Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan đuôi chồn bằng phương pháp nuôi cấy mô

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - VÕ HÀ GIANG NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG LAN ĐUÔI CHỒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thái Nguyên - 2010 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - VÕ HÀ GIANG NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG LAN ĐUÔI CHỒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số: 60.62.01 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thái Nguyên - 2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tn trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Võ Hà Giang 2 LỜI CẢM ƠN Luận văn hồn thành trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun theo chương trình đào tạo Cao học khóa 15, từ năm 2007 - 2010 Trong trình học tập thực đề tài luận văn, tác giả nhận quan tâm, giúp đỡ tập thể cán Khoa Đào tạo sau đại học, thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Nông học trường Đại học Thái Nguyên, Trường Cao đẳng nghề Công nghệ Nông lâm Phú Thọ,… này, tác giả xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Trước hết, tác giả xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngơ Xn Bình người hướng dẫn khoa học, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tác giả hồn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn tới Bộ môn Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên,… tạo điều kiện giúp đỡ tác giả trình thu thập số liệu ngoại nghiệp phục vụ đề tài luận văn Xin gửi lời cảm ơn tới Trường Cao đẳng nghề Công nghệ Nông lâm Phú Thọ tạo điều kiện thời gian, cơng việc để tác giả theo học hoàn thành luận văn Cuối cùng, tác giả xin chân thành cảm ơn quan tâm, động viên, giúp đỡ người thân gia đình bạn bè, đồng nghiệp suốt thời gian học tập thực đề tài luận văn Thái Nguyên, năm 2010 Tác giả Võ Hà Giang DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Bảng 2: Bảng 3: Bảng 4: Bảng 5: Bảng 6: Bảng 7: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Clodox đến tỷ lệ sống 42 hạt lan chồn Ảnh hưởng hóa chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống 43 hạt lan chồn Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Ca(OCl )2 đến tỷ lệ 45 sống hạt lan đuôi chồn Ảnh hưởng khử trùng phương pháp đốt cồn đến tỷ 46 lệ sống hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng môi trường đến khả nảy mầm hạt 48 lan Đuôi chồn Ảnh hưởng BAP đến khả nảy mầm hạt lan 51 Đuôi chồn Ảnh hưởng Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan 53 Đuôi chồn Bảng 8: Bảng 9: Bảng 10: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nảy mầm 54 hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng BAP đến khả nhân chồi lan Đuôi 56 chồn Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân chồi lan 57 Đuôi chồn Bảng 11: Bảng 12: Bảng 13: Ảnh hưởng BAP Kinetn đến khả nhân chồi 59 lan Đuôi chồn Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan 61 Đuôi chồn Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ lan 64 Đuôi chồn Bảng 14: Bảng 15: Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả 66 rễ lan Đuôi chồn Ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng 69 sau nuôi cấy mô DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 1: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Clodox đến tỷ lệ sống hạt lan chồn Bảng 2: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống hạt lan chồn Bảng 3: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Ca(OCl )2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Bảng 4: Ảnh hưởng khử trùng phương pháp đốt cồn đến tỷ lệ sống hạt lan Đuôi chồn Bảng 5: Ảnh hưởng môi trường đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 6: Ảnh hưởng BAP đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 7: Ảnh hưởng Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 8: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 9: Ảnh hưởng BAP đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn 10 Bảng 10: Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn 11 Bảng 11: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn 12 Bảng 12: Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 13 Bảng 13: Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 14 Bảng 14: Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 15 Bảng 15: Ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau ni cấy mơ Thí nghiệm 15: Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô Đưa giá thể giai đoạn cuối trình nhân giống Trong giai đoạn đưa từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên việc lựa chọn giá thể thích hợp cho sinh trưởng phát triển quan trọng Mỗi giá thể có đặc tnh khác Mỗi lồi trồng khác giai đoạn vườn ươm phụ có yêu cầu khác điều kiện ngoại cảnh Nhìn chung, giá thể tốt giá thể có khả giữ ẩm tốt, nước tốt có khả cung cấp dinh dưỡng cho giai đoạn đầu tiếp cận với môi trường sống tự nhiên Lan Đi Chồn sau ni cấy mơ có u cầu chặt điều kiện môi trường, độ ẩm phải lớn không bị úng, nhiệt độ môi trường khơng q cao, giá thể có khả cung cấp dinh dưỡng cho giai đoạn vườn ươm Để xác định giá thể phù hợp, tến hành thử nghiệm loại giá thể kết thu bảng sau: Bảng 15: Ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô CT Giá thể Tỷ lệ sống (%) Dớn + Than củi (1:1) Dớn 80,00 Dớn + Xơ dừa (1:1) Than củi Xơ dừa Than củi + Xơ dừa (1:1) CV(%) Sau 60 ngày Chiều cao (cm) b 1,33 93,33 a 3,27 66,67 c 53,33 Số lá/cây (lá) b 1,20 a 1,73 1,19 c 1,00 d 1,12 c 0,70 e 0,19 e 0,27 f 0,83 d 0,40 40,00 26,67 13,9 4,0 9,2 (a,b,c,d,e,f – mức phân nhóm so sánh Duncan) b a c d f e 100 90 80 70 60 Tỷ lệ (%) 50 40 30 20 10 Tỷ lệ sống (%) Giá thể Đồ thị 15a: Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống vườn ươm 3.5 1.8 1.4 1.2 1.5 0.8 Biến động số Biến động chiều cao 1.6 2.5 0.6 0.4 0.5 0.2 0 Chiều cao (cm) Giá thể S ố lá/cây (lá) Đồ thị 15b: Ảnh hưởng giá thể đến tăng trưởng chiểu cao số vườn ươm Theo bảng 15 đồ thị 15a, 15b cho thấy: Các giá thể khác cho thấy khả sống sinh trưởng khác nhau: Giá thể xơ dừa: Xơ dừa ngấm nước nhanh giữ độ ẩm lâu xơ dừa chứa nhiều muối nên trước trồng cần phải ngâm nước vài ngày sau xả trồng Qua kết công thức cho thấy: ngày phát triển tương đối tốt xơ dừa có khả nước tốt song giữ nước dễ bị nhiễm nấm bệnh, ốc sên … làm hại rễ dẫn đến không hấp thụ dinh dưỡng nên không thích hợp với hoa lan Đi Chồn nên chết nhiều sau 60 ngày, đồng thời mảnh yếu Tỷ lệ sống đạt 40,00% (ở mức “e” so sánh duncan), biến động chiều cao số thấp tương ứng 0,19 cm 0,27 cm Giá thể than củi + xơ dừa (công thức 6) có khả nhanh, rễ nhanh khơ chứa muối than nên ảnh hưởng nhiều tới rễ ảnh hưởng đến phát triển chiều cao khả Tỷ lệ sống đạt 26,67% thấp nhất, chiều cao số biến động khơng đáng kể, chí thấp, mức “d”, “e” so sánh Duncan Giá thể than củi (cơng thức 4) nước nhanh nên hệ rễ nhanh khô, cần phải tưới nước nhiều Tuy tỷ lệ sống cao công thức ( 53,33% mức “d” so sánh Duncan) biến động chiều cao số ít, mức “c” ( biến động chiều cao) mức “d” biến động số Giá thể dớn + xơ dừa ( công thức 3) cho tỷ lệ sống đạt 66,67% xếp vào kênh “c” so sánh Duncan Cây 20 ngày đầu sinh trưởng yếu, sau có tượng sinh trưởng trở lại khơng mạnh nên biến động chiều cao số không đáng kể Biến động chiều cao mức “c” với công thức 4, biến động số đạt mức “c” so sánh Duncan Giá thể công thức ( dớn + than) cơng thức (Dớn) có tỷ lệ sống cao (công thức 93,33% - mức “a” so sánh Duncan) cao thứ (công thức 80,00% - mức “b” so sánh Duncan) Cây xuất nhiều tăng trưởng chiều cao tốt Trong giá thể tốt giá thể công thức (Rong biển), cho tỷ lệ mẫu sống đạt 93,33% (ở kênh “a” so sánh duncan) Giá thể cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho con, có khả giữ nước tốt sau 60 ngày trồng giá thể cho phát triển khỏe mạnh, cứng cáp, màu xanh thẫm, xuật nhiều non Một điểm đáng lưu ý trồng giá thể phải thường xuyên ý độ ẩm, tránh tượng bị úng Như vậy, giá thể thích hợp cho lan Đuôi Chồn giai đoạn vườn ươm giá thể Dớn ( rong biển) Dớn có giá trị chúng có cấu trúc dạng sợi, dài, dù dạng khô hay tươi Các sợi rong biển dù khô hay tươi bền, chắc, khó bị phân hủy nên q trình trồng bị thay chất trồng khác nhờ vào cấu trúc phenolic bám thành tế bào Dớn có khả giữ nước lớn gấp 20 lần trọng lượng khô chúng Dớn có khả + hấp thu nước thải caton H giúp điều hòa acid môi trường đồng thời tạo khả diệt khuẩn tự nhiên, tốt cho phát triển vùng rễ Dớn có khả trao đổi caton lớn, chúng sử dụng nhân giống trồng dạng sợi hay dạng vụn nên chúng có khả vận chuyển chất dinh dưỡng tốt Ngoài chúng có số thành phần kháng khuẩn tự nhiên giúp ức chế tăng trưởng số nấm bệnh [35] Hình ảnh 5: Cây trồng giá thể rong biển KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận: Sau tến hành thí nghiệm đề tài xin đưa số kết luận sau nhân giống hoa lan Đuôi Chồn phương pháp nuôi cấy mô sau: Phương pháp khử trùng lan Đuôi Chồn để sử dụng hạt làm mẫu cấy nhân giống in vitro có hiệu tương đối tốt phương pháp: xử lý với Clorox nồng độ 7% 10 phút, khử trùng nước H2O2 nồng độ 10% 20 phút, khử trùng Ca(OCL2) nồng độ 10% 10 phút, khử trùng phương pháp nhúng cồn đốt nhanh cho hiệu cao Môi trường phù hợp giúp cho hạt nảy mầm mơi trường: ½ MS, MS Hyponex Bổ sung Kinetn (mg/l) 0,1 + BAP (mg/l) 0,3 vào môi trường MS + 30g đường + 120 ml nước dừa + 2g pepton + 30g khoai tây + 30g cà rốt + 2g than hoạt tnh + 6g agar ( tính để pha cho lít mơi trường ni cấy), pH = 5,8 thích hợp cho trình nảy mầm hạt lan Đuôi Chồn Bổ sung Kinetn (mg/l) 0,5 + BAP (mg/l) 0,3 vào môi trường MS + 30g đường + 120 ml nước dừa + 2g pepton + 30g khoai tây + 30g cà rốt + 2g than hoạt tnh + 6g agar ( tính để pha cho lít mơi trường ni cấy), pH = 5,8 thích hợp cho trình nảy mầm hạt lan Đuôi Chồn Bổ sung NAA (mg/l) 0,5 vào môi trường MS + 30 g saccarose/lít + 120 ml nước dừa + 2g pepton + 2g than hoạt tính + 6g agar, pH = 5,8 mang lại hiệu rễ tốt giai đoạn tạo hoàn chỉnh từ lan Đuôi Chồn Giá thể hoa lan Đuôi Chồn nuôi mô tốt đồi với giai đoạn vườn ươm giá thể rong biển 5.2 Đề nghị Đưa giống hoa lan Đuôi Chồn ni cấy mơ ngồi sản xuất đồng ruộng để khảo sát sinh trưởng, phát triển suất, chất lượng hoa Khảo sát quy trình số giống hoa lan khác sản xuất như: Vanda, Đai Châu,… TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: 08 Nguyễn Công Nghiệp (1998), Trồng hoa lan, NXB trẻ TP Hồ Chí Minh Đặng Thị Thanh Hương, 2002 Nghiên cứu nhân giống hoa đồng tiền phương pháp nuôi cấy in vitro, Báo cáo thực tập tốt nghiệp, Trường đại hoc Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Xuân Linh (1998), Hoa kỹ thuật trồng hoa, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Trần Văn Bảo (1999), Kỹ thuật nuôi trồng phong lan, Nxb Trẻ Hội lan Hà Nội ( 2005) Sổ tay người trồng lan, NXB NN Hà Nội Đỗ Năng Vịnh, 2005 Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng NXB Nông Nghiệp Đỗ Năng Vịnh, 2002 CNSH trồng NXB Nông Nghiệp Vũ Văn Vụ- Nguyễn Mộng Hùng- Lê Hồng Điệp, 2006- Công nghệ sinh học NXB Giáo dục Tài liệu nước R.L.M Pierik (1978) In vitro culture of higher plants, Martinus Nijhoff Publishers 10 Arditti (1982), Orchild Biology Reviews and perspective II Cornell Univ Press, Ithaca: 1-310 11 Flamee (1978) Am Orchid Soc.Bull.47: 419-423 12 Ha Tieu De, Trieu Thong Nhat, Lo Kim Vu, 2000, gerbera fower NXB KHKT Giang To, Trung Quoc 13 Sungkumlong and chitta Ranjan Deb (2007) Effects of different factors on immature embryo culture, PLBs diffrentiaton and rapid mass miltplicaton of Coelogyne suaveolens (Lindl) Hook Indian Journal of Experimental Biology, Vol.46,pp.243-248 18 14 Street (1973), Plant tissue and cell culture, Bor Monogrvol, II Black Well Scient, Publ, London 15 Saima Anjum, Muhammad Zia and M.Fayyaz Chaudhary (2005) Investgations of different strateges for high frequency regeneration of Dendrobium malones Victory African Journal of Biotechnology Vol.5(19),pp 1738 – 1743 16 K Kalimuthu, R Senthilkumar and S Vijayakumar (2006) In vitro micropropagation of orchid, oncidium sp.(Dancing Dolls), African Journal of biotechnology Vol.6 (10),pp.1171-1174 17 Knudson (1992) Use of seed for orchid propagation in vitro Bot Gaz.73: 1-25 18 Ting-yu Chen, Jen-Tsung Chen & Wei-Chin Chang (2002) Plant regeneraton through direct shoot bud formation from leaf cultures of Paphiopedilum orchids Plant Cell,Tissue and Organ Culture 76: 11-15 19 T Dennis Thomas and Alwin Michael (2007) High- frequency plantlet regeneraton and multiple shoot inducton from cultured immature seeds of Rhynchostylis retuna Blume Plant Biotechnol Rep, 1:243-249 20 Bermard (1909).Bud diffrentiation of wild orchid Ann Sci Bot.9:1-196 21 Li-ru Chen, Jen-Tsung Chen and Wei-Chin Chang (2002) Efficient production of protocorm-like bodies and pland regeneration from flower stalk explants of the soympodial orchid epidendrum radicans In vitro Cell.Dev.Biol-Plant 38:441-445 22 Zhi-Ying Li and Li Xu (2009) In vitro propagation of white-flower mutant of Rhynchostylis gigantea (Lindl.) Ridl through immature seedderived protocorm-like bodies, Journal of Horticulture and Forestry Vol 1(6) pp 093-097 23 Niknejad Azadeh, M.A Kadir, S.B Kadzimin, N.A Abdullah (2009) In vitro plant regeneraton from protocorms-like bodies (PLBs) and callus of Phalaenopsis gigantea (Epidendroideae: Orchidaceae), The 6th National Biotechnology Congress of Iran, Milad Tower Conference Hall, Tehran-Iran 24 S P Viji, Anil sood, and K K Plaha (1984) propagation of Rhynchostylis retuna BL (orchidaceae) by direct organogenesis from segment culture, Bot Gaz 145 (2):210-214 28 MỤC LỤC CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài: 10 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………… 11 2.1 Nguồn gốc, phân loại hoa Phong lan 11 2.2 Đặc điểm sinh vật học hoa phong lan 13 2.3 Yêu cầu sinh thái hoa phong lan 14 2.4 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa phong lan Thế giới 15 2.5 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa phong lan Việt Nam 16 2.6 Một số kết nghiên cứu nhân giống hoa phong lan 17 2.7 Một số kết nghiên cứu trồng chăm sóc hoa phong lan 20 2.8 Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật 20 2.8.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 20 2.8.2 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 21 2.8.3 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 23 2.8.4 Điều kiện môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 26 2.8.5 Các công đoạn nuôi cấy mô tế bào 33 2.8.6 Nhân giống vơ tính in vitro – ưu nhược điểm phương pháp 34 2.9 Ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa 36 CHƯƠNG III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 3.1 Vật liệu nghiên cứu 38 3.2 Nội dung nghiên cứu 38 3.3 Phương pháp nghiên cứu 39 3.4 Xử lý số liệu: 47 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng tới tỷ lệ sống mẫu cấy (hạt lan Đuôi chồn) 48 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn (sau 12 tuần nuôi cấy) 54 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ số Cytokynin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn 57 4.4 Kết qủa nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi lan Đuôi Chồn 62 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả rễ lan Đuôi 38 chồn 67 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô 74 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79 5.1 Kết luận: 79 5.2 Đề nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 48 83 ... nhân giống Từ thực tế trên, việc nghiên cứu nhân giống lan Đuôi Chồn cần thiết, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan đuôi chồn phương pháp nuôi cấy mô Kết nghiên cứu. .. kết nghiên cứu nhân giống hoa phong lan Hoa phong lan nhân giống phương pháp là: phương pháp hữu tính (nhân giống hạt) phương pháp nhân giống vơ tính (nhân giống tách cây, cắm cành, nuôi mô tế... nghĩa Khoa học: - Kết nghiên cứu đưa biện pháp kỹ thuật nhân giống hoa lan Đuôi chồn phương pháp in vitro Đánh giá tác động số chất điều tiết sinh trưởng nhân giống hoa lan Đuôi chồn - Đánh giá tác