Khảo sát tần số gene IGFBP2 (insulin – like growth factor binding protein 2) trên đàn gà tàu vàng tại một trung tâm giống vật nuôi

Bên cạnh việc áp dụng các thành tựu khoa học như áp dụng quy trình chăn nuôi, việc chọn và lai tạo giống để nâng cao năng suất sinh sản, sinh trưởng và phẩm chất thịt gà, thì việc dùng

tên đề tài.txt Khảo sát tần số gene IGFBP2 (insulin – like growth factor binding protein 2) trên đàn gà Tàu Vàng tại một trung tâm giống vật nuôi

(Giảng viên hướng dẫn: ThS Lê Thị Thu Hà)

SV: Nguyễn Lê Giang Thanh

MSSV:0851110229

Lớp:08DSH2

Khoa: Môi trường & CNSH

PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

(Phiếu này được dán ở trang đầu tiên của quyển báo cáo ĐATN)

1.Họ và tên sinh viên/ nhóm sinh viên được giao đề tài (sĩ số trong nhóm 1):

Họ tên sinh viên : NGUYỄN LÊ GIANG THANH

MSSV : 0851110229 Lớp: 08DSH2

Ngành : Môi trường và công nghệ sinh học

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

2 Tên đề tài : Khảo sát tần số gene IGFBP2 (insulin – like growth factor binding

protein 2) trên đàn gà Tàu Vàng tại một trung tâm giống vật nuôi

3 Các dữ liệu ban đầu :

- Tài liệu tổng quan

- Các bài báo khoa học trong và ngoài nước

4 Các yêu cầu chủ yếu :

- Thu mẫu máu từ đàn gà Tàu Vàng tại Trung Tâm Giống

- Chiết tách DNA từ các mẫu

- Xác định gene IGFBP2 và tần số alen bằng phương pháp PCR – RFLP

5 Kết quả tối thiểu phải có:

- Tách chiết được DNA trong mẫu máu

- Sản phẩm PCR có kết quả tốt

- Enzyme cắt giới hạn cho kết quả tốt và xác định được đa hình gene IGFBP2 trên mẫu

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là Nguyễn Lê Giang Thanh, sinh viên trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.Hồ Chí Minh, Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, lớp 08DSH2 Tôi xin cam đoan tất cả các số liệu trích dẫn trong đồ án này là trung thực được lấy từ quá trình nghiên cứu thực tế tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam Tự tôi đã thực hiện tất cả các nội dung trong đồ án của mình mà không có sự sao chép đồ án nào khác dưới mọi hình thức

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, trước ban giám hiệu trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.Hồ Chí Minh về lời cam đoan của mình

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 07 năm 2012

Người viết

Nguyễn Lê Giang Thanh

LỜI CÁM ƠN

Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Ban giám hiệu trường đại học kỹ thuật công nghệ thành phố Hồ Chí Minh và ban chủ nhiệm khoa Môi trường và Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện tốt cho tôi học tập trong suốt quá trình hoạt động ở trường

Tôi xin cám ơn toàn thể các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, đặc biệt

là ThS Nguyễn Minh Nhựt đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt bốn năm ngồi ở ghế nhà trường

Tôi xin cám ơn Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp miền Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp tại Viện Đặc biệt tôi xin chân thành cám ơn ThS Lê Thị Thu Hà là người trực tiếp hướng dẫn tôi làm đồ án tốt nghiệp Trong suốt thời gian làm việc với cô, tôi đã không ngừng tiếp thu thêm những kiến thức bổ ích mà còn học tập được tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc, hiệu quả, đây là hành trang quan trọng giúp tôi có thể thực hiện tốt việc học tập và công việc sau này

Tôi cũng xin chân thành cám ơn anh Nguyễn Xuân Nam và chị Nguyễn Thị Bích Hiền và toàn thể anh chị kỹ thuật viên phòng công nghệ sinh học của Viện đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời chân thành đến cha mẹ, người đã luôn dìu dắt và hỗ trợ tôi, cũng như những người bạn luôn giúp đỡ, sát cánh bên tôi trong suốt bốn năm trên giảng đường đại học

Sinh viên

Nguyễn Lê Giang Thanh

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ vi

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

3 Mục đích nghiên cứu 2

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Các kết quả đạt được của đề tài 3

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về tình hình chăn nuôi gà trong và ngoài nước 5

1.1.1 Tình hình chăn nuôi và tiêu thụ gà trên thế giới 5

1.1.2 Tình hình chăn nuôi và tiêu thụ gà trong nước 6

1.2 Gà Tàu Vàng 8

1.3 Gene IGFBP2 và các nghiên cứu về gene IGFBP2 10

1.3.1 Giới thiệu về gene IGFBP2 10

1.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước về ảnh hưởng của gene IGFBP2 11

1.3.2.1 Ảnh hưởng lên trọng lượng cơ thể 11

1.3.2.2 Ảnh hưởng đến đặc điểm của xương 13

1.3.2.3 Ảnh hưởng đến mỡ vùng bụng 13

1.4 Các phương pháp xác định gene 14

1.4.1 Phương pháp tách chiết DNA 14

1.4.2 Phương pháp định tính DNA bằng điện di 15

1.4.3 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 17

1.4.3.1 Giới thiệu chung 17

1.4.3.2 Nguyên tắc 18

1.4.3.3 Các bước chuẩn bị và thực hiện phản ứng PCR 19

1.4.3.4 Chu kỳ phản ứng PCR 22

1.4.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 25

1.4.3.6 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 27

1.4.4 Kỹ thuật RFLP 27

1.4.4.1 Giới thiệu chung về RFLP 27

1.4.4.2 Các enzyme cắt giới hạn ( restriction enzyme, RE) 28

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 30

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 30

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 30

2.2 Vật liệu nghiên cứu 30

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 30

2.2.3 Hóa chất 30

2.2.4 Dụng cụ và thiết bị 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.3.1 Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu 33

2.3.2 Tiến hành tách chiết DNA từ mẫu máu gà được lựa chọn 34

2.3.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di 35

2.3.4 Tiến hành PCR – RFLP để xác định và khảo sát tần số gene IGFBP2 36

2.3.4.1 Tiến hành PCR phát hiện sự xuất hiện của gene IGFBP2 36

2.3.4.2 Thực hiện RFLP với enzyme cắt giới hạn: 38

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả đánh giá hiệu quả ly trích DNA 40

3.2 Xác định gene IGFBP2 và khảo sát tần số alen bằng phương pháp PCR – RFLP 41

3.2.1 Xác định gene IGFBP2 bằng kỹ thuật PCR 41

3.3.2 Xác định alen/kiểu gene sau khi cắt với enzyme Eco72I 44

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Đề nghị 48

CHƯƠNG V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

IGFBP2: insulin – like growth factor binding protein 2

QTL: quantitive trait locus

NST: nhiễm sắc thể

EDTA: ethylene diamine tetra acetate

SDS: sodium dodecyl sulfate

PCR: Polymerase Chain Reaction

dNTP: deoxy nucleoside triphosphate

RE: Restriction Enzyme

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

SNPs: single nucleotide polymorphism

DNA: Deoxyribo Nucleic Acid

µM: micro mol

µl: micro lit

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tương quan nồng độ gel và kích thước DNA 15

Bảng 2.1: Thành phần của bộ Kit EZ – 10 Spin Geneomic DNA Minipreps 31

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 36

Bảng 2.3: Trình tự mồi IGFBP2 – 1 và IGFBP2 – 3 37

Bảng 2.4: Chu kì nhiệt tiến hành PCR 37

Bảng 2.5: Thành phần cho một phản ứng cắt với enzyme Eco72I 38

Bảng 3.1: Tỉ lệ ly trích DNA tổng số 41

Bảng 3.2: Kết quả PCR – RFLP 46

Bảng 3.3: Tần số xuất hiện alen 46

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Một số giống gà địa phương được nuôi ở Việt Nam 7

Hình 1.2 Gà Tàu Vàng 8

Hình 1.3 Trứng gà Tàu Vàng 9

Hình 1.4 Quy trình chạy điện di định tính DNA 17

Hình 1.5 Nguyên lý của phản ứng PCR 24

Hình 2.1 Bộ Kit EZ – 10 Spin Geneomic DNA Minipreps 31

Hình 2.2.GoTaq Green Master Mix 2X 32

Hình 2.3.Mẫu máu được lấy từ trại giống và được chia ra ở phòng thí nghiệm 33

Hình 3.1.Kiểm tra DNA tổng số 40

Hình 3.2.Sản phẩm PCR chạy với cặp mồi IGFBP2 – 1 42

Hình 3.3.Sản phẩm PCR chạy với cặp mồi IGFBP2 – 3 43

Hình 3.4.Sản phẩm đã cắt với enzyme Eco72I ( từ mẫu 117) 44

Hình 3.5.Sản phẩm đã cắt với enzyme Eco72I (từ mẫu 1829) 45

Hình 3.8.Kết quả tỉ lệ kiểu gene 46

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, khi xã hội càng phát triển, đồng thời cùng với xu thế tăng dân số

nhanh chóng, thị trường ngày càng có yêu cầu cao hơn về thực phẩm Xu hướng của thị trường sản phẩm chăn nuôi của toàn cầu tăng lên hàng năm, trong đó các sản phẩm chăn nuôi chủ yếu của thế giới là thịt, trứng và sữa Thị trường đòi hỏi không chỉ về số lượng vật nuôi mà còn về chất lượng sản phẩm chăn nuôi để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của người tiêu dùng Hơn thế nữa, phát triển ngành chăn nuôi đang gặp phải những khó khăn là thích ứng với biến đổi khí hậu và dịch bệnh Những khó khăn đó tạo nên thách thức lớn cho ngành sản xuất thực phẩm nói chung

và ngành chăn nuôi gà nói riêng

Trong ngành chăn nuôi, đặc biệt là ngành chăn nuôi gà, một số tiêu chí có ý nghĩa kinh tế quan trọng như khả năng tăng trọng, mức độ sử dụng thức ăn, độ dày

mỡ bụng, chất lượng thịt…là các tiêu chí mà nhà chăn nuôi cần quan tâm khai thác

để đạt được hiệu quả kinh tế cao Bên cạnh việc áp dụng các thành tựu khoa học

như áp dụng quy trình chăn nuôi, việc chọn và lai tạo giống để nâng cao năng suất sinh sản, sinh trưởng và phẩm chất thịt gà, thì việc dùng kỹ thuật di truyền phân tử

để phát hiện những gene có lợi cho phẩm chất giống cũng được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi Với sự tiến bộ của sinh học phân tử, phương pháp phát hiện gene trực tiếp giúp xác định các gene ứng viên dễ dàng, kinh tế và hiệu quả hơn đối với các tính trạng kinh tế ở vật nuôi

Do đặc điểm của những giống gà địa phương Châu Á thường cho năng suất sản xuất thấp nhưng chất lượng thịt ngon, các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu, chọn lọc các giống gà địa phương dựa vào chỉ thị gene của một số gene ảnh hưởng đến tăng trưởng và phẩm chất thịt Trong số các gene đó, những hiểu biết về ảnh hưởng của các gene đến năng suất sinh sản, sinh trưởng, chất lượng thịt như gene IGFBPs, PIT – 1…đã được ứng dụng nhằm nâng cao năng suất và cải thiện chất lượng sản phẩm vật nuôi

Gene IGFBP2 (insulin – like growth factor binding protein 2) là một trong những IGFBPs chiếm ưu thế trong huyết thanh của các loài khác nhau và liên kết với IGF (Drop và cộng sự, 1992) Gene IGFBP2 có ảnh hưởng đến sự tăng trọng, tỉ

lệ mỡ và chiều dài xương

Phương pháp PCR – RFLP là kỹ thuật để phát hiện các DNA đa hình trong các quần thể gà Tàu Vàng và đánh giá ảnh hưởng của các gene IGFBP2 SNP đến sự tăng trưởng và phát triển của gà

2 Tình hình nghiên cứu

Hiện nay, các nghiên cứu ở ngoài nước đã được công bố :

- Nie và cộng sự (2005) đã phát hiện 35 SNPs (single nucleotide polymorphisms – đột biến điểm) trên gene IGFBP2 Đây là tiền đề mở đầu cho những nghiên cứu về đặc điểm và chức năng của gene IGFBP2

- Li và cộng sự (2006) cho thấy tương quan của điểm đột biến C  T thuộc intron 2 của gene IGFBP2 với trọng lượng cơ thể, chiều dài bàn chân, chiều dài xương chân, chiều dài xương đùi và trọng lượng mỡ bụng ở giống gà NEAURP F2

- Lie và cộng sự (2005) những haplotype được hình thành từ 5 SNP (chọn lọc

từ 40 SNPs của gene IGFBP2) có mối liên kết chặt chẽ với trọng lượng của gà ở giai đoạn tuổi khác nhau

- Leng và cộng sự (2009) cho rằng có sự liên kết di truyền tại điểm đột biến

1196 C A trong vùng 3’ – UTR của gene IGFBP2 với trọng lượng mỡ bụng và tỉ

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Thu mẫu máu từ đàn gà Tàu Vàng tại trung tâm giống

- Chiết tách DNA từ các mẫu

- Xác định gene IGFBP2 và tần số alen bằng phương pháp PCR – RFLP

5 Phương pháp nghiên cứu

- Sử dụng bộ kit để ly trích DNA

- Tiến hành xác định gene IGFBP2 bằng phương pháp PCR

- Xác định tần số alen bằng phương pháp RFLP

6 Các kết quả đạt được của đề tài

- Các mẫu máu gà Tàu Vàng sau khi được lấy về từ trại gà giống, người thực hiện đề tài tiến hành ly trích DNA với bộ EZ – 10 Spin Column Geneomic DNA Minipreps Kit Handbook hầu hết đều cho kết quả tốt

- Người thực hiện đề tài khuếch đại DNA theo quy trình PCR với cặp mồi thích hợp nhất Sau đó, các mẫu đã được PCR sẽ được kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose để xác định kích thước đoạn gene IGFBP2 với kết quả PCR đặc hiệu và các băng sáng rõ

- Sử dụng kỹ thuật PCR – RFLP để cắt sản phẩm PCR với các enzyme cắt giới

hạn tương ứng Eco72I, kết quả cho thấy enzyme cắt Eco72I cho sản phẩm phân cắt

đặc hiệu cho ra các băng kích thước khác nhau 527 bp, 477 bp và 50 bp Từ đó, tiến hành xác định tần số alen/ kiểu gene

Kết quả: đã xác định được 3 kiểu gene AA, AB và BB trên đàn gà khảo sát Kiểu gene AB chiếm tỉ lệ cao nhất 41 %, AA chiếm tỉ lệ 35,9 % và BB chiếm tỉ lệ 23,1

% Tần số alen A chiếm 0,56, tần số alen B chiếm 0,44

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

 Chương I: Tổng quan tài liệu

- Tổng quan chung về tình hình chăn nuôi gà trong và ngoài nước

- Sơ lược chung về gà Tàu Vàng

- Giới thiệu gene IGFBP2 và các nghiên cứu về gene này

- Sơ lược về các phương pháp xác định gene IGFBP2 ( phương pháp tách chiết DNA, phương pháp định tính bằng điện di, phương pháp PCR)

- Sơ lược về phương pháp khảo sát tần số alen (phương pháp RFLP)

 Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này nói về các hóa chất và dụng cụ sự dụng trong phòng thí nghiệm, phương pháp tiến hành thí nghiệm, thành phần hóa chất cần thiết để xác định gene IGFBP2 và khảo sát tần số alen của gene IGFBP2

 Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương này cung cấp các kết quả thu được sau khi ly trích DNA tổng số, kết quả xác định gene IGFBP2 bằng phương pháp PCR và kết quả khảo sát tần số alen bằng phương pháp RFLP Từ đó, người thực hiện đề tài đem so sánh với kết quả đã công bố trước đây ở nước ngoài

 Chương IV: Kết luận và kiến nghị

Chương này đưa ra kết luận từ những kết quả đã thu được ở chương III và những kiến nghị để tiếp tục phát triển đề tài

 Chương V: Tài liệu tham khảo

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về tình hình chăn nuôi gà trong và ngoài nước

1.1.1 Tình hình chăn nuôi và tiêu thụ gà trên thế giới

Gà nhà (Gallus gallus domesticus) là loài vật nuôi có từ hàng ngàn năm trước, với bằng chứng khảo cổ học cho thấy gà đã tồn tại ở Trung Quốc cách đây 8000 năm (FAO, 2004) Gà nuôi được thuần hóa từ gà rừng nhiệt đới thuộc Châu Á Trải qua quá trình thuần hóa, chọn lọc tự nhiên và nhân tạo đã hình thành nên các dòng, giống khác nhau theo hướng thịt, trứng và kiêm dụng

Loài: Gallus gallus

Phân loài: Gallus gallus domesticus

Theo số liệu thống kê của FAO, năm 2009 số lượng gà trên thế giới là 14191,1 triệu con, riêng ở Châu Á là 9101,3 triệu con Việt Nam là nước đứng thứ 13 trên thế giới về số lượng gà Sản lượng thịt gà trên thế giới năm 2009 đứng thứ hai với 79,5 triệu tấn Trong đó, tổng sản lượng thịt của Châu Á là 116,4 tiệu tấn trong đó thịt gà là 21287,1 nghìn tấn Trong cơ cấu các loại thịt ở Châu Á thì thịt lợn chiếm trên 50,3 %, thịt gà chiếm 18,21 %, thịt bò chiếm 10,13 % tổng sản lượng thịt Như vậy, sản xuất và tiêu thụ thịt gia cầm trên Châu Á hiện nay đứng thứ hai sau thịt lợn trong các loại thịt của vật nuôi

Vật nuôi bản địa nói chung và gia cầm nói riêng ngày càng được quan tâm bởi khả năng thích nghi và chịu đựng được với khí hậu ngày càng khắc nghiệt và chất lượng thịt thơm ngon Ngoài ra, gà địa phương còn là nguyên liệu cho bảo tồn, đa dạng nguồn gene và làm giống nên để lai tạo với giống gà cao sản nhằm cải thiện

năng suất gà địa phương (Fassill, 2010) Mặt khác, chất lượng thịt gà địa phương được người tiêu dùng ưa thích hơn thịt gà công nghiệp bởi thịt dai hơn, có mùi vị thơm ngon và có hàm lượng chất béo thấp, protein cao, hàm lượng collagen tổng số của cơ đùi và cơ ngực cao, các chỉ tiêu về màu sắc và giá cả cao hơn gà công nghiệp (Wattanachant và cộng sự, 2004; Sartika, 2005; Promwatee và Duangjinda, 2010) Tuy nhiên khả năng sinh trưởng của gà địa phương chậm hơn gà công nghiệp

1.1.2 Tình hình chăn nuôi và tiêu thụ gà trong nước

Số liệu của gà năm 2011 – tài liệu cục thống kê, chăn nuôi gà chiếm 72 – 73

% trong tổng đàn gia cầm, trong đó gà Tàu Vàng được nuôi nhiều ở các tỉnh miền Đông và Tây Nam Bộ như Bà Rịa Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh, Long An, Tiền Giang, số lượng được nuôi nhiều nhất ở Long An, Tiền Giang Tại Thành phố Hồ Chí Minh, gà được nuôi rải rác ở các huyện ngoại thành như Củ Chi, Hóc Môn

Hiện nay, chăn nuôi gia cầm chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của xã hội Sản lượng thịt, trứng/ người/ năm so với các nước trong khu vực và thế giới còn thấp rất nhiều Sản lượng thịt mới đạt 3,8 – 4,2 kg, sản lượng trứng đạt 48 – 50 quả/người/năm (tính chung cả gà và thủy cầm) trong khi tiêu thụ ở Trung Quốc năm

2004 đạt 8,4 kg thịt và 10,4 kg trứng/người/năm…) Do đó, theo chủ trương của Nhà Nước về phát triển chăn nuôi thì phải tăng sản lượng thịt gia cầm (cả gà và thủy cầm) lên 32 % năm 2015 trong tổng sản lượng thịt các loại (so với 2003 là 16 – 17 %) Để đạt được những mục tiêu đó cần phải có giải pháp thực hiện thiết thực, kết hợp kĩ thuật chăn nuôi cũng như thành tựu khoa học kĩ thuật vào chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gà nói riêng

Đặc biệt là chú ý phát triển và bảo tồn các giống địa phương bởi một số phẩm chất ưu việt của nó Ở Việt Nam còn tồn tại một số giống gà nội được chọn lọc và thuần hóa lâu đời như gà Ri, gà Mía, gà Tre, gà Hồ, gà H’ Mông, gà Ác, gà Tàu Vàng, gà Nòi…, hầu hết các giống gà này đều có chất lượng thịt, trứng thơm ngon,

bổ dưỡng, nhưng hạn chế về năng suất thịt và trứng Trong đó, gà Tàu Vàng là một

giống gà quý có tên trong danh sách vật nuôi được bảo tồn và là giống đặc trưng của các tỉnh miền Nam

Hình 1.1 Một số giống gà địa phương được nuôi ở Việt Nam A) Gà Ác; B) Gà Hồ;C)

Gà Mía; D) Gà Ri;E) Gà Tam Hoàng; F) Gà Tàu Vàng;G) Gà Tre; H) Gà Đông Tảo (Nguồn: http://www.rovetco.com)

1.2 Gà Tàu Vàng

Gà Tàu Vàng xuất hiện ở Việt Nam từ lâu đời, chủ yếu tập trung ở Long An, Tiền Giang, Tây Ninh, Bình Dương

Gà Tàu Vàng có ngoại hình khá đẹp, lông màu vàng đến vàng rơm, cổ, cánh

và đuôi có cườm đen từ nhiều đến ít, một số ít xuất hiện lông ở chân Da vàng, chân vàng, thịt trắng Mào phần lớn là mào đơn, ít mào nụ Gà rất nhanh nhẹn và ưa thích tìm kiếm mồi trong vườn

Giống gà này có khối lượng vừa phải, lớn hơn một số giống gà ta như gà Tre,

gà Ri và nhỏ hơn gà lông màu (gà Lương Phượng, Tam Hoàng, BT2, Kabir) Khối lượng sơ sinh của gà Tàu Vàng là khoảng 18 – 20 gram Lúc trưởng thành con trống nặng 700 – 750 gram, con mái nặng 500 – 600 gram Gà có trọng lượng vừa phải sau 16 tuần tuổi nặng khoảng 1,5 – 1,7 kg ở con mái, con trống khoảng 2 – 2,2 kg

Hình 1.2 Gà Tàu Vàng (Nguồn: http://www.rovetco.com)

Gà Tàu Vàng có khả năng sinh sản kém, nếu nuôi tập trung thì tỷ lệ đẻ bình quân toàn đàn gà Tàu Vàng chỉ từ 25 – 30 % nếu như áp dụng kỹ thuật cai ấp Nếu không có chế độ cai ấp thì tỷ lệ này nhiều khi chỉ đạt dưới 20%

Gà mái bắt đầu đẻ lúc 120 – 140 ngày tuổi, ham ấp và khéo nuôi con là đặc thù của giống gà này Năng suất trứng đạt 90 – 120 quả (Át lát vật nuôi, 2004)

Trọng lượng trứng bình quân chỉ đạt 42 – 45 gram Trứng thường có màu nhạt, nâu nhạt

Hình 1.3 Trứng gà Tàu Vàng

Trong môi trường chăn thả và ấp tự nhiên của đàn gà thì tỷ lệ nở trứng đạt cao

từ 90 – 95 % Còn khi nuôi nhốt và ấp máy theo lối công nghiệp thì tỷ lệ nở trứng cũng chỉ đạt 73 – 77 %

Đặc tính quan trọng nhất của gà Tàu Vàng là thích nghi tốt với điều kiện sinh thái miền Nam, chất lượng thịt thơm ngon rất phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng trong nước và có giá bán cao hơn gà lông màu Trong những năm gần đây, nhiều giống gà mới (Tam Hoàng, Lương Phượng, Sasso…) đã được du nhập nhanh vào chăn nuôi gà thả vườn Nam Bộ Tuy vậy giống gà Tàu Vàng vẫn được nuôi giữ trong nhiều hộ dân, một phần là do đặc thù sinh học quý giá của giống gà này Người tiêu dùng rất ưa chuộng và chấp nhận giá cao Tập quán nuôi và bán gà mái dầu, gà trống thiến vẫn tồn tại ở Nam bộ Gà Tàu Vàng mái dầu thường có giá cao gấp 2 lần gà Lương Phượng Có thể nói đây là đặc sản của vùng đất Nam bộ còn

giữ được trong quá trình công nghiệp hoá (Đinh Công Tiến và Nguyễn Quốc Đạt, 2005)

1.3 Gene IGFBP2 và các nghiên cứu về gene IGFBP2

1.3.1 Giới thiệu về gene IGFBP2

Bản đồ QTL (quantitive trait locus) sử dụng nhiều loại chỉ thị phân tử trên toàn bộ gene mang lại nhiều thông tin có giá trị về các vùng trên nhiễm sắc thể (NST) liên quan đến tính trạng năng suất của gà Các nghiên cứu đã chỉ ra rất nhiều QTL ảnh hưởng đến tính trạng tăng trọng của gà định vị trên NST số 7, nằm giữa các chỉ thị LEI0064 và MCW0236, là vị trí của gene IGFBP2 trên NST

Yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGFI và IGF II) kích thước nhỏ (75 kDa) giúp lưu thông peptide, qua đó đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và sự khác biệt trong các loại mô (Lowe, 1991) Các IGF có vai trò quan trọng trong việc kích thích tăng trưởng, tổng hợp protein, phát triển tế bào và biệt hóa trong một loạt các tế bào (King và Scanes, 1986; Scanes và cộng sự, 1999) Trong hầu hết các trường hợp IGFs được tìm thấy trong một phức hợp cụ thể, IGF liên kết chặt chẽ với các protein IGFBPs (Baxter và Martin 1989 và Clemmons 1991) IGFBPs giúp kéo dài thêm nửa thời gian IGFs lưu hành bằng cách ngăn chặn sự bài tiết của chúng (Cohen và Nissley 1976) Tuy nhiên, giờ đây, IGFBPs còn được biết đến như

bộ điều biến của IGFs, kích thích (Elgin và cộng sự, 1987; Blum và cộng sự, 1989) hoặc ức chế (Rutanen và cộng sự, 1988; Burch và cộng sự, 1990) hoạt động của IGFs

Hiện nay đã có 6 loại IGFBP được nhân bản và sắp xếp theo trình tự (Shimasaki và Ling, 1991) Trong đó, IGFBP2 được tìm thấy chiếm tỉ lệ cao ở các loài động vật có vú khác nhau (Delhanty và Han, 1992) Cấu trúc của gene IGFBP2

có sự tương đồng cao giữa loài động vật có vú và gia cầm (Ehrenborg và cộng sự, 1991; Schoen và cộng sự, 1995) Các IGFBP2 nhạy cảm với mức protein và có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh tác nhân tăng trưởng và có tác dụng lưu thông IGFBP phức tạp trong động vật nhai lại và gà (Kita và cộng sự, 2002; Lee và cộng

sự, 2005)

Gene IGFBP2 (insulin – like growth factor binding protein 2) gà có chiều dài khoảng 38 kb nằm trên nhiễm sắc thể 7, bao gồm 4 exon ngắn và 3 intron dài, mã hóa 275 acid amin và được điều khiển bởi các hormone sinh trưởng (Schoen và cộng sự, 1995)

Gene IGFBP2 là một trong những IGFBPs chiếm ưu thế trong huyết thanh của các loài khác nhau và liên kết với IGF (Drop và cộng sự, 1992) Gene IGFBP2 có nhiều trong mô, như cơ bắp, phổi, gan, thận, tim, buồng trứng, mắt, cơ xương, não

và ruột (Schoen và cộng sự, 1995) Gene IGFBP2 có chức năng sinh học rộng thông qua phối hợp và điều chỉnh các hoạt động sinh học của IGF và chuyển đổi yếu tố tăng trưởng β (TGF – β; Rajaram và cộng sự, 1997; Hoeflich và cộng sự, 1999) Eckstein và cộng sự (2002) báo cáo rằng IGFBP2 có ảnh hưởng tiêu cực đến kích thước xương và chất khoáng ở trong chuột, điều đó có thể ảnh hưởng quan trọng đến các hoạt động sinh học của xương trong cơ thể Ngoài ra IGFBP2 có ảnh hưởng đến sự khác biệt của tế bào mỡ bằng cách kiểm soát IGF (Richardson và cộng sự, 1998) và hoạt động của TGF – β trong mô mỡ (Butterwith and Goddard, 1991)

Do sự phát triển đặc trưng của nó và tương đối dễ dàng trong việc thu nhận và thao tác trên mô phôi thai gà nên đã cung cấp mô hình tuyệt vời để nghiên cứu sự tham gia của IGFs và các protein liên kết trong quá trình phát triển

1.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước về ảnh hưởng của gene IGFBP2

1.3.2.1 Ảnh hưởng lên trọng lượng cơ thể

Tăng trưởng phản ánh toàn diện sự phát triển của các bộ phận khác nhau trên

cơ thể, tương tác giữa di truyền, dinh dưỡng và các yếu tố môi trường (Scanes và cộng sự, 1984) Tốc độ tăng trưởng luôn là đặc điểm được chú ý nhiều nhất từ nửa thế kỷ trước và sẽ tiếp tục là mục tiêu quan trọng nhất trong chiến lược kinh tế của ngành chăn nuôi Tốc độ tăng trưởng được kiểm soát di truyền phức tạp và việc tìm

ra cơ chế phân tử của sự tăng trưởng sẽ góp phần để lựa chọn hiệu quả hơn cho sự tăng trưởng của gà thịt (Deeb và Lamont, 2002) Các nghiên cứu về chức năng sinh học của IGFBP2 cho thấy rằng sự giảm tăng trưởng ở chuột (đã được chọn lựa) có liên quan đến biểu hiện tăng IGFBP2 mRNA trong gan và trong huyết thanh

(Hoeflich và cộng sự, 1999) Từ đó cho thấy IGFBP2 ảnh hưởng đến sự tăng trưởng Tăng lượng IGFBP2 được tìm thấy trong nghiên cứu liên quan đến sự chậm phát triển của chuột và heo (Price và cộng sự, 1992; Kampman và cộng sự, 1993; Tapanainen và cộng sự, 1994)

Từ những kết quả hiện tại, C1032T SNP có liên quan đến BW (trọng lượng cơ thể) của gà ở 2 – 12 tuần tuổi DeKoning và cộng sự (2003) báo cáo rằng một QTL cho trọng lượng thịt đã được chiếu xạ trong khoảng MCW0030 và MCW0236 (khoảng 2,3 đến 29 Mb) trên GGA7, một khu vực có chứa gene IGFBP2 gà (23 –

24 Mb) Những nghiên cứu hiện tại đã cho thấy gene IGFBP2 như một gene tiêu biểu của QTL tăng trưởng, có thể sử dụng để tăng tốc độ tăng trưởng trọng lượng của gà

Kết quả nghiên cứu của Nie và cộng sự (2005) đã phát hiện 35 SNPs (single nucleotide polymorphism – đột biến điểm) trên gene IGFBP2 Đây là tiền đề mở đầu cho những nghiên cứu về đặc điểm và chức năng của gene IGFBP2 Nhiều nghiên cứu tiếp theo cho thấy vai trò của các SNP gene IGFBP2 liên quan đến tính trạng năng suất ở nhiều giống gà Theo Lei và cộng sự (2005) những haplotype được hình thành từ 5 SNP (chọn lọc từ 40 SNPs của gene IGFBP2) có mối liên kết chặt chẽ với trọng lượng của gà ở giai đoạn tuổi khác nhau (giai đoạn mới nở, 7, 14,

21, 28, 35, 42, 49, 56 và 90 ngày tuổi); trọng lượng sau khi bỏ lông, cánh, cổ, chân, trọng lượng gan, tim, mề, trọng lượng thịt, trọng lượng cơ ức trên giống gà lai giữa White Recessive Rock (tăng trọng nhanh) x Xinghua (gà địa phương tăng trọng kém)

Kết quả nghiên cứu của Promwatee và Duangjinda (2010) cũng chỉ ra rằng gene IGF – I, cGH và IGFBP2 có ảnh hưởng đến khả năng tăng trưởng của gà bản địa Thái Lan ở các giai đoạn 4, 8, 12 và 16 tuần tuổi và khả năng tăng trọng ngày ở giai đoạn 0 – 4, 0 – 8, 0 – 12 và 0 – 16 tuần tuổi ở gà Chee, một trong số các giống

gà địa phương của Thái Lan

1.3.2.2 Ảnh hưởng đến đặc điểm của xương

Các vấn đề của xương thường là kết quả của việc thiếu điều hòa phát triển và tăng trưởng giữa khối lượng toàn cơ thể và hệ thống bộ xương (Julian, 1998) Tăng cường độ chắc của xương và tỷ lệ xương thích hợp là những mục tiêu đáng được chú ý trong công nghiệp sản xuất gà thịt (Li và cộng sự, 2003) Trong các nghiên cứu hiện nay, SL (chiều dài chân), FL (chiều dài xương đùi), SW (cân nặng chân),

FW (cân nặng đùi) được đo như các chỉ số tăng trưởng của chân Nhiều cuộc nghiên cứu đã chỉ ra rằng, gene IGFBP2 có liên quan đến sự tăng trưởng, duy trì, mật độ khoáng của xương (Kim and Lee, 1996; Eckstein và cộng sự, 2002)

Kết quả nghiên cứu của Li và cộng sự (2006) cho thấy tương quan của điểm đột biến C  T thuộc intron 2 của gene IGFBP2 với trọng lượng cơ thể, chiều dài bàn chân, chiều dài xương chân, chiều dài xương đùi và trọng lượng mỡ bụng ở giống gà NEAURP F2 (các dòng gà của Northeast Agricultural University Resource Population x gà địa phương Baier)

1.3.2.3 Ảnh hưởng đến mỡ vùng bụng

Để nâng cao hiệu suất và chất lượng sản phẩm thì gà phải có ít chất béo IGFBP2 có thể ức chế các hoạt động sinh học của IGF thông qua nội tiết và cơ chế paracrine (Hoeflich và cộng sự, 1999) Gần đây, một QTL cho trọng lượng thịt đã được chiếu xạ trong khoảng LEI0064 đến ROS0019 (75 kb đến 27 Mb) trên GGA7 trong sơ đồ mối liên kết gà (Ikeobi và cộng sự, 2002), bao gồm các gene IGFBP2 (23 – 24 Mb)

Nghiên cứu gần đây của Leng và cộng sự (2009) cho rằng có sự liên kết di truyền tại điểm đột biến 1196 C A trong vùng 3’ – UTR của gene IGFBP2 với trọng lượng mỡ bụng và tỉ lệ mỡ bụng trên các giống gà NEAURP F2 và NEAUHLF của Northeast Agricultural University

1.4 Các phương pháp xác định gene

1.4.1 Phương pháp tách chiết DNA

Mọi phương pháp nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng DNA đủ lớn và có độ tinh sạch cao Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA là thu nhận các phân tử này ở dạng nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào phóng thích ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ) Các acid nucleic cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào

Nguyên tắc chung để tách chiết DNA từ tế bào là phân giải tế bào, loại bỏ những tạp chất khác, tủa DNA và tinh sạch DNA Thực hiện qua các bước sau : Bước 1: Phá vỡ vật liệu ban đầu (tế bào, mô) để mở tế bào và giải phóng axit nucleic (ADN và ARN)

Để thực hiện công việc này người ta nghiền mô động vật trong dung dịch phân giải tế bào, dung dịch này có các thành phần chính như: EDTA (ethylene diamine tetra acetate), SDS (sodium dodecyl sulfate), proteinase (proteinase K)

Bước 2: Bổ sung các chất chống các chất hoạt hoá enzyme ADNase và làm biến tính các phân tử protein, dịch hữu cơ…

Bước 3: Tách DNA khỏi các tạp chất khác (bằng máy ly tâm)

Bước 4: Kết tủa, rửa và hòa tan DNA (rửa bằng dung dịch cồn, hòa tan trong

TE hoặc nước cất)

Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác có thể hòa tan chúng trong dung dịch theo nồng độ mong muốn

Sau khi tủa, DNA được thu nhận bằng cách li tâm và tiến hành tinh sạch DNA bằng ethanol

1.4.2 Phương pháp định tính DNA bằng điện di

Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác dụng của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Tính di động của phân tử phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ chất cấu thành gel Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu DNA là polyacrylamide và agarose Việc chọn lựa gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tích Bảng 1.1 cho thấy mối tương quan giữa nồng độ agarose và acrylamide cần sử dụng để phân tích các trình

tự có kích thước xác định

Bảng 1.1 Tương quan nồng độ gel và kích thước DNA

% acrylamide

Kích thước các đoạn cần phân tách (bp)

% agarose

Kích thước các đoạn cần phân tách (bp)

cực dương vì DNA mang điện âm Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự

co xát giữa các hạt agarose với phân tử DNA tạo ra lực kháng ngăn cản sự di chuyển của DNA DNA có khối lượng càng lớn thì lực cản càng mạnh Do đó, DNA có trọng lượng phân tử càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh Nhờ vậy, người ta phân loại được các đoạn DNA trong bản thạch agarose Khi thay đổi nồng độ agarose, kích thước lỗ giữa các hạt agarose cũng thay đổi Nồng độ agarose càng thấp thì kích thước lỗ giữa các hạt agarose càng lớn

Các acid nucleic trong gel agarose sẽ được thấy dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ehidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào các base của DNA và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang Trong thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ hoặc nhuộm bản gel với ethidium bromide sau khi đã điện

di

Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự acid nucleic trong gel agarose, người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM) Đó là tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DNA) Thông thường người ta sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể được thủy giải bởi enzyme giới hạn HindIII ( Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Hình 1.4 Quy trình chạy điện di định tính DNA (Nguồn: http://www.bio.edu.vn)

1.4.3 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction)

1.4.3.1 Giới thiệu chung

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và

kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới

Phương pháp này cho phép khuếch đại nhanh một gene mong muốn lên nhiều lần Mức độ khuếch đại, về lý thuyết là hàng triệu lần (tạo ra nhiều μg DNA) từ một phân tử DNA ban đầu Phương pháp này khác với phương pháp nhân bản DNA

bằng cloning (dòng hóa trong điều kiện in vivo) Trong phương pháp PCR, sự nhân bản DNA được thực hiện trong điều kiện in vitro, không cần sự hiện diện của tế

bào

1.4.3.2 Nguyên tắc

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase và một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này Nhờ enzyme DNA polymerase xúc tác trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới Các mạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới của chu kỳ tiếp theo Sự tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có

sự tham gia của các primer tạo các nhóm 3’ OH tự do Các nucleotide được gắn ở vị trí nhóm OH kéo dài tạo thành mạch đơn mới (Khuất Hữu Thanh, 2003)

Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gene (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gene quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000)

Primer là những đoạn oligonucleotid mạch đơn, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự hai đầu mạch khuôn Chiều dài tối thiểu của mồi cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide Đối với việc khuếch đại các chuỗi có mức độ dị hợp cao thường sử dụng mồi có 28 – 35 nucleotide Primer càng dài khả năng tổng hợp mạch DNA mới càng chính xác Ngược lại khi primer ngắn quá, sự bắt cặp giữa mồi và khuôn thuận lợi nhưng kết quả PCR kém độ chính xác Cặp primer gồm primer xuôi và primer ngược tham gia phản ứng PCR Primer xuôi bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’ – 3’, primer ngược bắt cặp bổ sung gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’ – 5’ (Khuất Hữu Thanh, 2003)

Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ

để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000)

1.4.3.3 Các bước chuẩn bị và thực hiện phản ứng PCR

 Chuẩn bị mẫu DNA

Mẫu DNA của đối tượng cần nghiên cứu được ly trích và tinh sạch, sau đó trữ mẫu ở – 200C

 Thiết kế mồi

Mồi là những đoạn oligonucleotide (18 – 24 base) bổ sung với trình tự trên DNA, gồm có mồi xuôi và mồi ngược

- Mồi xuôi (sense primer hoặc Forward) bắt cặp với mạch khuôn của DNA và

sẽ kéo dài theo chiều phiên mã

- Mồi ngược (anti sense primer hoặc Reverse) bắt cặp với mạch mã của DNA

và sẽ kéo dài ngược theo chiều phiên mã

Trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc

Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không được chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc C nối tiếp nhau, thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng

30 % < G + C < 70 % )

Mồi phải bảo đảm đủ dài để bắt cặp chính xác

Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên DNA, một mồi chỉ bám vào một vị trí nhất định trên gene

Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (< 3000 nu, tốt nhất

là dưới 1000 nu)

 Các thành phần của phản ứng PCR

- Nước

Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt giới hạn…Nói cách khác là không chứa bất kỳ một thành phần nào khác

Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0,5 – 5 mM Chính ion Mg2+ gắn liên kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi Nồng độ MgCl2 cao

sẽ tạo nhiều sản phẩm không đặc hiệu, nồng độ MgCl2 quá thấp sẽ không tạo sản phẩm PCR

- dNTP (deoxy nucleoside triphosphate)

Tức là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích dNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là Adenine (dATP) hay Thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay Guanine (dGTP), ở carbone số 1 (C1) Ba phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5) của phân

tử deoxyribose này và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi bổ sung trên chuỗi DNA đích Năng lượng để cho phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lượng của triphosphate trên dNTP Do đó người ta dùng dNTP

mà không dùng dNDP (diphosphate) hay dNMP (monophosphate)

Nồng độ dNTP biến thiên khoảng 50 – 400 µM Thường người ta khuyến cáo mỗi loại được sử dụng là 200 µM Điều quan trọng là giữ cho nồng độ của dNTP bằng nhau để giảm thiểu các lỗi sao chép của polymerase (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999)

Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng

Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính: (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu (2) Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi

- Enzyme DNA polymerase (Taq)

Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp theo chiều 5’ 3’ Phần lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA để làm khuôn cho sự tổng hợp Các DNA polymerase để hoạt động cần có một mồi (primer) DNA polymerase phải chịu được nhiệt độ cao

Vào thập niên 1960, nhà Vi sinh vật học Thomas Brock đã đến Công viên Quốc gia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ) để nghiên cứu các vi sinh vật ưa nhiệt sống trong suối nước nóng 80 – 900C Ông đã phát hiện một loài vi khuẩn phát triển