Mặc dù có vai trò quan trọng với các hoạt động sinh lý nhưng việc sản sinh không kiểm soát IL-6 lại liên quan đến các bệnh viêm miễn dịch IMID bao gồm cả bệnh viêm khớp dạng thấp rheumat
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
Người thực hiện: Đinh Gia Khánh
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING PHÂN TỬ TRONG SÀNG LỌC TÌM KIẾM
HỢP CHẤT ỨC CHẾ THỤ THỂ INTERLEUKIN - 6 HƯỚNG ĐIỀU TRỊ
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành
tới TS Lê Thị Thu Hường, công tác tại bộ môn Dược liệu và Dược học cổ
truyền - khoa Y Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội là người thầy tận tình chỉ bảo, động viên, hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn
Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Phạm Thế Hải công tác tại Trường Đại
học Dược Hà Nội đã chỉ bảo tận tình cho tôi từ những bước đi ban đầu khi nhận đề tài
Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được làm khóa luận, được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại Khoa suốt 5 năm học qua
Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và bạn bè luôn sát cánh, đồng hành, ủng hộ động viên tôi trong quá tình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn
Dù đã rất cố gắng nhưng kiến thức, kỹ năng và thời gian thực hiện còn hạn hẹp, tôi khó tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn
Tôi xin chân thành cảm ơn
Hà Nội, Ngày 30 tháng 4 năm 2018
Sinh Viên
Đinh Gia Khánh
Trang 3DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
CRP C-reactive protein Protein phản ứng C
FDA Food and Drug Administation Cơ quan Quản lý Thực
phẩm và Dược phẩm Hoa
Kỳ
GA Genetic Algorithm Thuật giải di truyền
HBA Hydro bond acceptor Trung tâm nhận liên kết
hydro
HBD Hydro bond donor Trung tâm cho liên liên
kết hydro HTS High throughput screening Sàng lọc thông lượng cao IL-6 Interleukin 6 Interleukin 6
IL-6R Interleukin 6 receptor Thụ thể Interleukin 6
MIL-6R membrane-bound Interleukin
6 receptor
Thụ thể Interleukin 6 bám màng tế bào
MW Molecular weight Khối lượng phân tử
RA Rheumatoid Arthritis Viêm khớp dạng thấp
Trang 4SIL-6R soluble Interleukin-6 receptor Thụ thể Interleukin 6 dạng
Trang 5DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Cơ chế bệnh sinh viêm khớp dạng thấp 4
Hình 1.2: Hai con đường kích hoạt phản ứng viêm của IL-6 5
Hình 1.3: Cấu trúc 3 chiều (3D) của phức hợp 6 với thụ thể của nó Hai
IL-6 (xanh tím đậm, hồng), hai IL-IL-6R (xanh dương, xám) tạo phức hợp với vùng màng ngoài của cấu trúc hai protein gp130 (xanh lá,vàng) 5
Hình 1.4: Các quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc 7
Hình 2.1: Phân tích protein 1 ALU về cấu trúc hình học so với IL-6 phản ánh
qua màu sắc trên Ngân hàng dữ liệu protein Châu Âu (https://www.rcsb.org/)12
Hình 2.2: Hình ảnh 3D của protein 1ALU 13
Hình 3.1: Minh họa kết quả sàng lọc 16
Hình 3.2: Minh hoạ hai chiều tương tác của Madindoline A trong trung tâm hoạt động của IL-6 17
Hình 3.3: Minh họa 2 chiều tương tác của (-)-Hydnocarpin trong trung tâm hoạt động của IL-6 24
Hình 3.4: Minh họa 2 chiều tương tác của 24-methylene diol trong trung tâm hoạt động của IL-6 25
cycloartane-3β,21-Hình 3.5: Minh họa 2 chiều tương tác của 7,24-dien-26-oic acid trong trung tâm hoạt động của Il-6 26
20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta-Hình 3.6: Minh họa 2 chiều tương tác của 3,6,7-Tri-O-acetyl-α-mangostin trong trung tâm hoạt động của Il-6 27
Hình 3.8: Minh họa 2 chiều tương tác của 3-epibartogenic acid trong trung tâm hoạt động của IL-6 29
Hình 3.9: Minh họa 2 chiều tương tác của 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid trong trung tâm hoạt động của IL-6 30
Hình 3.10: Minh họa 2 chiều tương tác của 6-O-benzoyl-α-mangostin trong trung tâm hoạt động của Il-6 31
Hình 3.11: Minh họa 2 chiều tương tác của glucopyranoside trong trung tâm hoạt động của IL-6 32
9-hydroxycanthin-6-O-Hình 3.12: Minh họa 2 chiều tương tác của apigenin 7-O-β-D-glucosid trong trung tâm hoạt động của IL-6 33
Trang 6DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Kết quả phân tích dữ liệu docking phân tử 18
Bảng 3.2 Tính toán các thông số hoá lý trong quy tắc 5 Lipinski của 10 hợp chất được chọn 22
Trang 7MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH VẼ
DANH MỤC BẢNG
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 3
1.1 Tổng quan về bệnh viêm khớp dạng thấp 3
1.2 Tổng quan về Interleukin-6 4
1.2.1 Sợ lược về IL-6 4
1.2.2 Vai trò của IL-6 đối với bệnh viêm khớp dạng thấp 5
1.2.3 Trung tâm hoạt động và cơ chế ức chế Interleukin-6 7
1.3 Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc 7
1.4 Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc 8
1.5 Phương pháp Docking 9
1.5.1 Đại cương về phương pháp Protein docking 9
1.5.2 Quy trình Docking 10
CHƯƠNG 2- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu 12
2.2 Nội dung nghiên cứu: 13
2.3 Phương pháp nghiên cứu 14
2.3.1 Sàng lọc bằng quy tắc 5 của Lipinski 14
2.3.2 Sàng lọc bằng Docking 14
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 16
3.1 Kết quả sàng lọc bằng quy tắc số 5 của Lipinski 16
3.2 Sàng lọc docking 16
3.3 Chọn 10 hợp chất tốt nhất từ kết quả Docking 18
3.4 Đặc điểm hoá lý của các hợp chất được chọn 22 3.5 Đặc điểm chi tiết từng chất theo tương tác với Interleukin-6 và thông
Trang 8CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 35
4.1 Về kết quả 35
4.2 Về phương pháp 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
Trang 9ĐẶT VẤN ĐỀ
Interleukin-6 (IL-6) là một cytokine đa chức năng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch và gây ra các phản ứng cấp tính Mặc dù có vai trò quan trọng với các hoạt động sinh lý nhưng việc sản sinh không kiểm soát IL-6 lại liên quan đến các bệnh viêm miễn dịch IMID bao gồm cả bệnh viêm khớp dạng thấp (rheumatoid arthritis, RA) [25], do đó ức chế IL-6 có thể được xem là một hướng đi đầy tiềm năng trong điều trị bệnh RA Madindoline A là hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế chọn lọc IL-6, nhưng khó phát triển thành thuốc do sự khan hiếm nguồn nguyên liệu cùng với quá trình sản xuất phức tạp, tốn kém [17] Thuốc điều trị
RA hiện nay nhiều tác dụng phụ và đắt tiền, đó là lý do giới nghiên cứu hiện rất quan tâm đến các thuốc có nguồn gốc tự nhiên cho điều trị RA
Nguồn thực vật phong phú và cây thuốc Việt Nam được xác định có chứa các hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý và cũng là nguồn nguyên liệu quý
để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế IL-6 Do số lượng các hợp chất tự nhiên rất lớn, nhằm tiết kiệm và nâng cao hiệu quả tìm kiếm, các phương pháp sàng lọc hiệu năng cao sử dụng máy tính đã trở thành một công cụ rất hữu ích hỗ trợ quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới Trong đó, docking là một trong những phương pháp phổ biến nhất Phương pháp này dựa trên cấu trúc đích phân
tử để dự đoán, với độ chính xác khá cao, sự hình thành liên kết của cấu tử (các chất cần sàng lọc) với đích phân tử của nó (thường có bản chất là protein) Nhờ
đó, chúng ta tìm được vị trí và cấu hình phù hợp nhất để cơ chất gắn kết với protein
Từ các phân tích nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khóa luận “Ứng dụng phương pháp docking phân từ trong sàng lọc tìm kiếm hợp chất ức chế thụ thể Interleukin-6 hướng điều trị viêm khớp dạng thấp” với 2 mục tiêu chính:
1 Sàng lọc và tìm kiếm hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế IL-6 bằng phương pháp docking
Trang 102 Nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất tốt nhất, thu được sau quá trình sàng lọc, thông qua chỉ số hóa lý của cấu trúc và đặc điểm của cây dược liệu
Trang 11CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về bệnh viêm khớp dạng thấp
Rheumatoid arthritis (RA) là bệnh viêm khớp mạn tính phổ biến với đặc trưng là viêm đa khớp, gây tê cứng khớp, đau và sưng và có thể tổn thương cơ quan khác Theo thống kê, hàng năm ở nước ta có khoảng 750 – 800 người mới mắc bệnh viêm đa khớp dạng thấp trên một triệu dân từ 15 tuổi trở lên Tỷ lệ mắc bệnh là 0,5% dân số, trong đó 80% là nữ giới Mặc dù ta không xác định được nguyên nhân chính xác gây ra bệnh viêm khớp dạng thấp, bệnh được coi là
có tính chất di truyền [18]
Bệnh viêm khớp dạng thấp hiện nay được cho là bệnh tự miễn [23] Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ được các tế bào trình diện kháng nguyên (đại thực bào, các tế bào đuôi gai, tế bào diệt tự nhiên) nhận biết, sau đó được trình diện cho các tế bào lympho T và B Các tế bào lympho T CD4 (T help) được kích hoạt và sản xuất ra các lymphokin (Inteleukin-4,10,13), các lymphokin này sẽ kích thích các tế bào lympho B tăng sinh và biệt hoá thành các tương bào và sản xuất ra các globulin miễn dịch là các thể tự kháng
Tại màng hoạt dịch khớp có tình trạng lắng đọng phức hợp miễn dịch kháng nguyên – kháng thể, do đó có thực bào xuất hiện với sự hiện diện của các bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào, tế bào mastocyt Sau đó, chính các tế bào này lại tiết ra các cytokin khác như TNF-α, IL-1,2,6, interferon, yếu tố phát triển nội mạc mạch máu (VEGF) và các yếu tố hoá ứng động khác tạo vòng xoắn bệnh lý thúc đẩy quá trình viêm Sự tăng sinh mạch dưới tác dụng của VEGF cùng sự xâm nhập một loạt các tế bào viêm khác hình thành nên màng mạch (mảng pannus) Mảng pannus xâm lấn vào đầu xương, sụn khớp và các enzym tiêu huỷ tổ chức do các tế bào viêm giải phóng như stromelysin, elastase, collagenase cùng sự xâm nhập các nguyên bào xơ gây phá huỷ khớp, dính khớp và hậu quả là tàn tật [2] Như vậy có sự tham gia của cả miễn dịch dịch thể (tạo thành phức hợp miễn dịch) và miễn dịch tế bào (giải phóng ra các cytokin thực hiện phản ứng viêm và phá hủy khớp), trong đó lympho T đóng vai trò
Trang 12trung tâm Dựa trên sự hiểu biết về cơ chế bệnh sinh này, các nhà khoa học đã nghiên cứu ra các thuốc kích hoạt hoặc sửa chữa hệ miễn dịch thông qua ức chế từng loại tế bào, từng loại cytokin để khống chế tình trạng viêm của bệnh
Hình 1.1: Cơ chế bệnh sinh viêm khớp dạng thấp 1.2 Tổng quan về Interleukin-6
1.2.1 Sợ lƣợc về IL-6
IL-6 là một glycopeptide 26 kDa có gen mã hóa được tìm thấy trên nhiễm sắc thể số 7, gồm có 212 axit amin được bố trí trong bốn chuỗi α Nó được tạo ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau, như tế bào T, tế bào B, bạch cầu đơn nhân, nguyên bào sợi, tế bào nội mô và một số tế bào khối u [27]
IL-6 được tìm thấy nhiều ở dịch ổ khớp của bệnh nhân RA và là nguyên nhân chính cho nhiều tác dụng tại chỗ và toàn thân ở bệnh này IL-6 kết hợp trưc
tiếp với phức hợp thụ thể màng IL-6 (membrane-bound Interleukin 6 receptor –
MIL-6R) và glycoprotein-130 dẫn tới hoạt hóa tế bào viêm như đại thực bào và
bạch cầu trung tính từ đó kích hoạt các phản ứng viêm, gây hủy hoại sụn khớp, xương IL-6 cũng có khả năng hoạt hóa các tế bào không có thụ thể màng IL-6 miễn có chứa phổ biến thụ thể gp-130 Cơ chế này liên quan tới thụ thể dạng hòa
tan của IL-6 (soluble Interleukin-6 receptor – SIL-6R) Sự gia tăng nồng độ IL-6
Trang 13cũng như nồng độ thụ thể IL-6 dạng hòa tan có liên quan đến mức độ trầm trọng
và sự tiến triển của bệnh[2, 11]
Hình 1.2: Hai con đường kích hoạt phản ứng viêm của IL-6
Hai con đường truyền tín hiệu kích hoạt phản ứng viêm của IL-6: Truyền tín
hiệu cổ điển (classical signalling) qua màng tế bào với vai trò của MIL-6R Truyền tín hiệu chuyển tiếp (trans-signalling) thông qua SIL-6R [27]
Hình 1.3: Cấu trúc 3 chiều (3D) của phức hợp IL-6 với thụ thể của nó Hai IL-6 (xanh tím đậm, hồng), hai IL-6R (xanh dương, xám) tạo phức hợp với vùng màng ngoài của cấu trúc hai protein gp130 (xanh lá,vàng) 1.2.2 Vai trò của IL-6 đối với bệnh viêm khớp dạng thấp
RA được đặc trưng bởi sự gia tăng yếu tố dạng thấp (kháng thể IgM và
Trang 14kháng thể này chứng tỏ ức chế tế bào B là một phương hướng điều trị bệnh RA IL-6 cũng được xác định là một yếu tố biệt hóa của tế bào B, ảnh hưởng đến quá trình phát triển của nó [2]
Trong pha viêm cấp tính trong của bệnh RA, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào và các tế bào nội mô giải phóng IL-6, kèm theo tăng bạch cầu trung tính tại dịch khớp Bạch cầu trung tính có khả năng giải phóng các enzym phân giải protein và chất trung gian nên có vai trò quan trọng trong hiện tượng viêm và phá hủy khớp ở bệnh RA IL-6 tác động trực tiếp trên bạch cầu trung tính qua thụ thể của IL-6 tại màng tế bào Đã có bằng chứng ghi nhận, việc ức chế IL-6 sẽ ngăn chặn sự bám dính của bạch cầu trung tính Khi bệnh tiến triển, sự chuyển từ viêm cấp tính sang viêm mạn tính có ảnh hưởng do IL-6 tác động lên bạch cầu trung tính [2]
Nồng độ IL-6 tăng cao trong màng hoạt dịch của bệnh nhân RA có liên quan đến mức độ tăng lên của phản ứng viêm và tình trạng phá hủy khớp.Tổn thương khớp trong RA được đặc trưng bởi tổn thương bào mòn xương tại vị trí bám của màng hoạt dịch và hẹp khe khớp Trong nghiên cứu trên người và động vật, tổn thương này được xác định là do hủy cốt bào gây ra IL-6 gây tăng số lượng hủy cốt bào bằng cách tác động vào các tế bào gốc tạo máu từ các bạch cầu hạt, đại thực bào dòng hạt [2]
Các phản ứng ở giai đoạn cấp tính, bao gồm sự phóng thích các cytokine tiền viêm và tăng protein pha viêm cấp tính Protein pha viêm cấp tính được sản xuất trong gan (ví dụ như CRP) và IL-6 là một yếu tố chính kích thích gan thực hiện quá trình này Ở bệnh nhân RA, nồng độ IL-6 huyết thanh tương quan với nồng độ CRP và hiện nay IL-6 dễ dàng định lượng được nhờ đánh giá nồng độ CRP trong dịch sinh học Nồng độ CRP được sử dụng như một dấu hiệu sinh học của tình trạng viêm và đánh giá mức độ bệnh [2]
Từ những dẫn chứng trên, có thể thấy ở bệnh nhân viêm khớp dạng thấp, các triệu chứng toàn thân hay tại chỗ trên các khớp xương có thể được giải thích bởi tác động của IL-6 Do đó ức chế IL-6 là một mục tiêu hợp lý để điều trị RA [2, 11]
Trang 151.2.3 Trung tâm hoạt động và cơ chế ức chế Interleukin-6
Khi xuất hiện đột biến mất đoạn với những protein IL-6 thử nghiệm, tất cả các protein không có hoạt động về mặt sinh học Sau đó tiến hành phản ứng miễn dịch với một bộ kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng IL-6, cho thấy chỉ có đột biến mất đoạn ở các trình tự 177, 178 và 179 là không gây ra sự thay đổi đáng kể trong cấu trúc nếp gấp Tức là các đột biến mất đoạn này không làm mất đi cấu trúc không gian 3 chiều của protein IL-6 Khi IL-6 có đột biến mất đoạn tại trình
tự 177, 178, 179 thì nó vẫn giữ được hoạt tính sinh học liên quan đến cấu trúc 3 chiều của protein Cùng với đó, quan sát thấy rằng protein IL-6 có đột biến mất đoạn ở bộ 3 trình tự acid amin 177-179 không thể cạnh tranh với protein IL-6 (còn đủ trình tự polypeptide) để liên kết với thụ thể hòa tan SIL-6R, điều này gợi
ý rằng có 1,2 hoặc cả 3 acid amin trên có thể tham gia vào vị trí liên kết giữa
IL-6 với thụ thể hòa tan SIL-IL-6R Bằng cách tạo ra nhiều đột biến thay thế acid amin
ở từng vị trí 177, 178 và 179 kết quả cho thấy Arg179 đóng vai trò quan trọng đối với hoạt động ở tế bào chuột Sự thay thế duy nhất mà giữ nguyên hoạt tính ở
vị trí 179 là từ Arg thành Lys chứng tỏ vai trò quan trọng của điện tích dương ở
vị trí 179 cho sự liên kết của IL-6 với thụ thể của nó [12] Từ đây có thể kết luận, Arginine ở vị trí 179 đóng vai trò quan trọng, nhắm vào vị trí đặc biệt này trong cấu trúc chuỗi polypeptide IL-6 sẽ làm suy giảm hoạt động bình thường của IL-6 [32]
1.3 Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc
Quá trình nghiên cứu và phát triển thường được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm hiện nay được minh họa như hình dưới đây:
Hình 1.4: Các quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc
Lead
Lựa chọn chất ứng cử làm thuốc
Thử nghiệm lâm sàng pha I,II,III
Trang 16Lựa chọn mục tiêu là chọn một mục tiêu cụ thể, được giả thuyết là có vai trò quan trọng với mục đích điều trị bệnh đã được nhắm đến cho chương trình phát triển thuốc Các mục tiêu phân tử thường là một thụ thể, một enzyme hoặc một phân tử tương tự như vậy [14]
Xác định hợp chất Hit là việc tìm ra các phân tử có tác dụng mong muốn
trong một hoặc nhiều thử nghiệm ban đầu Những thử nghiệm này sẽ giúp dự đoán được các tác dụng dược lý đang mong đợi Xác định hợp chất Hit thường
được tiến hành bằng sàng lọc thông lượng cao (High Throughput Screening -
HTS), với các thư viện hợp chất lớn, 105-106 phân tử, được kiểm tra bằng thực
nghiệm Các hợp chất Hit có tác dụng ở bước này tiếp tục trở thành hợp chất
khởi đầu cho các khám phá mở rộng hơn về hóa dược ở giai đoạn xác định và tối
ưu hóa hợp chất dẫn đường (Lead) Khi quá trình này diễn ra, càng có nhiều
thông tin về tính chất dược lực học và dược động học của các hợp chất được phát hiện Việc xác thực giả thuyết dược lý ban đầu, cùng với đặt ra nghi vấn trong giai đoạn lựa chọn mục tiêu, là hai quá trình tiến hành song song Cuối cùng, ứng
cử viên làm thuốc là hợp chất duy nhất còn lại hội đủ các yêu cầu và được đưa đi tiến hành các thử nghiệm lâm sàng [14]
Việc sử dụng mô hình phân tử trong xác định hợp chất Hit được gọi là
sàng lọc ảo Điều này được sử dụng cả cho thiết kế bộ hợp chất để sàng lọc trong HTS và dự đoán các bộ hợp chất nhỏ hơn để kiểm tra với các thử nghiệm với thông lượng thấp hơn [10]
1.4 Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc
Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc (Structure-Based Virtual Screening - SVBS)
là dự đoán các hợp chất liên kết với protein đích thông qua các phương pháp tính toán, sử dụng các hiểu biết về cấu trúc 3D của đích phân tử
Cách tiếp cận cơ bản của SVBS là dự đoán cấu dạng liên kết của từng
phân tử nhỏ trong thư viện dữ liệu (docking), và từ đó dự đoán năng lượng tự do của phân tử đó khi liên kết (scoring) Các hợp chất Hit sau đó được dự đoán bằng cách sắp xếp tất cả các hợp chất trong thư viện bằng cách tính điểm (score),
Trang 17và quyết định một điểm ngưỡng Hợp chất có điểm tốt hơn điểm ngưỡng được
coi là hợp chất Hit, sau đó sẽ đánh giá thêm [14]
1.5 Phương pháp Docking 1.5.1 Đại cương về phương pháp Protein docking
Docking là một trong những phương pháp phổ biến nhất dùng trong quá trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc vì có khả năng dự đoán với độ chính xác khá cao sự hình thành liên kết của cấu tử với thụ thể trong túi liên kết Ra đời từ những năm 1980 [22], docking phân tử đã trở thành một công cụ thiết yếu trong nghiên cứu và phát triển thuốc Không những chỉ ra các liên kết có ý nghĩa, docking còn có thể định lượng khả năng liên kết bởi các hàm tính điểm, qua đó phân hạng khả năng liên kết mạnh yếu của các cấu tử [22]
Docking trở thành một bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhất của một cơ chất gắn kết lên protein Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu chính của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ là thấp nhất Để tìm cấu hình phù hợp nhất, cần liên hệ cấu hình không gian với các trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toán tìm kiếm [20]
Thuật giải di truyền (Genetic Algorithm - GA) là thuật toán tìm kiếm được
ứng dụng nhiều trong các chương trình docking như Autodock, Autodock Vina, GOLD [24, 30] GA áp dụng các lí thuyết liên quan đến học thuyết tiến hoá và chọn lọc tự nhiên Đầu tiên, thuật toán sẽ mã hoá tất cả các tham số của cấu trúc ban đầu trong “một nhiễm sắc thế” - biểu diễn bằng một véc tơ Từ “nhiễm sắc thể” ban đầu này, tạo ngẫu nhiên một quần thể bao phủ một miền năng lượng Quần thể này được đánh giá và từ đó các “nhiễm sắc thể” thích nghi nhất (tức là
có giá trị năng lượng thấp nhất) được chọn làm khung để tạo ra quần thể tiếp theo Quy trình này làm giảm năng lượng trung bình của toàn bộ “nhiễm sắc thể” bằng cách truyền các đặc tính cấu trúc thuận lợi từ một quần thể này sang một quần thể khác Sau một số chu kỳ tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng ta sẽ tìm được một “nhiễm sắc thể” (cấu dạng) phù hợp với mức năng lượng tối thiểu [21]
Trang 18Chương trình docking sử dụng các hàm tính điểm (scoring function) để
ước lượng các năng lượng liên kết của phức hợp cấu tử - receptor Năng lượng này được cho bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔGL), đơn vị
là kCal/mol Dự đoán về năng lượng liên kết được thực hiện bằng cách đánh giá những tương tác hóa lý quan trọng bao gồm: các tương tác liên phân tử, các ảnh hưởng solvat và entropy [15] Do đó, số lượng các tham số hoá lý được đánh giá càng lớn thì độ chính xác càng cao Tuy nhiên, nếu số lượng biến càng lớn thì thời gian tính toán sẽ lâu Các hàm tính điểm hiệu quả nên đưa ra sự cân bằng giữa độ chính xác và tốc độ, đây là một điểm quan trọng khi làm việc với cơ sỡ
dữ liệu lớn
1.5.2 Quy trình Docking
Quá trình docking được thực hiện thông qua ba bước: chuẩn bị cấu tử, chuẩn bị protein, mô phỏng docking
Chuẩn bị cấu tử: cấu trúc các cấu tử có thể được lấy từ hệ thống dữ liệu
có sẵn như Pubchem, Zinc [13, 19] Trong trường hợp không có sẵn, chúng ta có thể xây dựng cấu trúc cấu tử bởi các phần mềm như ChemDraw, Chemsketch… Sau khi xây dựng được cấu trúc 3D, sử dụng các phần mềm để chuẩn bị cấu tử cho chương trình mô phỏng docking, các bước chuẩn bị thường được tiến hành gồm: gắn hydro, gắn trường lực, xây dựng file pdbqt
Chuẩn bị protein: Cấu trúc 3D của protein thường có sẵn trên ngân hàng
dữ liệu protein (protein data bank) Trong trường hợp chưa có sẵn, chúng ta có thể xây dựng cấu trúc 3D theo phương pháp mô phỏng tính tương đồng
(homology modeling) [31] Sau khi có cấu trúc 3D, sử dùng các phần mềm để
chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking Các bước chuẩn bị thường gồm: loại nước và các cấu tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực và xây dựng file pdbqt
Mô phỏng docking: Trước khi phần mềm tiến hành tìm kiếm vị trí và cấu
dạng phù hợp của cấu tử, cần khoanh vùng tìm kiếm (grid box) cho thuật toán Kích thước của vùng tìm kiếm không nên quá lớn vì như thế sẽ tốn kém thời gian và độ lặp lại không cao, cũng không nên quá nhỏ vì như vậy phần mềm chỉ
Trang 19tìm kiếm được một vùng rất nhỏ, không có ý nghĩa Vị trí của vùng tìm kiếm thông thường sẽ được đặt ở trung tâm hoạt động của protein Sau khi xác định vị trí và kích thước của vùng tìm kiếm, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm và đưa ra cấu dạng phù hợp với năng lượng thấp nhất Cấu dạng này cùng với các tương tác của nó với protein sẽ được phân tích bởi các phần mềm chuyên dụng như: MOE, Pymol, Discovery studio…
Trang 20CHƯƠNG 2- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
Mật độ electron ảnh hưởng đến dạng hình học của cấu trúc tinh thể tia X
vì từ mật độ electron có thể xác định tọa độ các nguyên tử Từ đó có thể dựng cấu trúc của protein Theo như hình trên thì màu sắc phản ánh mối quan hệ giữa mật độ electron và dạng hình học Màu sắc thể hiện chỉ số tiêu chuẩn chất lượng hình học bao gồm tối thiểu 1 acid amin ngoại lai hay sai lệch về cấu hình: vùng xanh (số acid amin ngoại lai = 0), Vàng (số acid amin ngoại lai = 1), Cam (số acid amin ngoại lai = 2), Đỏ (số acid amin ngoại lai = 3) Như vậy có thể thấy, theo trình tự chuỗi acid amin, vị trí 177-179 (vùng hoạt động) có chất lượng tốt (màu xanh) và được chọn để nghiên cứu khả năng gắn kết giữa cấu tử và protein
Trang 21Hình 2.2: Hình ảnh 3D của protein 1ALU
Cơ sở dữ liệu để sàng lọc: Cơ sở dữ liệu các hợp chất thiên nhiên Việt
Nam (Vietnamese natural product Database – VNPD) gồm cấu trúc topo (2
chiều) của 1602 hợp chất có nguồn gốc dược liệu Việt Nam và các thông tin như nguồn dược liệu, tác dụng dược lý đã nghiên cứu… Do giới hạn về tài nguyên tính toán), trong nghiên cứu này sử dụng nguồn dữ liệu là 500 chất đầu tiên của
2.2 Nội dung nghiên cứu:
Bước 1 Sàng lọc ra các hợp chất tự nhiên trong cơ sở dữ liệu VNPD có
tác dụng ức chế IL-6 bằng phương pháp docking phân tử
Trang 22Bước 2 Nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất tốt nhất, thu
được sau khi đã thông qua sang lọc, bằng cách phân tích các thông số hóa lý của cấu trúc và đặc điểm của cây dược liệu có chứa chất đó
2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Sàng lọc bằng quy tắc 5 của Lipinski
Quy tắc số 5 của Lipinski chỉ ra rằng dược chất đường uống không vi phạm quá một trong 4 tiêu chí dưới đây:
- Trọng lượng phân tử MW < 500 daltons
- Không nhiều hơn 5 hydro có thể tham gia liên kết hydro (Số lượng các nhóm –NH và –OH), HBD ≤ 5
- Không nhiều hơn 10 nguyên tử có độ âm điện lớn có thể tham gia liên kết hydro (bao gồm nguyên tử Oxy và Nitơ), HBA ≤ 10
- Hệ số phân bố octanol/nước MlogP ≤ 4,15
Sàng lọc bằng công cụ tính toán phát triển bởi Daina và cộng sự, hiện có thể tiến hành trực tuyến bằng trang web http://www.swissadme.ch/ Tập hợp 500 hợp chất tự nhiên đầu tiên trong CSDL VNPD được sàng lọc bằng cách đưa công thức SMILEs vào web để có các cấu trúc và thông số, sau đó tiến hành phân tích theo quy tắc 5 Mục tiêu nhằm tăng tỷ lệ thành công ở các giai đoạn phát triển tiếp theo cho các hợp chất vượt qua yêu cầu ở quy trình này
2.3.2 Sàng lọc bằng Docking Chuẩn bị protein: Cấu trúc tinh thể tia X của IL-6 (1ALU) được tải từ
ngân hàng dữ liệu protein (https://www.rcsb.org/structure/1ALU), sau đó tiến hành loại bỏ các nước, ligand SO4 và TLA (tartaric acid) Thêm Hydro, gắn trường lực Kollman và xây dựng file pdbqt Tất cả các bước này được tiến hành
trên phần mềm MGLtools
Chuẩn bị hợp chất: Đưa công thức SMILES các hợp chất tự nhiên vào để
vẽ công thức 2D sau đó xây dựng công thức 3D nhờ phần mềm MarvinSketch Sau cùng, sử dùng phần mềm MGLtools thêm hydrogen, gắn trường lực
Gasteiger và xây dựng file pdbqt
Trang 23Dữ liệu là protein cũng như các cấu tử ở dạng file pdbqt Dock bằng phần mềm Autodock với Grid box đặt tâm ở Arg179, kích thước Grid box 15×15×15
Ǻ, vòng lặp là 8, mỗi chất được tiến hành dock 3 lần (n = 3)
Docking phân tử: Phần mềm Autodock được sử dụng để tìm ra cấu hình
liên kết tốt nhất bằng cách sử dụng các đánh giá năng lượng tự do liên kết ΔG và
số lượng tương tác vật lý Autodock tính toán các giá trị năng lượng bằng đặc tính năng lượng nội tại của phối tử, năng lượng tự do xoắn và năng lượng giữa các phân tử gồm năng lượng liên kết Van der Walls, năng lượng liên kết hydro,
năng lượng từ desolvat và năng lượng tĩnh điện
Phân tích kết quả bằng phần mềm Discovery Studio tìm tương tác của các hợp chất với cấu trúc tinh thể của IL-6
Trang 24~96% hợp chất tự nhiên
Trang 25dạng file pdbqt với file protein 1ALU định dạng pdbqt bằng Autodock Vina cho ra năng lượng liên kết ΔG = -7,0kCal/mol Mandindoline A liên kết hydro với Arg179 (2.01Å), ngoài ra liên kết hydro với Gln175 (2.19 Å) và các tương tác kỵ nước khác Do vậy, chúng tôi sử dụng tiêu chí ΔG≤-7,0 kCal/mol và liên kết hydro với Arg179 cho bước tiếp theo
Hình 3.2: Minh hoạ hai chiều tương tác của Madindoline A trong
trung tâm hoạt động của IL-6
Bước tiến hành thu hẹp lại bộ dữ liệu cấu tử từ 412 hợp chất còn 258 hợp chất đạt tiêu chuẩn có tương tác với ARG179 đồng thời có năng lượng liên kết
ΔG = -5,0 kCal/mol (Loại bỏ được gần 40%).Tiếp tục dock 258 chất thu được ở trên, sử dụng phần mềm Autodock với Grid box 30×30×30 Ǻ, tọa độ tại vị trí Arg179 Phân tích kết quả docking bằng Discovery Studio thu được 10 hợp chất
có ΔG ≤ -7,0 kCal/mol, tạo liên kết hydro với Arg179 và có tương tác với các acid amin khác