Khả năng sử dụng một số vi khuẩn lab phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của lactobacillus fermentum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢ NĂNG SỬ DỤNG MỘT SỐ VI KHUẨN LAB PHÂN LẬP TRONG KHOANG MIỆNG ỨC CHẾ SỰ TẠO THÀNH MÀNG SINH HỌC CỦA Lactobacillus fermentum Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đặng Vân Anh MSSV: 1311100138 Lớp: 13DSH02 TP.Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn TS Nguyễn Hồi Hương Giảng viên Khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Những kết hồn tồn khơng chép từ nghiên cứu khoa học khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án hồn tồn trung thực Tơi xin chịu trách nhiệm tồn đồ án Tp.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Đặng Vân Anh i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đồ án “Khả sử dụng số vi khuẩn LAB phân lập khoang miệng ức chế tạo thành màng sinh học Lactobacillus fermentum” suốt trình học tập, rèn luyện trau dồi kiến thức em gặp phải khơng lần khó khăn nhờ có quan tâm, giúp đỡ hướng dẫn tận tình TS Nguyễn Hồi Hương, Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, kiến thức kỹ cần thiết Cô truyền dạy mà em đạt thành ngày hôm Em xin chân thành cảm ơn cô Bên cạnh đó, em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến Thầy Cô giảng viên Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM tạo điều kiện giúp em tiếp cận nhiều nguồn tài liệu để hoàn thành đồ án tốt nghiệp thời gian quy định Dù đồ án hoàn thành khơng tránh khỏi sai sót định khả hiểu biết hạn hẹp thông tin tài liệu khơng khả quan để phục vụ q trình thực đồ án Kính mong nhận góp ý dạy Thầy Cô để em học hỏi thêm kinh nghiệm, tích lũy cho q trình học tập rèn luyện chuẩn bị hành trang bước sang mơi trường làm việc sau Ngồi ra, xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, người bên tạo điều kiện tốt cho trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Đặng Vân Anh ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt Kết cấu đồ án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vi khuẩn Lactic (LAB) 1.2 Tổng quan Probiotic 19 1.3 Màng sinh học 31 1.4 Sâu 37 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1 Địa điểm nghiên cứu 44 2.2 Thời gian thực 44 2.3 Vật liệu thiết bị 44 2.4 Phương pháp luận 45 2.5 Phương pháp thí nghiệm 47 iii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 64 3.1 Kết thử nghiệm sinh lý 64 3.2 Kết thử nghiệm sinh hóa 67 3.3 Kết khả sinh enzyme 71 3.4 Kết khả kháng khuẩn 75 3.5 Kết khả kháng kháng sinh 77 3.6 Kết khảo sát khả ức chế màng sinh học vi khuẩn lactic sau qua xử lý nhiệt 81 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84 Kết luận 84 Kiến nghị 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU 94 iv Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG  Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe agar (MRS agar):  Tween 80 1ml  MgSO4.7H2O 0.2g  Cao thịt 10g  MgSO4.4H2O 0.2g  Pepton 5g  K2PO4 2g  Yest Extract 5g  Nước cất 1000ml  D-glucose 10g  Agar 2%  Diamonium Citrate 2g  Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 25oC  Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS broth):  Tween 80 1ml  Diamonium Citrate 2g  Cao thịt 10g  MgSO4.7H2O 0.2g  Pepton 5g  MgSO4.4H2O 0.2g  Yest Extract 5g  K2PO4 2g  D-glucose 10g  Nước cất 1000ml  Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 25oC  Thành phần nước muối sinh lí:  NaCl 9g  Nước cất 1000ml  Thành phần môi trường Glucose Phosphate broth (MR – VP broth):  Peptone 7g  Dextrose 5g  K2HPO4 5g  Nước cất 1000ml v Đồ án tốt nghiệp  Thành phần môi trường Simmon citrate agar (SCA)  MgSO4.7H2O 0,2g  NH4H2PO4 1g  K2HPO4 1g  Na3C6H5O7 2g  NaCl 5g  Bromothymol blue 0,08g  Agar 15g  Nước cất 1000ml  Điều chỉnh pH = 6.8 ± 0.2 25oC  Thành phần môi trường canh tryptone:  Tryptone 10g  NaCl 5g  Nước cất 1000ml  Điều chỉnh pH = 7.5 ± 0.2 25oC  Thành phần môi trường Triple sugar iron agar (TSI):  Cao thịt 3g  NaCl 5g  Peptone 20g  Na2S2O3 0,3g  Yeast extract 3g  Phenol red 0,024g  Lactose 10g  Agar 15g  Sucrose 10g  Nước cất 1000ml  Dextrose 1g  Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2  FeSO4 0,2g 25oC ii Đồ án tốt nghiệp  Thành phần môi trường Blood agar:  Beef heart infusion 500g  Tryptose 10g  NaCl 5g  Agar 15g  Máu cừu 50ml  Nước cất 950ml  Điều chỉnh pH = 7.3 ± 0.2 25oC  Thành phần môi trường Skim milk agar:  Bột sữa gầy 28g  Casein enzymic hydrolysate 5g  Cao nấm men 2,5g  Dextrose 1g  Agar 15g  Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 25oC  Thành phần môi trường Lactobacillus biofilm medium (LBM):  Peptone 5g  CH3COONa.H2O 2,5g  Cao nấm men 2,5g  MgSO4 0,05g  K2HPO4 3g  MnSO4 0,025g  (NH4)3C6H5O7 1g  CaCl2 0,1g  Dextrose 10g  Nước cất 1000ml  Cao thịt 5g  Tween 80 0,5g  Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 25oC ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic acid bacteria /Lactobacillales MRS de Man, Rogosa and Sharpe SCA Simmon citrate agar SAS Statistical Analysis Systems TSI Triple sugar iron TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng Tổng hợp nghiên cứu khảo sát số chủng probiotic việc bảo vệ miệng Bảng 1.1 Đặc điểm sinh lý số chủng vi khuẩn lactic 11 Bảng 1.2 Khả đối kháng sản phẩm biến dưỡng vi khuẩn LAB 19 Bảng 2.1 Phân loại khả kháng kháng sinh dựa vào đường kính vòng kháng 62 Bảng 3.1 Kết thử nghiệm sinh lý 64 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm sinh hóa 67 Bảng 3.3 Kết thử nghiệm lên men carbohydrate 69 Bảng 3.4 Kết khả sinh enzyme chủng lactic 71 Bảng 3.5 Tỉ lệ kháng khuẩn chủng lactic (%) 76 Bảng 3.6 Kết kháng kháng sinh chủng lactic 77 Bảng 3.7 Kết ức chế khả tạo màng sinh học vi khuẩn lactic sau xử lý nhiệt 82 iii Đồ án tốt nghiệp UC CHE 1B O 0DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square Number of Means Critical Range 114.8551 18.38 19.29 19.86 20.26 20.54 20.76 20.93 21.06 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping A Mean N NBG 35.659 23B1 A 32.900 21B2 B C 14.260 8B B C B C 14.149 7B2 11.871 21R2 0.000 16B 0.000 23B2 0.000 26R1 0.000 8R2 A B B C C C C C C C C C C 103 Đồ án tốt nghiệp Ức chế 1B 800C UC CHE 1B O 80DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 1B O 80DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1851.200732 231.400092 Error 18 869.677465 48.315415 Corrected Total 26 2720.878197 4.79 0.0028 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.680369 Source NBG 138.3042 6.950929 DF 5.025828 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 1851.200732 231.400092 4.79 0.0028 UC CHE 1B O 80DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square Number of Means Critical Range 48.31541 11.92 12.51 12.88 13.14 13.32 13.47 13.58 13.66 104 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NBG A 26.282 21B2 B 11.482 8B B B 3.834 21R2 2.317 7B2 1.318 23B1 0.000 16B 0.000 23B2 0.000 26R1 0.000 8R2 B B B B B B B B B B B B Ức chế 1B 1000C UC CHE 1B O 100DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class NBG Levels Values 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 105 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 1B O 100DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 93.5157741 11.6894718 Error 18 195.2819830 10.8489991 Corrected Total 26 288.7977571 1.08 0.4207 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.323811 Source NBG 238.1836 3.293782 DF 1.382875 Anova SS Mean Square F Value 93.51577407 11.68947176 1.08 Pr > F 0.4207 UC CHE 1B O 100DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 18 10.849 5.650 5.928 6.104 6.225 6.314 6.381 6.433 6.474 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping A Mean N NBG 4.978 26R1 4.396 8B 1.918 23B2 0.695 8R2 0.300 21B2 A A A A A A A A 106 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NBG 0.158 16B 0.000 21R2 0.000 23B1 0.000 7B2 A A A A A A A A Ức chế 12R2 00C UC CHE 12R2 O 0DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 12R2 O 0DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square Model 7.66898483 0.95862310 Error 18 17.89930657 0.99440592 Corrected Total 26 25.56829140 F Value Pr > F 0.96 0.4927 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.299941 Source NBG 272.5161 0.997199 DF Anova SS 7.66898483 0.365923 Mean Square F Value 0.95862310 107 0.96 Pr > F 0.4927 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 12R2 O 0DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square Number of Means Critical Range 0.994406 1.711 1.795 1.848 1.885 1.912 1.932 1.948 1.960 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping A Mean N NBG 1.4085 21B2 0.9677 23B1 0.9171 8B 0.0000 16B 0.0000 21R2 0.0000 23B2 0.0000 7B2 0.0000 26R1 0.0000 8R2 A A A A A A A A A A A A A A A A 108 Đồ án tốt nghiệp Ức chế 12R2 800C UC CHE 12R2 O 80DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 12R2 O 80DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 70.3853638 8.7981705 Error 18 78.9899259 4.3883292 Corrected Total 26 149.3752897 2.00 0.1051 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.471198 Source NBG 366.9740 2.094834 DF Anova SS 0.570840 Mean Square F Value Pr > F 70.38536383 8.79817048 2.00 0.1051 UC CHE 12R2 O 80DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square Number of Means Critical Range 4.388329 3.593 3.770 3.882 3.959 4.016 4.059 4.092 4.117 109 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N NBG A 5.138 8B B 0.000 16B 0.000 21R2 0.000 21B2 0.000 23B2 0.000 26R1 0.000 7B2 0.000 23B1 0.000 8R2 B B B B B B B B B B B B B B Ức chế 12R2 1000C UC CHE 12R2 O 100DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 110 Đồ án tốt nghiệp UC CHE 12R2 O 100DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 727.633897 90.954237 Error 18 637.074597 35.393033 Corrected Total 26 1364.708495 2.57 0.0459 R-Square Coeff Var Root MSE InhibitionAbility Mean 0.533179 Source NBG 233.2837 5.949204 DF 2.550202 Anova SS Mean Square F Value 727.6338972 90.9542371 2.57 Pr > F 0.0459 UC CHE 12R2 O 100DO The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for InhibitionAbility Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means Critical Range 18 35.39303 10.20 10.71 11.02 11.24 11.40 11.53 11.62 11.69 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping A Mean N NBG 16.117 26R1 6.414 23B2 0.421 16B 0.000 23B1 A B A B B B B B 111 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping B Mean N NBG 0.000 21R2 0.000 21B2 0.000 7B2 0.000 8B 0.000 8R2 B B B B B B B B Ức chế 30B2 00C UC CHE 30B2 O 0DO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NBG 16B 21B2 21R2 23B1 23B2 26R1 7B2 8B 8R2 Number of Observations Read 27 Number of Observations Used 27 UC CHE 30B2 O 0DO The ANOVA Procedure Dependent Variable: InhibitionAbility Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 16738.71301 2092.33913 Error 18 4458.11878 247.67327 Corrected Total 26 21196.83179 8.45 F 2092.33913 112 8.45 F Model 10561.68298 1320.21037 Error 18 985.01321 54.72296 Corrected Total 26 11546.69619 24.13 F 10561.68298 1320.21037 24.13