VÕ NGUYÊN THÀNH SÀNG lọc tìm KIẾM hợp CHẤT tự NHIÊN ức CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE có tác DỤNG đa ĐÍCH ỨNG DỤNG TRONG điều TRỊ BỆNH ALZHEIMER

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ********** VÕ NGUYÊN THÀNH SÀNG LỌC TÌM KIẾM HỢP CHẤT TỰ NHIÊN ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CĨ TÁC DỤNG ĐA ĐÍCH ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ********** VÕ NGUYÊN THÀNH Mã sinh viên: 1401555 SÀNG LỌC TÌM KIẾM HỢP CHẤT TỰ NHIÊN ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE CĨ TÁC DỤNG ĐA ĐÍCH ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Phạm Thế Hải TS Lê Thị Thu Hường Nơi thực hiện: Bộ mơn Hố Dược HÀ NỘI - 2019 Lời cảm ơn Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, lời xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phạm Thế Hải - Giảng viên môn Hóa dược, Đại học Dược Hà Nội, TS Lê Thị Thu Hường – Giảng viên khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, người thầy, cô dìu dắt tơi từ ngày đầu cịn bỡ ngỡ bước vào đường nghiên cứu khoa học, bên bảo, động viên giúp tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy Bộ mơn Hóa dược, anh chị, bạn em nhóm nghiên cứu tạo điều kiện thuận lợi giúp cho tơi hồn thành khóa luận Xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân bên, động viên, ủng hộ giúp em suốt trình tiến hành nghiên cứu Hà Nội, Ngày 20 tháng năm 2019 Sinh Viên Võ Nguyên Thành MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer thuốc điều trị đa đích 1.1.1 Bệnh Alzheimer 1.1.2 Thuốc điều trị Alzheimer 1.2 Tổng quan enzym acetylcholinesterase 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu in silico 1.3.1 Dự đoán ADMET thơng số hóa lý 1.3.2 Sàng lọc ảo dựa docking thuộc tính giống thuốc (drug-likeness) 1.3.3 Mơ động lực học phân tử CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 12 2.1.1 Nguyên liệu 12 2.1.2 Thiết bị 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 12 2.3 Phương pháp 12 2.3.1 Sàng lọc Drugs likeness 12 2.3.2 Mô docking 13 2.3.3 Molecular Dynamic 15 2.3.4 Dự đốn ADMET thơng số hóa lý 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Sàng lọc drug-likeness 18 3.2 Mô protein docking 18 3.2.1 Re-dock galanthamin 18 3.2.2 Sàng lọc ảo 810 hợp chất 20 3.3 Mô động lực học phân tử 24 3.3.1 Độ lệch trung bình bình phương gốc (RMSD) 24 3.3.2 Kết biến động bình phương trung bình (RMSF) 26 3.3.3 Phân tích liên kết hydro ligand protein 27 3.4 Dự đốn ADMET thơng số hóa lý 28 3.4.1 Thông số hóa lý 28 3.4.2 Dự đoán đặc tính dược động học 29 3.5 Bàn luận 31 3.5.1 Về hợp chất mang khung lignan 31 3.5.2 Về ưu điểm phương pháp 31 3.5.3 Về nhược điểm phương pháp nghiên cứu 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Å Angstrom (Đơn vị đo khoảng cách, chiều dài liên kết) RMSD Độ lệch bình phương trung bình gốc RMSF Độ biến động bình phương trung bình gốc His Histidin Pro Prolin Phe Phenylalanin Gly Glycin Glu Glutamic acid Tyr Tyrosin Ser Serine Asp Aspartic Acid P-gly Kênh vận chuyển P-glycoprotein BBB Hàng rào máu - não HIA Hấp thu qua đường ruột người FDA Food and Drug Administration (Cơ Quan Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ) ΔG Năng lượng tự Gibbs Kd Hằng số liên kết TPSA Topological polar surface area – Diện tích bề mặt phân cực LogS Hệ số tan LogP Hệ số phân bố Octanol – nước ADMET Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ, độc tính Receptor Thụ thể Ligand Phối tử MD Molecular Dynamic Pdb Protein data bank ACh Acetylcholin AChE Enzym Acetylcholinsterase AChE Chất ức chế enzyme Acetylcholinsterase AD Bệnh Alzheimer Aβ amyloid-β NMDA N-methyl-D-aspartate PAF Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu MAO Monoamine oxidase RO5 Quy tắc điểm Lipiski MW Khối lượng phân tử ID Kí hiệu nhận dạng VNPD Cơ sở liệu sản phẩm thiên nhiên Việt Nam ROC Đường cong đặc tính hoạt động ns Nano giây Residue Dư lượng acid amin ps Pico giây PAS Vùng ngoại biên enzyme acetylcholine esterase CAS Vùng xúc tác enzyme acetylcholine esterase S Chất NS Khơng phải chất I Có khả ức chế NI Khơng có khả ức chế TcAChE Enzym Acetylcholinsterase loài cá đuối điện NPT Điều kiện đẳng nhiệt đẳng áp NVP Điều kiện đẳng nhiệt đẳng tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết re-dock galanthamin 19 Bảng 3.2 24 ligand tương tác với residue thuộc ba xúc tác 20 Bảng 3.3 Điểm số docking tương tác phối tử với đích 23 Bảng 3.4 Số lượng liên kết hydro trung bình 27 Bảng 3.5 Tính chất hóa lý hợp chất 29 Bảng 3.6 Đặc tính hấp thu, phân bố thải trừ 29 Bảng 3.7 Đặc tính chuyển hóa với enzym gan 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Trung tâm hoạt động acetylcholinesterase Hình 2.1 Cấu trúc chất vẽ ChemDraw 13 Hình 2.2 Xây dựng hộp nước tiện ích mở rộng Add Solvation Box 15 Hình 3.1 Tương tác Galanthamin tinh thể 1dx6 18 Hình 3.2 Cấu dạng galanthamin re-dock phân tích phần mềm Discover studio 19 Hình 3.3 Kết sàng lọc docking 20 Hình 3.3 Tương tác ligand với đích phân tính MOE 22 Hình 3.4 RMSD galanthamin hợp chất theo thời gian mô 25 Hình 3.5 RMSF theo residue galanthamin hợp chất 26 Hình 3.6 Số liên kết hydro galanthamin hợp chất với đích theo thời gian 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Alzheimer (AD) dạng sa sút trí tuệ phổ biến nhất, đóng góp tới 60-70% ca lâm sàng ghi nhận Theo tổ chức quốc tế bệnh Azheimer, ước tính có khoảng 50 triệu người tồn giới mắc bệnh, số tăng gấp đôi sau 20 năm, đạt 75 triệu vào năm 2030 131,5 triệu vào năm 2050 Cũng theo đó, tổng chi phí y tế cho AD ước tính tồn giới năm 2018 nghìn tỷ đô la Mỹ Con số tăng lên nghìn tỷ la vào năm 2030 [32] Cho đến chất ức chế acetylcholinsterase (AChEI) trở thành loại thuốc kê đơn nhiều để điều trị triệu chứng AD nhẹ đến trung bình Các thuốc có lợi việc cải thiện nhận thức hành vi, song chúng khơng trì hỗn ngăn ngừa thối hóa thần kinh Do vậy, mơ hình thuốc điều trị Alzheimer đơn mục tiêu truyền thống dần chuyển hướng sang thuốc hướng đa đích Sàng lọc chất ức chế kép đồng thời khóa vị trí xúc tác ngoại vi AChE hướng tiềm phát triển thuốc đa đích đồng thời trọng tâm nghiên cứu “Sàng lọc tìm kiếm hợp chất tự nhiên ức chế acetylcholinsterase có tác dụng đa đích ứng dụng điều trị bệnh Alzheimer” Cơ sở liệu nghiên cứu có 1600 hợp chất có nguồn gốc dược liệu Việt Nam tiếp tục cập nhật [1] Với số lượng lớn hợp chất vậy, phương pháp in silico áp dụng để giảm thiểu thời gian nghiên cứu tiết kiệm ngân sách Phương pháp tiến hành với mục tiêu chính: Sàng lọc docking tìm kiếm hợp chất tự nhiên tương tác mạnh với vùng xúc tác ngoại biên AChE Mô động lực học phân tử để nghiên cứu ổn định phức hợp ligandProtein thu từ docking Nghiên cứu đặc điểm dược động học hóa lý chất nhờ công cụ in silico 1.5 1.5 19 16 1.5 1 0.5 0.5 0.5 0 500 730 500 1 0.5 0.5 1.5 1000 1450 0.5 0 500 1.5 1000 1458 500 1000 1517 1.5 1 1000 1433 500 500 1.5 956 1.5 0 1000 1.5 0 1000 426 0.5 0.5 0 1.5 500 1000 0.5 0 500 1000 500 1000 Galanthamin 0.5 0 500 1000 Chú thích: Trục tung giá trị RMSD (Å), trục hồnh thời gian mơ (ps) Hình 3.4 RMSD galanthamin hợp chất theo thời gian mô 25 3.3.2 Kết biến động bình phương trung bình (RMSF) 3 16 19 426 2 -50 150 350 550 -50 730 150 350 550 956 -50 150 350 550 1450 2 -50 1 150 350 550 1433 -50 150 350 550 -50 150 550 1517 1458 350 2 1 -50 150 350 550 -50 150 350 550 -50 150 350 550 Chú thích: Trục tung giá trị RMSF (Å), trục hồnh biểu diễn vị trí residue Đường màu xanh hình hợp chất cần nghiên cứu, đường màu cam galanthamin Hình 3.5 RMSF theo residue galanthamin hợp chất Thay tính trung bình dao động nguyên tử biểu diễn kết theo thời gian RMSD, RMSF chúng tơi xem xét dao động trung bình theo thời gian biểu diễn kết theo residue Như hiển thị hình 3.5, linh hoạt residue phức hợp gần tương tự Kết phân tích RMSF AChE dao động (> 1,5Å) tương ứng với dư lượng xa vị trí hoạt động phối tử Dao động lớn tất hệ thuộc residue Phe75, Pro76, Thr535 Pro485, nhiên residue nằm bề mặt protein cách xa vị trí hoạt động nên không ảnh hưởng tới ổn định hệ Ngược lại, dư lượng vị trí hoạt động, đặc biệt dư lượng bị khóa chặt với ligand Ser200, Tyr121, Phe330 dao động không đáng kể 26 Từ phân tích giá trị RMSF, chúng tơi kết luận tất phối tử tạo với đích phức hợp ổn định Các phức hợp bền vững, thay đổi hình dạng q trình mơ theo thời gian 3.3.3 Phân tích liên kết hydro ligand protein Hình 3.6 cho thấy số lượng liên kết hydro tạo phối tử dư lượng protein vị trí liên kết, bảng 3.4 cho biết giá trị số liên kết hydro trung bình phức hợp Số liên kết hydro chất đối chứng galanthamin thụ thể ổn định theo thời gian với giá trị trung bình khoảng 1,85; điều phù hợp với kết docking galanthamin liện kết với Ser200 Gly119 Hợp chất 426 bị loại bỏ có số liên kết hydro q thấp (0,43) khơng đủ khả để trì ổn định vùng xúc tác ngoại biên chất lại muốn trì khả khóa đồng thời vùng AChE cần có liên kết hydro ổn đinh (để khóa đồng thời vùng xúc tác vùng ngoại biên) Như hợp chất 730, 1450, 1458 bị loại bỏ số lượng liên kết hydro trung bình 0,84; 1,16; 1,53 Hợp chất 956 có khả ổn định protein mạnh với số liên kết hydro trung bình lên tới 4,16; vượt số lượng liên kết tìm thấy kết docking Các hợp chất lại 16, 19, 1433, 1517 có khả ổn định phức hợp với giá trị H-bond 1,95; 2,18; 2,58 2,00 Bảng 3.4 Số lượng liên kết hydro trung bình Ligand Số liên kết 16 19 1,95 2,18 426 730 956 1433 1450 1458 1517 Galanthamin 0,43 0,84 4,16 2,58 1,16 1,53 2,00 1,85 hydro trung bình Như vậy, sau mô động lực học phân tử thu chất tiềm ức chế kép vùng xúc tác, ngoại vi phức hợp chúng với AChE có khả ổn định theo thời gian 27 10 0 50 20 50 100 10 956 100 0 50 100 1433 10 1450 50 50 100 1458 0 10 730 426 19 10 10 16 100 50 100 0 50 100 50 100 10 galanthamin 1517 0 50 100 50 100 Chú thích: Đường màu xanh số liên kết phối tử phức hợp Trục tung biểu diễn số liên kết hydro, trục hoành biểu diễn thời gian (ps) Hình 3.6 Số liên kết hydro galanthamin hợp chất với đích theo thời gian10 3.4 Dự đốn ADMET thơng số hóa lý Giai đoạn cuối nghiên cứu chọn lọc hợp chất sở thuộc tính hóa lý dược động học Các tính chất tính khả dụng, khả qua hàng rào máu não BBB, độ hòa tan nước… thường tương quan với cấu hình hợp chất, sử dụng cơng cụ tính tốn để làm giảm bớt gánh nặng cho thử nghiệm lâm sàng [47] 3.4.1 Thơng số hóa lý Bảng 3.5 trình bày tính chất lý hóa hợp chất dự đoán phần mềm DataWarrior TPSA thông số quan nhằm xác định khả thẩm thấu vào tế bào thuốc Với phân tử có TPSA>140 Å gặp khó khăn việc thấm qua màng tế bào [31] Các chất dự đốn DataWarrior có TPSA