Nghiên Cứu Kỹ Thuật Nhân Giống Lan Đuôi Chồn Bằng Phương Pháp Nuôi Cấy Mô

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - VÕ HÀ GIANG NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG LAN ĐUÔI CHỒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thái Nguyên - 2010 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - VÕ HÀ GIANG NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG LAN ĐUÔI CHỒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số: 60.62.01 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thái Nguyên - 2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Võ Hà Giang LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên theo chương trình đào tạo Cao học khóa 15, từ năm 2007 - 2010 Trong trình học tập thực đề tài luận văn, tác giả nhận quan tâm, giúp đỡ tập thể cán Khoa Đào tạo sau đại học, thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Nông học trường Đại học Thái Nguyên, Trường Cao đẳng nghề Công nghệ Nông lâm Phú Thọ,… này, tác giả xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Trước hết, tác giả xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Xuân Bình người hướng dẫn khoa học, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tác giả hoàn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn tới Bộ môn Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên,… tạo điều kiện giúp đỡ tác giả trình thu thập số liệu ngoại nghiệp phục vụ đề tài luận văn Xin gửi lời cảm ơn tới Trường Cao đẳng nghề Công nghệ Nông lâm Phú Thọ tạo điều kiện thời gian, công việc để tác giả theo học hoàn thành luận văn Cuối cùng, tác giả xin chân thành cảm ơn quan tâm, động viên, giúp đỡ người thân gia đình bạn bè, đồng nghiệp suốt thời gian học tập thực đề tài luận văn Thái Nguyên, năm 2010 Tác giả Võ Hà Giang DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Bảng 2: Bảng 3: Bảng 4: Bảng 5: Bảng 6: Bảng 7: Bảng 8: Bảng 9: Bảng 10: Bảng 11: Bảng 12: Bảng 13: Bảng 14: Bảng 15: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Clodox đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Ảnh hưởng hóa chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Ca(OCl )2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Ảnh hưởng khử trùng phương pháp đốt cồn đến tỷ lệ sống hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng môi trường đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng BAP đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Ảnh hưởng BAP đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô 42 43 45 46 48 51 53 54 56 57 59 61 64 66 69 DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 1: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Clodox đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Bảng 2: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Bảng 3: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Ca(OCl )2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Bảng 4: Ảnh hưởng khử trùng phương pháp đốt cồn đến tỷ lệ sống hạt lan Đuôi chồn Bảng 5: Ảnh hưởng môi trường đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 6: Ảnh hưởng BAP đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 7: Ảnh hưởng Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 8: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Bảng 9: Ảnh hưởng BAP đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn 10 Bảng 10: Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn 11 Bảng 11: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn 12 Bảng 12: Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 13 Bảng 13: Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 14 Bảng 14: Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 15 Bảng 15: Ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ Đồ thị 1: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Clodox đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Đồ thị 2: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Đồ thị 3: Ảnh hưởng hóa chất khử trùng Ca(OCl )2 đến tỷ lệ sống hạt lan đuôi chồn Đồ thị 4: Ảnh hưởng khử trùng phương pháp đốt cồn đến tỷ lệ sống hạt lan Đuôi chồn Đồ thị 5: Ảnh hưởng môi trường đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Đồ thị 6: Ảnh hưởng BAP đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Đồ thị 7: Ảnh hưởng Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Đồ thị 8: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Đồ thị 9: Ảnh hưởng BAP đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Đồ thị 10: Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Đồ thị 11: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân chồi lan Đuôi chồn Đồ thị 12: Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Đồ thị 13: Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Đồ thị 14: Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Đồ thị 15a: Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống vườn ươm Đồ thị 15b: Ảnh hưởng giá thể đến tăng trưởng chiều cao số vườn ươm 42 43 45 46 48 51 53 54 56 57 59 61 64 66 69 69 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KỸ HIỆU BAP : 6- Benzyl amino purin CNSH : Công nghệ sinh học CT : Công thức CR : Cà rốt Đ/c : Đối chứng MS : Murashige & Skoog MT : Môi trường NAA : Naphtyl axetic axit ND : Nước dừa IAA : Indol axetic axit KT KTST : Khoai tây : Kích thích sinh trưởng TL : Tỷ lệ THT : Than hoạt tính VW : Vacin&Went ∑ : Tổng Chương I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong năm gần với sách mở rộng đầu tư mặt Nhà nước, đời sống vật chất tinh thần người dân ngày cải thiện nâng cao Song song với nhu cầu vật chất nhu cầu tinh thần đặc biệt thiếu Từ lâu người thích trồng hoa, cảnh vừa để trang trí cho đẹp, vừa để giải trí tinh thần Mỗi người có sở thích chơi hoa khác việc lựa chọn loài hoa thường tùy thuộc vào điều kiện khí hậu vùng, vẻ đẹp hoa, Hoa Phong lan loài hoa nhiều người ưa thích hoa lan có cấu trúc kiêu kỳ phức tạp, có màu sắc quyến rũ đa dạng như: đỏ, cam, vàng, tím, Hoa Phong lan chơi chậu, cắm thành lãng, đặt phòng làm việc, phòng khách, Tuy nhiên diện tích trồng hoa Phong lan nước thấp, chất lượng hoa chưa cao, chủ yếu trồng số địa phương có điều kiện như: Đà Lạt, Hà Nội, Hải Phòng, Thành Phố Hồ Chí Minh Hiện nay, số nơi sản xuất nhân số giống lan phương pháp nuôi cấy mô giá thành cao, chí phí vận chuyển lớn Mà hoa Phong lan rừng hoa năm lần chủ yếu vào mùa hè, chóng tàn, khó điều khiển hoa nở theo ý muốn Nguyên nhân việc hạn chế : Do giống chất lượng, chưa tạo giống có khả điều khiển hoa theo ý muốn, giá thành giống cao, kỹ thuật trồng chăm sóc hạn chế, đầu tư cho trồng trọt thấp Trong nguyên nhân giống yếu tố hạn chế lớn phát triển sản xuất hoa Phong lan Hoa phong lan có giá trị thương mại lớn, chủ yếu giống Đai Châu, Đuôi chồn lan hài, giá dao động, nguồn lan khai thác ngày cạn kiệt nên giá có chiều hướng tăng cao 1kg lan Đai Châu Đuôi chồn lên tới 100.000 đến 150.000 VNĐ/kg 10.000 đến 20.000 VNĐ cho Với loại lan quý lên tới 200.000 đến 300.000 VNĐ cho Những năm trước lan rừng buôn bán nhiều với giá rẻ với thu nhập trung bình người lao động mua trồng lan rừng làm cảnh Hiện mức độ khai thác cạn kiệt gây ảnh hưởng tới nguồn gen làm tăng giá Lan Đuôi Chồn (Rhynchostylis retusa [L.] Blume) loài lan rừng người chơi lan ưa chuộng hoa đẹp hương thơm Hiện khu rừng Việt Nam, loài lan rừng bị khai thác mức, có nguy cạn kiệt, hai loài lan rừng Đuôi Chồn Đai Châu khai thác nhiều cho mục đích thương mại có nguy dần tự nhiên Việc nghiên cứu phát triển loài lan nêu trên, vừa bảo tồn có khả nhân giống cho mục tiêu thương mại cần thiết Trong hai loài lan nêu trên, loài lan Đai Châu nghiên cứu nhiều có số kết nhân giống invitro Loài lan Đuôi Chồn chưa nghiên cứu nhiều, nghiên cứu nhân giống Từ thực tế trên, việc nghiên cứu nhân giống lan Đuôi Chồn cần thiết, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống lan đuôi chồn phương pháp nuôi cấy mô” Kết nghiên cứu tạo tiền đề cho triển khai sản xuất giống hoa Lan Đuôi Chồn nuôi cấy mô tỉnh Thái Nguyên 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài * Mục đích: Nhân giống lan rừng đuôi chồn chất lượng cao (cây giống khoẻ, sinh trưởng phát triển tốt, bệnh), giá thành hạ, phục vụ cho sản xuất hoa Phong Lan khu vực Thái nguyên tỉnh lân cận Tạo điều kiện cho việc tăng thu nhập cho người dân địa bàn tỉnh *Yêu cầu đề tài: - Nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng tới hiệu khử trùng mẫu cấy ( hạt hoa phong lan Đuôi chồn) - Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn Kết thu bảng 12 đồ thị 12 cho thấy: Trong tất công thức thí nghiệm rễ đạt tỷ lệ 100% Chứng tỏ rằng: chồi hoa lan Đuôi chồn rễ môi trường Mặc dù tỷ lệ rễ khác biệt công thức có không bổ sung NAA số rễ/cây, số rễ hữu hiệu/cây chiều dài rễ/cây lại có khác biệt Số rễ/cây dao động từ 6,35 rễ đến 18,2 rễ xếp theo thứ tự giảm dần so sánh duncan a, b, c, d, e Theo so sánh duncan: công thức có số lượng rễ/cây đạt cao 18,2 rễ mức “a”; công thức có số lượng rễ/cây 10,2 rễ mức “d”; công thức công thức có số rễ/cây cao công thức xếp mức “b” “c”; công thức (không bổ sung NAA) có số rễ/cây thấp 6,35 rễ xếp mức “e” Chiều dài rễ/cây dao động từ 0,82 cm đến 5,08 cm xếp theo thứ tự giảm dần vào nhóm phân mức so sánh duncan a, b, c, d, e Trong đó, công thức có số chiều dài rễ/cây đạt cao 5,08 cm, công thức (không bổ sung NAA) có chiều dài rễ/cây 1,5 rễ mức “d”, công thức có chiều dài rễ/cây 3,88 cm mức “b”, công thức có chiều dài rễ/cây 3,12 cm thấp công thức cao công thức (không bổ sung NAA) mức “c” Số rễ hữu hiệu/cây dao động từ 3,0 rễ đến 17,4 rễ xếp theo thứ tự giảm dần so sánh duncan a, b, c, d, e Theo so sánh duncan: công thức có số lượng rễ hữu hiệu/cây đạt cao 17,4 rễ mức “a”; công thức có số rễ hữu hiệu/cây thấp công thức đạt 13,5 rễ mức “b”, công thức công thức thấp công thức xếp theo thứ tự mức “c” “d” Công thức (không bổ sung NAA) có số rễ hữu hiệu/cây thấp đạt 3,0 rễ mức ‘e” Với tiêu cảm quan màu sắc rễ công thức công thức có rễ màu xanh, thích hợp cho sinh trưởng, phát triển giai đoạn vườn ươm Công công thức 2, cho rễ màu vàng, không thích hợp cho sinh trưởng, phát triển giai đoạn vườn ươm 69 Từ kết ta thấy: chồi hoa lan Đuôi chồn sinh trưởng môi trường có khả tự phát sinh rễ Tuy nhiên chất lượng rễ lại chịu chi phối nồng độ NAA Nếu nồng độ NAA thích hợp có giúp chồi phát sinh rễ tốt (số lượng, chiều dài màu sắc rễ phù hợp), nhiên nồng độ cao ức chế sinh trưởng rễ thể số rễ giảm chiều dài rễ giảm, rễ có tượng nâu hóa Như vậy: công thức số có bổ sung 0,5 mg NAA/l vào môi trường (MS + 30 gram saccarose/lít + 6.5 gram agar/lít, pH = 5.8) thích hợp để tạo hoàn chỉnh cho chồi hoa lan Đuôi chồn Thí nghiệm 13: Ảnh hưởng IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn Kết thu bảng 13 đồ thị 13 cho thấy: Trong tất công thức thí nghiệm rễ đạt tỷ lệ 100% Chứng tỏ rằng: chồi hoa lan Đuôi chồn rễ môi trường Mặc dù tỷ lệ rễ khác biệt công thức có không bổ sung IAA số rễ/cây, số rễ hữu hiệu/cây chiều dài rễ/cây lại có khác biệt Cụ thể là: Bảng 13: Ảnh hưởng IAA đến khả rễ lan Đuôi chồn (sau tháng nuôi cấy) Nồng độ Tỷ lệ Số rễ Số rễ hữu Chiều dài IAA (mg/l) rễ (%) TB/cây hiệu rễ (cm) 0,0 100 8,32e 1,95e 1,37d Vàng 0,5 100 15,65b 12,55b 3,88b Xanh đậm 1,0 100 18,1a 16,85a 5,19a Xanh đậm 2,0 100 13,2c 9,95c 3,11c Vàng xanh 2,5 100 11,1d 6,65d 0,65e Vàng 2,3 2,5 3,6 CT CV% (a, b, c, d, e – mức phân nhóm so sánh Duncan) 70 Màu sắc rễ 20 18 Số rễ TB/cây(rễ) 14 12 10 Chiều dài rễ(cm) 16 0 Công thức thí nghiệm Số rễ TB/cây Chiều dài rễ (cm) Đồ thị 13: Ảnh hưởng nồng độ IAA đến số lượng rễ TB/cây chiều dài rễ lan Đuôi chồn (sau tháng nuôi cấy) Số rễ/cây dao động từ 8,32 rễ đến 18,1 rễ xếp theo thứ tự giảm dần so sánh duncan a, b, c, d, e Theo so sánh duncan: công thức có số lượng rễ/cây đạt cao 18,1 rễ mức “a”; công thức công thức (không bổ sung IAA) có số lượng rễ/cây 11,1 rễ 8,32 rễ mức “d” “e”; công thức công thức có số rễ/cây cao công thức công thức xếp mức “b” “c” có số rễ/cây 15,65 rễ 13,2 rễ Số rễ hữu hiệu/cây dao động từ 1,95 rễ đến 16,85 rễ xếp theo thứ tự giảm dần so sánh Duncan a, b, c, d, e Theo so sánh Duncan: công thức có số lượng rễ hữu hiệu/cây đạt cao 16,85 rễ mức “a”; công thức công thức (không bổ sung IAA) có số rễ hữu hiệu/cây 6,65 rễ 1,95 rễ mức “d” “e”; công thức công thức có số rễ hữu hiệu/cây cao 71 công thức công thức 5, tthấp công thức xếp mức “b” “c” có số rễ hữu hiệu/cây 12,55 rễ 9,95 rễ Như chênh lệch công thức lớn Chiều dài rễ/cây dao động từ 0,65cm đến 5,19 cm xếp theo thứ tự giảm dần vào nhóm phân mức so sánh duncan a, b, c, d, e, f, g Trong đó, công thức có số chiều dài rễ/cây đạt cao 5,19 cm mức “a”, công thức (không bổ sung IAA) có chiều dài rễ/cây 1,37cm mức “d”, công thức có chiều dài rễ/cây 3,88 cm mức “b”, công thức có chiều dài rễ/cây ngắn công thức lớn công thức có chiều dài 3,11cm mức “c” Với tiêu cảm quan màu sắc rễ công thức 2, 3, có rễ màu xanh thích hợp cho sinh trưởng, phát triển giai đoạn vườn ươm Công thức công thức cho rễ màu vàng, không thích hợp cho sinh trưởng, phát triển giai đoạn vườn ươm Từ kết ta thấy: chồi hoa lan Đuôi chồn sinh trưởng môi trường có khả tự phát sinh rễ Tuy nhiên chất lượng rễ lại chịu chi phối nồng độ IAA Nếu nồng độ IAA thích hợp có giúp chồi phát sinh rễ tốt (số lượng, chiều dài màu sắc rễ phù hợp), nhiên không bổ sung bổ sung với nồng độ IAA cao ức chế sinh trưởng rễ thể số rễ giảm chiều dài rễ giảm, rễ có tượng nâu hóa Như vậy: công thức số có bổ sung mg/l IAA vào môi trường (MS + 30 gram saccarose/lít + 6.5 gram agar/lít, pH = 5.8) thích hợp để tạo hoàn chỉnh cho chồi hoa lan Đuôi chồn Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi Chồn Bảng 14: Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi Chồn (sau tháng nuôi cấy) CT Nồng độ Nồng độ IAA NAA (ml/l) (ml/l) 0,3 0,3 Số Số cây/bình rễ/cây 5.45 72 Số rễ Chiều hữu dài rễ hiệu (cm) 3.20 Chất lượng rễ (Màu sắc) 0.72 Xanh đậm Nồng độ Nồng độ IAA NAA (ml/l) (ml/l) 0,3 0,5 9.95 9.40 4.24 Xanh đậm 0,3 1,0 5.15 3.40 2.54 Vàng nhạt 0,5 0,3 4.35 2.85 2.54 Xanh 0,5 0,5 3.53 2.25 1.72 Xanh vàng 0,5 1,0 3.60 2.15 0.76 Vàng 1,0 0,3 5.40 3.35 2.52 Xanh vàng 1,0 0,5 9.35 8.55 4.18 Vàng 1,0 1,0 5.95 3.90 2.72 Vàng đậm Số cây/bình rễ/cây 5,5 CV% Số rễ Chiều hữu dài rễ hiệu (cm) 7,5 (Màu sắc) 7,4 12 4.5 10 Số rễ TB/cây Chất lượng rễ 3.5 2.5 Chiều dài rễ (cm) CT Số 1.5 0.5 0 Công thức thí nghiệm Số rễ TB/cây Chiều dài rễ (cm) Đồ thị 14: Ảnh hưởng phối hợp nồng độ NAA IAA đến khả rễ lan Đuôi Chồn (sau tháng nuôi cấy) Qua kết thu bảng 14 đồ thị 14 ta thấy: Sau tháng nuôi cấy lan Đuôi chồn có phối hợp nồng độ NAA IAA khả rễ công thức có khác 73 Công thức công thức cho số rễ/cây chiều dài rễ cao CT2: 9,95 rễ/cây chiều dài TB rễ 4,24cm CT2: 9,35 rễ/cây chiều dài TB rễ 4,18cm Công thức công thức có số rễ/cây chiều dài rễ thấp Tương ứng CT5: 3,53 rễ/cây, rễ dài 1,72cm, CT6: 3,6 rễ/cây chiều dài rễ đạt 0,76cm Các công thức lại có số rễ dao động từ 4,35 đến 5,95 rễ/cây chiều dài rễ từ 0,76 đến 2,54 cm Công thức có số rễ/cây tương đối cao chất lượng rễ tốt chiều dài rễ ngắn so với công thức khác Đặc biệt số rễ/cây chiều dài rễ công thức tương đương chất lượng rễ CT2 tốt công thức Điều chứng tỏ nồng độ Cytokinin ảnh hưởng đến chất lượng rễ Khi nồng độ cao chất lượng rễ giảm Vì việc lựa chọn nồng độ Cytokinin nhân giống lan Đuôi Chồn quan trọng Xác định nồng độ cho hiệu cao chất lượng tốt, tiết kiệm hóa chất Như vậy: công thức số có bổ sung phối hợp 0,3 mg/l IAA 0,5 mg/l NAA vào môi trường (MS + 30 gram saccarose/lít + 6.5 gram agar/lít, pH = 5.8) thích hợp để tạo hoàn chỉnh cho chồi hoa lan Đuôi chồn Hình ảnh 4: Cây rễ môi trường MS có bổ sung NAA nồng độ khác nhau, sau tháng nuôi cấy 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô 74 Thí nghiệm 15: Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô Đưa giá thể giai đoạn cuối trình nhân giống Trong giai đoạn đưa từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên việc lựa chọn giá thể thích hợp cho sinh trưởng phát triển quan trọng Mỗi giá thể có đặc tính khác Mỗi loài trồng khác giai đoạn vườn ươm phụ có yêu cầu khác điều kiện ngoại cảnh Nhìn chung, giá thể tốt giá thể có khả giữ ẩm tốt, thoát nước tốt có khả cung cấp dinh dưỡng cho giai đoạn đầu tiếp cận với môi trường sống tự nhiên Lan Đuôi Chồn sau nuôi cấy mô có yêu cầu chặt điều kiện môi trường, độ ẩm phải lớn không bị úng, nhiệt độ môi trường không cao, giá thể có khả cung cấp dinh dưỡng cho giai đoạn vườn ươm Để xác định giá thể phù hợp, tiến hành thử nghiệm loại giá thể kết thu bảng sau: Bảng 15: Ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô Sau 60 ngày Tỷ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Số lá/cây (lá) Dớn + Than củi (1:1) Dớn 80,00b 1,33b 1,20b 93,33a 3,27a 1,73a Dớn + Xơ dừa (1:1) Than củi 66,67c 1,19c 1,00c 53,33d 1,12c 0,70d 40,00e 0,19e 0,27f 26,67f 0,83d 0,40e CT Giá thể Xơ dừa Than củi + Xơ dừa (1:1) CV(%) 13,9 4,0 (a,b,c,d,e,f – mức phân nhóm so sánh Duncan) 75 9,2 100 90 80 70 60 Tỷ lệ (%) 50 40 30 20 10 Tỷ lệ sống (%) Giá thể Đồ thị 15a: Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống vườn ươm 3.5 1.8 2.5 1.4 1.2 1.5 0.8 Biến động số Biến động chiều cao 1.6 0.6 0.4 0.5 0.2 0 Chiều cao (cm) Giá thể Số lá/cây (lá) Đồ thị 15b: Ảnh hưởng giá thể đến tăng trưởng chiểu cao số vườn ươm 76 Theo bảng 15 đồ thị 15a, 15b cho thấy: Các giá thể khác cho thấy khả sống sinh trưởng khác nhau: Giá thể xơ dừa: Xơ dừa ngấm nước nhanh giữ độ ẩm lâu xơ dừa chứa nhiều muối nên trước trồng cần phải ngâm nước vài ngày sau xả trồng Qua kết công thức cho thấy: ngày phát triển tương đối tốt xơ dừa có khả thoát nước tốt song giữ nước dễ bị nhiễm nấm bệnh, ốc sên … làm hại rễ dẫn đến không hấp thụ dinh dưỡng nên không thích hợp với hoa lan Đuôi Chồn nên chết nhiều sau 60 ngày, đồng thời mảnh yếu Tỷ lệ sống đạt 40,00% (ở mức “e” so sánh duncan), biến động chiều cao số thấp tương ứng 0,19 cm 0,27 cm Giá thể than củi + xơ dừa (công thức 6) có khả nhanh, rễ nhanh khô chứa muối than nên ảnh hưởng nhiều tới rễ ảnh hưởng đến phát triển chiều cao khả Tỷ lệ sống đạt 26,67% thấp nhất, chiều cao số biến động không đáng kể, chí thấp, mức “d”, “e” so sánh Duncan Giá thể than củi (công thức 4) thoát nước nhanh nên hệ rễ nhanh khô, cần phải tưới nước nhiều Tuy tỷ lệ sống cao công thức ( 53,33% mức “d” so sánh Duncan) biến động chiều cao số ít, mức “c” ( biến động chiều cao) mức “d” biến động số Giá thể dớn + xơ dừa ( công thức 3) cho tỷ lệ sống đạt 66,67% xếp vào kênh “c” so sánh Duncan Cây 20 ngày đầu sinh trưởng yếu, sau có tượng sinh trưởng trở lại không mạnh nên biến động chiều cao số không đáng kể Biến động chiều cao mức “c” với công thức 4, biến động số đạt mức “c” so sánh Duncan Giá thể công thức ( dớn + than) công thức (Dớn) có tỷ lệ sống cao (công thức 93,33% - mức “a” so sánh Duncan) cao thứ (công thức 80,00% - mức “b” so sánh Duncan) Cây xuất nhiều tăng trưởng chiều cao tốt Trong giá thể tốt giá thể 77 công thức (Rong biển), cho tỷ lệ mẫu sống đạt 93,33% (ở kênh “a” so sánh duncan) Giá thể cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho con, có khả giữ thoát nước tốt sau 60 ngày trồng giá thể cho phát triển khỏe mạnh, cứng cáp, màu xanh thẫm, xuật nhiều non Một điểm đáng lưu ý trồng giá thể phải thường xuyên ý độ ẩm, tránh tượng bị úng Như vậy, giá thể thích hợp cho lan Đuôi Chồn giai đoạn vườn ươm giá thể Dớn ( rong biển) Dớn có giá trị chúng có cấu trúc dạng sợi, dài, dù dạng khô hay tươi Các sợi rong biển dù khô hay tươi bền, chắc, khó bị phân hủy nên trình trồng bị thay chất trồng khác nhờ vào cấu trúc phenolic bám thành tế bào Dớn có khả giữ nước lớn gấp 20 lần trọng lượng khô chúng Dớn có khả hấp thu nước thải cation H+ giúp điều hòa acid môi trường đồng thời tạo khả diệt khuẩn tự nhiên, tốt cho phát triển vùng rễ Dớn có khả trao đổi caton lớn, chúng sử dụng nhân giống trồng dạng sợi hay dạng vụn nên chúng có khả vận chuyển chất dinh dưỡng tốt Ngoài chúng có số thành phần kháng khuẩn tự nhiên giúp ức chế tăng trưởng số nấm bệnh [35] Hình ảnh 5: Cây trồng giá thể rong biển 78 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận: Sau tiến hành thí nghiệm đề tài xin đưa số kết luận sau nhân giống hoa lan Đuôi Chồn phương pháp nuôi cấy mô sau: Phương pháp khử trùng lan Đuôi Chồn để sử dụng hạt làm mẫu cấy nhân giống in vitro có hiệu tương đối tốt phương pháp: xử lý với Clorox nồng độ 7% 10 phút, khử trùng nước H2O2 nồng độ 10% 20 phút, khử trùng Ca(OCL2) nồng độ 10% 10 phút, khử trùng phương pháp nhúng cồn đốt nhanh cho hiệu cao Môi trường phù hợp giúp cho hạt nảy mầm môi trường: ½ MS, MS Hyponex Bổ sung Kinetin (mg/l) 0,1 + BAP (mg/l) 0,3 vào môi trường MS + 30g đường + 120 ml nước dừa + 2g pepton + 30g khoai tây + 30g cà rốt + 2g than hoạt tính + 6g agar ( tính để pha cho lít môi trường nuôi cấy), pH = 5,8 thích hợp cho trình nảy mầm hạt lan Đuôi Chồn Bổ sung Kinetin (mg/l) 0,5 + BAP (mg/l) 0,3 vào môi trường MS + 30g đường + 120 ml nước dừa + 2g pepton + 30g khoai tây + 30g cà rốt + 2g than hoạt tính + 6g agar ( tính để pha cho lít môi trường nuôi cấy), pH = 5,8 thích hợp cho trình nảy mầm hạt lan Đuôi Chồn Bổ sung NAA (mg/l) 0,5 vào môi trường MS + 30 g saccarose/lít + 120 ml nước dừa + 2g pepton + 2g than hoạt tính + 6g agar, pH = 5,8 mang lại hiệu rễ tốt giai đoạn tạo hoàn chỉnh từ lan Đuôi Chồn Giá thể hoa lan Đuôi Chồn nuôi mô tốt đồi với giai đoạn vườn ươm giá thể rong biển 5.2 Đề nghị Đưa giống hoa lan Đuôi Chồn nuôi cấy mô sản xuất đồng ruộng để khảo sát sinh trưởng, phát triển suất, chất lượng hoa Khảo sát quy trình số giống hoa lan khác sản xuất như: Vanda, Đai Châu,… 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: Nguyễn Công Nghiệp (1998), Trồng hoa lan, NXB trẻ TP Hồ Chí Minh Đặng Thị Thanh Hương, 2002 Nghiên cứu nhân giống hoa đồng tiền phương pháp nuôi cấy in vitro, Báo cáo thực tập tốt nghiệp, Trường đại hoc Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Xuân Linh (1998), Hoa kỹ thuật trồng hoa, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Trần Văn Bảo (1999), Kỹ thuật nuôi trồng phong lan, Nxb Trẻ Hội lan Hà Nội ( 2005) Sổ tay người trồng lan, NXB NN Hà Nội Đỗ Năng Vịnh, 2005 Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng NXB Nông Nghiệp Đỗ Năng Vịnh, 2002 CNSH trồng NXB Nông Nghiệp Vũ Văn Vụ- Nguyễn Mộng Hùng- Lê Hồng Điệp, 2006- Công nghệ sinh học NXB Giáo dục Tài liệu nước R.L.M Pierik (1978) In vitro culture of higher plants, Martinus Nijhoff Publishers 10 Arditti (1982), Orchild Biology Reviews and perspective II Cornell Univ Press, Ithaca: 1-310 11 Flamee (1978) Am Orchid Soc.Bull.47: 419-423 12 Ha Tieu De, Trieu Thong Nhat, Lo Kim Vu, 2000, gerbera flower NXB KHKT Giang To, Trung Quoc 13 Sungkumlong and chitta Ranjan Deb (2007) Effects of different factors on immature embryo culture, PLBs diffrentiation and rapid mass miltiplication of Coelogyne suaveolens (Lindl) Hook Indian Journal of Experimental Biology, Vol.46,pp.243-248 80 14 Street (1973), Plant tissue and cell culture, Bor Monogrvol, II Black Well Scient, Publ, London 15 Saima Anjum, Muhammad Zia and M.Fayyaz Chaudhary (2005) Investigations of different strateges for high frequency regeneration of Dendrobium malones Victory African Journal of Biotechnology Vol.5(19),pp 1738 – 1743 16 K Kalimuthu, R Senthilkumar and S Vijayakumar (2006) In vitro micropropagation of orchid, oncidium sp.(Dancing Dolls), African Journal of biotechnology Vol.6 (10),pp.1171-1174 17 Knudson (1992) Use of seed for orchid propagation in vitro Bot Gaz.73: 1-25 18 Ting-yu Chen, Jen-Tsung Chen & Wei-Chin Chang (2002) Plant regeneration through direct shoot bud formation from leaf cultures of Paphiopedilum orchids Plant Cell,Tissue and Organ Culture 76: 11-15 19 T Dennis Thomas and Alwin Michael (2007) High- frequency plantlet regeneration and multiple shoot induction from cultured immature seeds of Rhynchostylis retuna Blume Plant Biotechnol Rep, 1:243-249 20 Bermard (1909).Bud diffrentiation of wild orchid Ann Sci Bot.9:1-196 21 Li-ru Chen, Jen-Tsung Chen and Wei-Chin Chang (2002) Efficient production of protocorm-like bodies and pland regeneration from flower stalk explants of the soympodial orchid epidendrum radicans In vitro Cell.Dev.Biol-Plant 38:441-445 22 Zhi-Ying Li and Li Xu (2009) In vitro propagation of white-flower mutant of Rhynchostylis gigantea (Lindl.) Ridl through immature seedderived protocorm-like bodies, Journal of Horticulture and Forestry Vol 1(6) pp 093-097 23 Niknejad Azadeh, M.A Kadir, S.B Kadzimin, N.A Abdullah (2009) In vitro plant regeneration from protocorms-like bodies (PLBs) and callus of Phalaenopsis gigantea (Epidendroideae: Orchidaceae), The 6th National Biotechnology Congress of Iran, Milad Tower Conference Hall, Tehran-Iran 24 S P Viji, Anil sood, and K K Plaha (1984) propagation of Rhynchostylis retuna BL (orchidaceae) by direct organogenesis from segment culture, Bot Gaz 145 (2):210-214 81 MỤC LỤC CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài: 10 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………… 11 2.1 Nguồn gốc, phân loại hoa Phong lan 11 2.2 Đặc điểm sinh vật học hoa phong lan 13 2.3 Yêu cầu sinh thái hoa phong lan 14 2.4 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa phong lan Thế giới 15 2.5 Tình hình sản xuất tiêu thụ hoa phong lan Việt Nam 16 2.6 Một số kết nghiên cứu nhân giống hoa phong lan 17 2.7 Một số kết nghiên cứu trồng chăm sóc hoa phong lan 20 2.8 Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật 20 2.8.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 20 2.8.2 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 21 2.8.3 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 23 2.8.4 Điều kiện môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 26 2.8.5 Các công đoạn nuôi cấy mô tế bào 33 2.8.6 Nhân giống vô tính in vitro – ưu nhược điểm phương pháp 34 2.9 Ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống hoa 36 CHƯƠNG III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 3.1 Vật liệu nghiên cứu 38 3.2 Nội dung nghiên cứu 38 3.3 Phương pháp nghiên cứu 39 3.4 Xử lý số liệu: 47 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất khử trùng tới tỷ lệ sống mẫu cấy (hạt lan Đuôi chồn) 48 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn (sau 12 tuần nuôi cấy) 54 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ số Cytokynin đến khả nảy mầm hạt lan Đuôi chồn 57 4.4 Kết qủa nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi lan Đuôi Chồn 62 4.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả rễ lan Đuôi chồn 67 4.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến khả sinh trưởng sau nuôi cấy mô 74 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79 5.1 Kết luận: 79 5.2 Đề nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 82 83 [...]... Một số kết quả nghiên cứu về nhân giống của hoa phong lan Hoa phong lan có thể nhân giống bằng các phương pháp là: phương pháp hữu tính (nhân giống bằng hạt) và phương pháp nhân giống vô tính (nhân giống bằng tách cây, cắm cành, nuôi cây mô tế bào) Các cơ sở trồng hoa phong lan chủ yếu sử dụng giống từ nuôi cấy mô Có nhiều tác giả sử dụng biện pháp nuôi cấy mô để sản xuất giống hoa phong lan Cụ thể như... quả nghiên cứu sẽ đưa ra được một biện pháp kỹ thuật nhân giống hoa lan Đuôi chồn bằng phương pháp in vitro Đánh giá được tác động của một số chất điều tiết sinh trưởng trong nhân giống hoa lan Đuôi chồn - Đánh giá được tác động của các giá thể đến sinh trưởng của cây con trong giai đoạn vườn ươm - Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, giảng dạy và sản xuất cây hoa lan Đuôi chồn. .. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.8.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 20 Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh dưỡng (thân, lá, vỏ, củ ) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép và nuôi cấy in vitro Trong đó nuôi cấy in vitro được coi là phương pháp hữu hiệu nhất Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân...- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng tới khả năng nảy mầm của hạt lan Đuôi chồn - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân chồi lan Đuôi chồn - Xác định ảnh hưởng của NAA, IAA, phối hợp NAA và IAA tới khả năng ra rễ của chồi hoa lan Đuôi chồn - Xác định giá thể phù hợp cho sinh trưởng phát triển của hoa lan Đuôi chồn nuôi cấy mô trong... phù hợp với từng đối tượng cụ thể Môi trường MS là môi trường chủ yếu được lựa chọn trong nhân giống in vitro 2.8.4 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy a) Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật * Điều kiện vô trùng Nuôi cấy Invitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không... của nuôi cấy mô tế bào, đây là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý luận di truyền ở thực vật bậc cao 2.8.3 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật * Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào [6] Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi. .. hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật,... quy mô gia đình, trên diện tích từ vài m2 đến vài nghìn m2, cỏ biệt mới có vài hộ trồng trên 1-2 ha Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam bước đầu cũng đã có những thành công trong việc nuôi cấy mô tạo giống phong lan theo công nghệ được chuyển giao từ Thái Lan Một số địa phương khác như Sa Pa, Phú Yên bước đầu đó khảo sát và nghiên cứu phương pháp nhân giống, hoàn thiện quy trỡnh sản xuất phong lan. .. ống nghiệm Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô tính cổ điển như giâm, chiết, ghép tách dòng một kĩ thuật tiến bộ với những ưu điểm như: Tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 một năm, ví dụ trong 1 ml dung dịch môi trường có từ 100.000 - 1000.000 tế bào nuôi nêú ở điều kiện thích hợp mỗi tế bào có thể chuyển hoá tạo phôi và mọc cây, từ 1ml dung dịch môi trường có... mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy Agar: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hoá môi trường Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6- 1%, đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu O2 nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh pH môi trường: Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pH của môi