyển hóa huyết tƣơng ngƣời 71 3.4.4.1 Nhận dạng chất huyết tƣơng không xử lý mẫu qua phổ H1 – NMR 71 3.4.4.2 Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu 72 3.4.4.3 Xây dựng đƣờng chuẩn chất mẫu huyết tƣơng 73 3.4.4.4 Xác nhận giá trị sử dụng phƣơng pháp định lƣợng mẫu huyết tƣơng .78 3.5 Áp dụng phân tích mẫu thực tế .79 3.5.1 Mẫu rƣợu 79 3.5.2 Mẫu huyết tƣơng ngƣời 80 KẾT LUẬN .82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC .90 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Độ hấp thụ quang phức màu thời gian oxi hóa metanol thay đổi 42 Bảng : Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang vào nồng độ metanol .44 Bảng 3: Ảnh hƣởng thể tích KMnO4 thay đổi nồng độ etanol 46 Bảng 4: Độ hấp thụ quang chất thêm chất độn etanol .47 Bảng 5: Ảnh hƣởng thứ tự thêm thuốc thử đến độ hấp thụ quang xác định 49 Bảng 6: Độ hấp thụ quang metanol mẫu rƣợu .53 Bảng 7: Độ hấp thụ quang mẫu trắng xác định metanol rƣợu 54 Bảng 8: Độ chụm phƣơng pháp xác định metanol mẫu etanol .55 Bảng 9: Đánh giá độ tái lặp xác định metanol etanol 20% 55 Bảng 10: Độ phƣơng pháp kit thử xác định nhanh methanol rƣợu 56 Bảng 11: Ảnh hƣởng thể tích KMnO4 30 g/l thay đổi lƣợng huyết tƣơng 58 Bảng 12: Độ hấp thụ quang metanol mẫu huyết tƣơng 60 Bảng 13: Độ lặp lại phƣơng pháp xác định metanol mẫu huyết tƣơng 62 Bảng 14: Đánh giá độ tái lặp xác định metanol mẫu huyết tƣơng 63 Bảng 15: Độ kit thử xác định nhanh methanol huyết tƣơng 63 Bảng 16: Độ dịch chuyển hóa học chất 67 Bảng 17: Tỉ lệ diện tích pic chất nồng độ khác 67 Bảng 18: Phƣơng trình hồi quy xác định chất 1H – NMR .68 Bảng 19: LOD LOQ chất 69 Bảng 20:Nồng độ chất tính theo công thức 69 Bảng 21: Phƣơng trình tuyến tính nồng độ thực nồng độ tính theo cơng thức 70 Bảng 22: Độ dịch chuyển hóa học tƣơng ứng chất huyết tƣơng 73 Bảng 23: Tỉ lệ diện tích pic nồng độ khác huyết tƣơng 74 Bảng 24: Phƣơng trình hồi quy xác định chất 1H – NMR huyết tƣơng 75 Bảng 25: LOD LOQ chất huyết tƣơng .75 Bảng 26:Nồng độ chất huyết tƣơng tính theo cơng thức 76 Bảng 27: Phƣơng trình tuyến tính nồng độ thực nồng độ tính theo cơng thức 77 Bảng 28: Hiệu suất thu hồi chất mẫu huyết tƣơng 78 Bảng 29: Kết phân tích mẫu rƣợu bệnh nhân 79 Bảng 30:Kết phân tích mẫu huyết tƣơng bệnh nhân .81 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Chuyển hóa metanol thể ngƣời Hình 2: Chuyển hóa etanol thể ngƣời .7 Hình 3: Quá trình nhận biết etanol metanol .13 Hình 4: Sơ đồ khối máy NMR 20 Hình 5: Sơ đồ chƣơng trình xung ZGPR 22 Hình 6: Sơ đồ chƣơng trình xung NOESYPR1D 23 Hình 1: Sự thay đổi màu sắc dung dịch thêm thuốc thử 38 Hình 2: Ảnh hƣởng chất oxy hóa tới màu dung dịch .39 Hình 3: Độ hấp thụ quang dung dịch phức màu nồng độ metanol khác 40 Hình 4: Độ hấp thụ quang phụ thuộc vào thể tích thuốc thử axit chromotropic 0,1% 41 Hình 5: Ảnh hƣởng thời gian oxi hóa đến độ hấp thụ quang phức màu 42 Hình 6:Ảnh hƣởng thời gian tới độ hấp thụ quang .43 Hình 7: Đƣờng chuẩn xác định metanol với thuốc thử axit chromotropic 0,1% 44 Hình 8: Ảnh hƣởng nồng độ etanol 45 Hình 9: Màu methanol etanol 20% thay đổi chất độn 48 Hình 10: Độ ổn định màu phức theo thời gian .50 Hình 11: Ảnh hƣởng nồng độ HCHO tới màu dung dịch 50 Hình 12: Kít thử methanol rƣợu 51 Hình 13: Quy trình xác định metanol rƣợu 52 Hình 14: Đƣờng chuẩn metanol mẫu rƣợu 20% 53 Hình 15: Bảng màu bán định lƣợng metanol rƣợu 54 Hình 16: Độ ổn định phức màu huyết tƣơng theo thời gian 59 3.4.4.4 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp định lượng mẫu huyết tương Để xác định giá trị sử dụng phƣơng pháp, Các mẫu huyết tƣơng thêm chuẩn đƣợc chuẩn bị với mức nồng độ khác Chuẩn bị mẫu: 1ml huyết tƣơng thêm chuẩn đƣợc cho vào ống phản ứng, thêm 0,3ml dung dịch axit maleic 400mg/l 0,2 ml TCA 25% Hỗn hợp đƣợc lắc xoáy, ly tâm Sau đó, 0,9 ml dung dịch phía đƣợc trộn với 0,1 ml D2O, đem đo phổ NMR Mỗi nồng độ thực thí nghiệm lần Bảng 28: Hiệu suất thu hồi chất mẫu huyết tương Nồng độ (mg/l) Metanol Etanol Axit fomic Axit axetic RSD % Hiệu suất thu hồi (%) 79 78,46 80,71 74,28 81,35 81,99 3,95 100,45±1,78 790 864,3 781,4 810,6 857,2 871,1 4,67 105,94±2,21 3950 3943 3868 3923 3961 4072 1,90 100,09±0,85 79 79,22 75,29 73,33 81,96 81,18 4,79 790 860,4 776,5 805,5 852,9 867 4,75 105,38±2,24 3950 3940 3874 3916 3907 4062 1,83 99,74±0,818 108 99,45 102,2 106,3 109,0 104,9 3,55 1080 1167 1054 1091 1147 11745 4,62 104,34±2,16 5400 5377 5277 5476 5764 5593 3,44 101,81±1,57 105 109,6 103,6 108,8 111 107,9 2,60 1025 1134 1036 1074 1126 1142 4,13 107,54±1,99 5250 5207 5171 5131 5188 5260 0,92 98,89±0,405 98,98±2.12 96,65±1,53 103,02±1,2 Kết bảng 3.28 cho thấy giá trị RSD% < 5% chứng tỏ nồng độ lặp lại tƣơng đối tốt Sử dụng phần mềm Minitab 16 so sánh sai khác 78 nồng độ chất thêm vào nồng độ trung bình lần thí nghiệm Kết cho thấy giá trị P > 0,05, có nghĩa ttest >tbảng hay nồng độ thêm vào nồng độ trung bình qua lần khác khơng có ý nghĩa thống kê Độ thu hồi chất với nồng độ khác khoảng 96 – 107% Có thể áp dụng phƣơng pháp vào định lƣợng chất 3.5 Áp dụng phân tích mẫu thực tế 3.5.1 Mẫu rượu Chuẩn bị mẫu rƣợu bệnh nhân để xác định metanol theo test thử phƣơng pháp NMR Các mẫu đƣợc thử nghiệm HCHO trƣớc thử metanol, kết cho thấy khơng phát có HCHO mẫu Các kết đƣợc so sánh với phƣơng pháp GC-FID đƣợc tiến hành Khoa hóa Pháp – Viện Pháp Y Quốc gia Bảng 29: Kết phân tích mẫu rượu bệnh nhân STT Tên bệnh nhân Test kit nhanh metanol rƣợu NMR (%) Hàm lƣợng metanol theo GC – FID Sai số phƣơng pháp Trần Thu G >0,2% 84,7% 85% -0,4% Vũ Quốc H >0,2% 81% 82,6% -2% Vƣơng Văn N >0,2% 3,8% 3,7% 2,7% Nguyễn Văn Đ KPH KPH KPH - Phùng Văn H >0,2% 82,3% 81% 1,6% Chu Văn H >0,2% 89% 88,4% 0,7% KHP: không phát Từ kết bảng 3.29 cho thấy kết phân tích sai khác kết đo hàm lƣợng metanol mẫu rƣợu phƣơng pháp NMR phƣơng 79 pháp đối chứng GC –FID chấp nhận đƣợc, nằm khoảng 0,4-2,7% Do vậy, dùng phƣơng pháp NMR để định lƣợng chất mẫu rƣợu 3.5.2 Mẫu huyết tương người Chuẩn bị mẫu huyết tƣơng bệnh nhân ngộ độc TTCĐ – BV Bạch Mai để xác định metanol theo test thử phƣơng pháp NMR Kết đƣợc so sánh với phƣơng pháp GC-FID đƣợc tiến hành Khoa hóa Pháp – Viện Pháp Y Quốc gia Kết phân tích bảng 3.30 cho thấy kết nồng độ metanol định lƣợng phƣơng pháp test thử nhanh metanol có tƣơng đồng với phƣơng pháp GC –FID Có thể dùng test thử nhanh để bán định lƣợng methanol huyết tƣơng Kết phân tích chất thiết bị NMR có chênh lệch nằm giới hạn cho phép với phƣơng pháp GC- FID Sai lệch phƣơng pháp nằm khoảng 2% - 16% Do đó, phƣơng pháp 1H – NMR hồn tốn đáng tin cậy sử dụng để xác định metanol, etanol, axit tƣơng ứng huyết tƣơng ngƣời 80 Bảng 30:Kết phân tích mẫu huyết tương bệnh nhân STT Tên bệnh nhân Nguyễn Xuân L Vƣơng Văn N Metanol (mg/l) Etanol mg/l Axit fomic mg/l Axit axetic mg/l Test UV - Vis NMR GC - FID Sai số % NMR GC - FID Sai số % NMR NMR 790 -1185 952 9690 867 11,8% 427 513 -16,8% 354 154 >1580 >LOL 2300, 2348 -2% - LOL (1,503Au) Nguyễn Văn Đ >1580 >LOL (1,891Au) 2274 1974 15,2%