Đánh giá hiệu quả phòng và trị bệnh của nanochitosan đối với bệnh mốc cam (neurospora crassa) trên nấm bào ngư xám (pleurotus sajor caju)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ HỒNG MAI ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH CỦA NANOCHITOSAN ĐỐI VỚI BỆNH MỐC CAM (Neurospora crassa) TRÊN NẤM BÀO NGƢ XÁM (Pleurotus sajor-caju) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ HỒNG MAI ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH CỦA NANOCHITOSAN ĐỐI VỚI BỆNH MỐC CAM (Neurospora crassa) TRÊN NẤM BÀO NGƢ XÁM (Pleurotus sajor-caju) LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 551/QĐ-ĐHNT ngày 21/6/2017 Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: 22/03/2018 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS NGUYỄN VĂN HÒA PGS.TS TRANG SĨ TRUNG Chủ tịch Hội đồng: PGS.TS Ngơ Đăng Nghĩa Phòng Đào tạo Sau đại học: KHÁNH HỊA - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan kết đề tài: “Đánh giá hiệu phòng trị bệnh nanochitosan bệnh mốc cam (Neurospora crassa) nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor-caju)” cơng trình nghiên cứu thân chƣa công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Khánh Hòa, ngày tháng Tác giả luận văn iii năm LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành luận văn này: Trƣớc hết xin gửi đến Ban Giám hiệu trƣờng đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Ban lãnh đạo Viện CNSH&MT tạo điều kiện tốt cho tơi đƣợc hồn thành nhiệm vụ học tập nghiên cứu Sự biết ơn sâu sắc, kính trọng tơi xin đƣợc giành cho thầy PGS.TS Trang Sĩ Trung TS Nguyễn Văn Hòa tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu lĩnh vực nghiên cứu khoa học suốt thời gian học thực đề tài Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cám ơn! Khánh Hòa, ngày tháng Tác giả luận văn iv năm MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CÁM ƠN .iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG x TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xi MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chitosan 1.1.1 Cấu trúc chitosan 1.1.2 Tính chất chitosan 1.1.3 Ứng dụng chitosan 1.2 Tổng quan nanochitosan 1.2.1 Tính chất nanochitosan 1.2.2 Phƣơng pháp điều chế nanochitosan 10 1.2.3 Ứng dụng nanochitosan 12 1.3 Tổng quan nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor-caju nấm mốc cam Neurospora crassa 17 1.3.1 Nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor -caju (Fr.) Sing 17 1.3.2 Giá trị dƣợc liệu nấm bào ngƣ xám ( Pleurotus sajor-caju) 20 1.3.3 Giá trị dinh dƣỡng nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor-caju) 21 1.3.4 Nấm mốc cam Neurospora crassa 23 1.4 Một số nghiên cứu ngồi nƣớc ứng dụng phòng trị bệnh nấm mốc chitosan nanochitosan 24 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 24 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 25 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Chitosan 26 2.1.2 Giống nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor-caju 26 2.1.3 Nấm mốc cam Neurospora crassa 26 v 2.1.4 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 26 2.1.5 Địa điểm thử nghiệm in vitro in vivo 27 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Điều chế nanochitosan 27 2.2.2 Phân lập định danh loài nấm Neurospora crassa gây bệnh bịch phôi nấm bào ngƣ xám (Pleurotus cajor-sajo) 30 2.2.3 Khảo sát hiệu nanochitosan đến phát triển Neurospora crassa môi trƣờng PGA điều kiện in vitro nồng độ, độ deacetyl khối lƣợng phân tử khác 30 2.2.4 Khảo sát hiệu nanochitosan đến phát triển sinh khối Neurospora crassa môi trƣờng PG điều kiện in vitro nồng độ, độ deacetyl khối lƣợng phân tử khác 31 2.2.5 Khảo sát hiệu nanochitosan đến khả phòng trị bệnh mốc cam Neurospora crassa bịch phơi bào ngƣ xám q trình thể Co, độ DD Mw tốt 32 Phƣơng pháp xử lý số liệu 33 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân lập định danh nấm Neurospora crassa 34 3.2 Ảnh hƣởng nanochitosan đến phát triển Neurospora crassa môi trƣờng PGA điều kiện in vitro nồng độ, độ deacetyl khối lƣợng phân tử khác 35 3.3 Ảnh hƣởng nanochitosan đến phát triển sinh khối Neurospora crassa môi trƣờng PG điều kiện in vitro nồng độ, độ deacetyl khối lƣợng phân tử khác 43 3.4 Khảo sát hiệu nanochitosan+Ag+có DD >90% Mw=1,5.106 kDa nồng độ 150ppm đến khả phòng trị bệnh mốc cam bịch phơi bào ngƣ xám q trình thể 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT PG : Potatoes Glucose CTS : Chitosan KLPT : Khối lƣợng phân tử PGA : Potatoes Glucose Agar Mw : Molecular weight (Khối lƣợng phân tử) kDa DD : Degree of Deacetylation (Độ deacetyl) MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu C0 : Concentration (Nồng độ) MBC : Nồng độ ức chế tối đa CNP : Chitosan nanoparticiples (Hạt nanochitosan) TPP : Tripolyphosphate PSP : Polysaccharide peptide PSK : Polysacccharide krestin PPO : Polyphenol oxidase POD : Peroxidase E.coli : Escherichia coli S.typhimurium : Staphylococcus typhimurium S.choleraesuis : Salmonella choleraesuis S.aureus : Staphylococcus aureus N.crassa : Neurospora crassa P.sajor - caju : Pleurotus sajor – caju vii : Kilo Dalton DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học chitosan Hình 1.2 Minh họa chế hấp thu dƣỡng chất 15 Hình 1.3 Ảnh hiển vi nguyên tử lực (AFM) tế bào S.choleraesuis sau xử lý với nanochitosan theo thời gian Chƣa xử lý (A), xử lý 30 phút (B), xử lý (C), xử lý 1,5 (D), xử lý (E), xử lý (F) 17 Hình 1.4 Nấm bào ngƣ xám Pleurotus sajor – caju 19 Hình 2.1 Chitosan DD Mw khác 26 Hình 2.2 Sơ đồ tạo hạt phƣơng pháp tạo gel ion 27 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm điều chế nanochitosan 28 Hình 2.4 Nanochitosan có DD=70-80% Mw=2,3.106KDa 28 Hình 2.5 Nanochitosan có DD=80-90% Mw=1,5.106KDa 28 Hình 2.6 Nanochitosan có DD>90% Mw= 2,3.106KDa 29 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nanochitosan có Co, DD M w hiệu 31 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nanochitosan có Co, DD M w hiệu 32 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc mơi trƣờng PGA hình thái hệ sợi, bào tử dƣới kính hiển vi 34 Hình 3.2 Kết chạy điện di giải trình tự nucleotide nấm N.crassa 34 Hình 3.3 So sánh ảnh hƣởng tới tốc độ lan tơ nồng độ 10 môi trƣờng nuôi cấy phƣơng pháp Tukey 39 Hình 3.4 Trung bình đƣờng kính lan tơ cho nồng độ mơi trƣờng, 39 Hình 3.5 Sự phát triển hệ sợi nấm Neurospora crassa mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan+Ag+ DD, Mw khác nồng độ 150ppm 41 Hình 3.6 Sự phát triển hệ sợi nấm Neurospora crassa mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan DD, Mw khác nồng độ 50ppm 41 Hình 3.7 Thử nghiệm vòng kháng mơi trƣờng PGA sử dụng nanochitosan DD>90%, Mw=1,5.106 kDa nồng độ 150ppm 43 Hình 3.8 Sinh khối nấm nồng độ khác mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan+Ag+ có DD=70-80% Mw=2,3.106kDa 46 viii Hình 3.9 Sinh khối nấm nồng độ khác mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan +Ag+ có DD=80-90% Mw=1,7.106 kDa 47 Hình 3.10 Sinh khối nấm nồng độ khác mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan +Ag+ có DD>90% Mw=1,5.106 kDa 47 Hình 3.11 Sự phát triển sinh khối nấm Neurospora crassa mơi trƣờng PG có bổ sung loại nanochitosan nồng độ 50ppm 48 Hình 3.12 Sự phát triển sinh khối nấm Neurospora crassa mơi trƣờng PG có bổ sung loại nanochitosan+Cu2+ nồng độ 50ppm 48 Hình 3.13 Sự phát triển sinh khối nấm Neurospora crassa mơi trƣờng PG có bổ sung loại nanochitosan+Ag+ nồng độ 50ppm 49 Hình 3.14 So sánh năm nồng độ 10 môi trƣờng phƣơng pháp Tukey 49 Hình 3.15 Trung bình phát triển sinh khối cho nồng độ mơi trƣờng PG có bổ sung loại nanochitosan 50 Hình 3.16.Trại nấm bị nhiễm bệnh mốc cam Neurospora crassa 52 Hình 3.17 Gây bệnh mốc cam bịch bào ngƣ xám điều trị nanochitosan+Ag+ có DD >90% Mw=1,5.106 kDa 52 Hình 3.18 Khối lƣợng nấm thu đƣợc nhóm bịch phơi gây bệnh đƣợc điều trị nanochitosan+Ag+ có DD>90% Mw=1,5.106 kDa nhóm bịch phơi khơng bệnh 55 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các dung mơi thƣờng sử dụng để hòa tàn chitosan Bảng 1.2 Một số ứng dụng chitosan thực phẩm Bảng 1.3 Chỉ số MIC (µg/ml) MBC (µg/ml) chitosan, nanochitosan 16 Bảng 1.4 Một số chất khoáng nấm bào ngƣ nấm rơm (mg/100g nấm khô) 22 Bảng 2.1 Bảng đo thơng số đánh giá tính chất nanochitosan 29 Bảng 3.1 Tóm lƣợc số liệu thí nghiệm tốc độ lan tơ nấm mốc Neurospora crassa 36 Bảng 3.2 Phân tích phƣơng sai khác biệt nồng độ môi trƣờng đến tốc độ lan tơ 37 Bảng 3.3 Bảng phân tích phƣơng sai tƣơng tác hai yếu tố nồng độ mơi trƣờng 38 Bảng 3.4 Tóm lƣợc số liệu thí nghiệm phát triển sinh khối nấm Neurospora crassa 44 Bảng 3.5 Bảng phân tích phƣơng sai khác biệt nồng độ mơi trƣờng PG có bổ sung loại nanochitosan đến phát triển sinh khối 45 Bảng 3.6 Phân tích phƣơng sai tƣơng tác hai yếu tố nồng độ môi trƣờng 46 Bảng 3.7 Khối lƣợng nấm bào ngƣ xám thu đƣợc bịch phôi gây bệnh đƣợc điều trị nanochitosan+Ag+ có DD>90% Mw=1,5.106 kDa nhóm bịch phôi không gây bệnh 53 Bảng 3.8 Bảng phân tích phƣơng sai khác biệt suất nấm thu đƣợc 54 x PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thiết bị sử dụng Phụ lục 2: Kết phân tích phần mềm thống kê R P6.8 Bảng phân tích phƣơng sai hai chiều ảnh hƣởng nhiệt độ độ ẩm tới phát triển sinh khối nấm Neurospora crassa mơi trƣờng PGA có bố sung loại nanochitosan P6.9 Bảng phân tích phƣơng sai hai chiều ảnh hƣởng nhiệt độ độ ẩm tới tốc độ lan tơ nấm Neurospora crassa mơi trƣờng PGA có bố sung loại nanochitosan P6.10 Bảng phân tích tƣơng tác nồng độ vật liệu lên lan tơ, phát triển sinh khối nấm mốc Neurospora crassa P6.11 Bảng so sánh khác biệt nồng độ 10 loại môi trƣờng lên tốc độ lan tơ nấm Neurospora crassa hàm Tukey HSD với aov P6.12 Bảng so sánh khác biệt nồng độ 10 loại môi trƣờng lên phát triển sinh khối nấm Neurospora crassa hàm Tukey HSD với aov Phụ lục 3: Kết phân tích thí nghiệm Bảng P6.13 Kí hiệu viết tắt loại mơi trƣờng có bổ sung loại nanochitosan khác Môi trƣờng STT Môi trƣờng PGA Mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan có DD=70-80% Mw=2,3106kDa Mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan+Cu2+ có độ DD=70-80% Mw=2,3.106kDa Mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan+Ag+ có độ DD=70-80% Mw=2,3.106kDa Mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan có độ DD=80-90% Mw=1,7.106kDa Mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan+Cu2+ có độ DD=80-90% Mw=1,7.106kDa Mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan+Ag+ có độ DD=80-90% Mw=1,7.106kDa Mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan có độ DD>90% Mw=1,5.106kDa Mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan+Cu2+ có độ DD>90% Mw=1,5.106kDa 10 Mơi trƣờng PGA có bổ sung nanochitosan+Ag+ có độ DD=80-90% Mw=1,5.106kDa P6.14.Bảng số liệu đƣờng kính lan tơ (cm) nấm N.crassa môi trƣờng Môi trƣờng 1(PGA) 2(PGA+1) 3(PGA+2) 4(PGA+3) 5(PGA+4) 6(PGA+5) 7(PGA+6) 8(PGA+7) 9(PGA+8) 10(PGA+9) 50ppm 5.8 6 5.7 5.8 5.7 5.3 5.5 5.5 5.4 5.4 5.3 5.9 4.5 4.5 4.3 3.3 4.2 4.5 4.5 5.2 4.2 4.5 3.6 3.7 4.5 75ppm 5.8 6 5.6 5.5 5.7 5.2 5.4 5.3 5.1 5 5.5 4.6 4.5 3.5 3.8 4.5 4.5 4.5 4.7 3.9 4.3 4.5 3.3 3.7 100ppm 6 5.5 5.2 4.9 5.1 4.9 4.5 4.7 4.4 4.5 3.4 4.2 2.9 3.5 3.8 4.1 4.3 3.5 3.7 4.2 2.5 2.7 2.9 125ppm 5.9 4.5 4.3 4.5 4.8 4.7 4.5 4.7 4.4 4 4.4 4.2 3.7 3.2 2.8 3.5 3.5 3.9 2.1 3.5 0.2 1.25 150ppm 6 2.5 2.7 3.4 2.5 2.9 1.8 2.3 2.5 2.6 2.5 2.7 2.5 1.3 1.9 2.5 2.1 1.5 1.6 0 0.3 P6.15 Bảng số liệu sinh khối thu đƣợc (mg) môi trƣờng khác Môi trƣờng 1(PGA) 2(PGA+1) 3(PGA+2) 4(PGA+3) 5(PGA+4) 6(PGA+5) 7(PGA+6) 8(PGA+7) 9(PGA+8) 10(PGA+9) 50ppm 75ppm 2,21 2,01 1,59 1,70 1,57 1,46 1,46 1,55 1,52 1,40 1,13 1,34 1,27 1,32 1,05 0,75 1,18 1,38 0,81 1,14 1,18 1,37 1,05 1,19 0,70 0,78 0,49 0,48 0,49 0,91 100ppm 2,21 2,01 1,59 1,51 1,58 1,38 1,30 1,52 1,04 1,13 1,40 1,08 1,43 0,90 1,01 0,11 1,02 1,43 1,08 0,52 0,32 1,24 0,85 1,06 0,61 0,63 0,44 0,45 0,49 0,08 2,21 2,01 1,59 1,01 1,24 1,04 1,03 1,22 1,02 0,67 0,55 0,93 1,53 0,18 0,65 0,03 0,01 0,05 0,05 0,006 0,43 0,54 0,34 1,16 0,04 0,15 0,003 0,0001 0,0002 125ppm 150ppm 2,21 1,98 0,54 1,03 1,04 0,85 0,28 0,65 0,45 0,50 0,41 0,05 0,39 0,13 0 0 0 0,25 0,46 0,03 0 0 0 2,2 1,8 1,76 0,88 0,14 0,59 0,57 0,09 0,07 0,17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ HỒNG MAI ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH CỦA NANOCHITOSAN ĐỐI VỚI BỆNH MỐC CAM (Neurospora crassa) TRÊN NẤM BÀO NGƢ XÁM (Pleurotus. .. Nghĩa Phòng Đào tạo Sau đại học: KHÁNH HÒA - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: Đánh giá hiệu phòng trị bệnh nanochitosan bệnh mốc cam (Neurospora crassa) nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor- caju) ... 1.3.3 Giá trị dinh dƣỡng nấm bào ngƣ xám (Pleurotus sajor- caju) 21 1.3.4 Nấm mốc cam Neurospora crassa 23 1.4 Một số nghiên cứu ngồi nƣớc ứng dụng phòng trị bệnh nấm mốc chitosan nanochitosan