Vi khuẩn lam (cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh nghệ an và vai trò của chúng đối với trồng tt

Mục tiêu Mục tiêu của của đề tài nhằm nghiên cứu sự đa dạng VKL trong đất trồng tỉnhNghệ An, phân lập và thăm dò khả năng cố định nitơ một số chủng đồng thời đánhgiá vai trò của chúng đố

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết của đề tài

Vi khuẩn Lam (VKL) là vi sinh vật quang tự dưỡng thải oxy - cố định khícacbonic để tổng hợp nên chất hữu cơ; một số loài VKL có khả năng cố định nitơphân tử và chúng có thể phát triển thành những thảm VKL trên bề mặt đất, đặc biệt làđất trồng lúa nước Những đặc điểm nổi trội này của VKL đã góp phần quan trọngduy trì sự bền vững của các hệ sinh thái nông nghiệp và cũng là mắt xích quan trọng

để duy trì các chu trình sinh - địa - hóa VKL trong đất có khả năng tiết các chất nhầytạo nên một lớp màng, ngăn cản sự thoát hơi nước cho đất, làm đất luôn có độ ẩm, cảitạo pH của đất và các tính chất lí học của đất VKL còn có vai trò to lớn trong việc bổsung chất hữu cơ tăng độ phì cho đất, chống xói mòn đất và tạo ra các chất có hoạttính sinh học kích thích sự sinh trưởng và phát triển của thực vật bậc cao

Ở nước ta, các công trình nghiên cứu về VKL trong đất trồng đã cho thấychúng gặp nhiều trong đất trồng và thành phần loài cũng thay đổi theo loại đất cácvùng địa lý

Riêng ở Nghệ An, cho đến nay chưa có một công trình nào nghiên cứu về sự

đa dạng VKL trong các loại hình đất trồng một cách đầy đủ và có hệ thống Mặtkhác, điều đáng lo ngại hiện nay là việc sử dụng phân bón hóa học và các loại chếphẩm khác trong nông nghiệp một cách thiếu kiểm soát đang gây ra những tác độngtiêu cực đối với chất lượng đất, chất lượng môi trường và chất lượng nông sản Do

đó, việc tìm kiếm các biện pháp, trong đó có việc điều tra, phân lập một số chủngVKLCĐN để cải tạo đất trồng đang là yêu cầu bức thiết của nhiều địa phương, trong

đó có tỉnh Nghệ An

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành

đề tài “Vi khuẩn Lam (Cyanobacteria) trong một số loại hình đất trồng ở tỉnh

Nghệ An và vai trò của chúng đối với trồng trọt”.

2 Mục tiêu

Mục tiêu của của đề tài nhằm nghiên cứu sự đa dạng VKL trong đất trồng tỉnhNghệ An, phân lập và thăm dò khả năng cố định nitơ một số chủng đồng thời đánhgiá vai trò của chúng đối với một số loại cây trồng (lúa và đậu tương)

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiển của luận án

+ Ý Nghĩa khoa học:

- Bằng phương pháp tiếp cận hệ thống phân loại VKL của Komárek và cộng sự(2014) đã sắp xếp lại danh lục các loài VKL ở Việt Nam (đến năm 2010)

- Lập được danh lục 76 loài VKL phân bố trong đất trồng của tỉnh Nghệ An và

bổ sung danh lục VKL trong đất trồng ở Việt Nam Những kết quả này có ý nghĩa vềnghiên cứu và giảng dạy VKL

- Mô tả 1 chi Isocystis và 7 loài bổ sung cho danh lục VKL Việt Nam

- Xây dựng được bộ sưu tập gồm 13 chủng thuộc 13 loài VKL được phân lập

từ đất trồng tỉnh Nghệ An đồng thời thăm dò được khả năng cố định nitơ của 5 chủng

thông qua gen nifD.

- Bước đầu đánh giá được vai trò của 1 chủng VKL Nostoc calcicola HN91a

lên khả năng thích nghi và phòng vệ của Đậu tương khi stress oxy hóa

5 Cấu trúc của luận án

Luận án bao gồm 128 trang với 24 bảng số liệu, 21 hình với 170 tài liệu thamkhảo Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (03 trang), tổng quan (29 trang), phươngpháp và thực nghiệm (12 trang), kết quả và thảo luận (60 trang), kết luận (02 trang),danh mục công trình công bố (01 trang), tài liệu tham khảo (18 trang) Ngoài ra còn

có phần phụ lục

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn Lam

1.1.1 Vị trí của vi khuẩn Lam trong sinh giới

1.1.2 Đặc điểm cơ bản của vi khuẩn Lam

1.2 Phân loại vi khuẩn Lam

1.2.1 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu phân loại vi khuẩn Lam

1.2.2 Hệ thống phân loại vi khuẩn Lam của Komárek và cộng sự (2014) 1.2.3 Tình hình nghiên cứu thành phần loài vi khuẩn Lam trong đất trồng trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới

Ở Việt Nam

1.2.4 Danh lục các loài vi khuẩn Lam ở Việt Nam được sắp xếp theo hệ thống phân loại của Komárek và cộng sự (2014)

Danh lục các loài VKL trong đất trồng ở Việt Nam

Danh lục thành phần loài VKL trong đất trồng và nước ngọt ở Việt Nam

1.3 Vai trò của vi khuẩn Lam trong nông nghiệp

1.3.1 Sự cố định nitơ phân tử của vi khuẩn Lam

1.3.2 Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Lam trong sản xuất nông nghiệp

1.4 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Nghệ An

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các loài VKL (Cyanobacteria) phân bốtrong một số loại hình đất trồng thuộc 10 huyện của tỉnh Nghệ An

Giống lúa Tám thơm (Viện nông nghiệp Việt Nam)

Giống đậu tương Nam Đàn (giống bản địa)

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định các chỉ tiêu nông hoá trong một số loại hình đất trồng tỉnh Nghệ An

- Xác định thành phần loài VKL trong một số loại hình đất trồng Nghệ An

- Phân lập, nuôi trồng một số chủng VKL

- Nghiên cứu ứng dụng ảnh hưởng của VKL đối với cây trồng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu đất và mẫu vi khuẩn Lam

2.3.2 Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu nông hóa thổ nhưỡng

2.3.3 Phương pháp kế thừa và lựa chọn hệ thống phân loại vi khuẩn Lam 2.3.4 Phương pháp định loại vi khuẩn Lam

Các mẫu VKL được quan sát dưới kính hiển vi quang học (Cole Parmer) với

độ phóng đại từ 100 đến 1000 lần, vẽ hình, mô tả và chụp ảnh hiển vi Kích thước tếbào được đo bằng phần mềm Motic Images Plus 2.0

Để xác định các loài VKL, chúng tôi sử dụng các tài liệu định loại của:

Komárek J & Anagnostidis K., 1999: Band 19 Cyanoprokaryota, Part 1

-Chroococcales; Komárek J & Anagnostidis K., 2005: Band 19 - Cyanoprokaryota,Part 2 - Oscillatoriales; Komárek J., 2013: Band 19 - Cyanoprokaryota, Part 3 -Heterocytous genera Ngoài ra, chúng tôi còn tham khảo thêm các tài liệu phân

loại VKL của Dương Đức Tiến, 1996; Desikachary, 1959; Hollerbach, 1953 và

các công trình công nghiên cứu công bố các loài mới, chi mới của các nhàkhoa học

Danh mục các taxa VKL được sắp xếp theo Komárek và cộng sự (2014)

2.3.5 Phương pháp phân lập một số chủng vi khuẩn Lam

Phân lập bằng cấy truyền

2.3.6 Phương pháp phân tích gen cố định nitơ nifD

Phương pháp tách chiết DNA

DNA tổng số được tách chiết theo quy trình tách chiết của A Neilan và cs (1995)

Phương pháp khuếch đại đoạn gen bằng PCR

Tất cả phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích 50µL/phản ứng bao gồm

từ 10 - 50 ng DNA, 25 µM mỗi mồi, 25 µM MgCl2, 25 µl Taq PCR MasterMix(QIAGEN) và H2O Cặp mồi sử dụng là nifD552-F: 5’TCCGK GGKGT DTCTC AGTC3’ và nifD861-R: 5’CGRCW GATRT AGTTC AT3’ cho đoạn gen đích khoảng 310bp (được thiết kế để nhân một phần đoạn gen nifD từ vị trí 552 tới 861 ở trình tự nifD của chủng Anabaena cylindrica PCC 7122 (AF44250)

- Đối chứng: chỉ chăm bón bình thường theo chế độ

- Công thức BG-11 không đạm: ngoài việc chăm sóc theo chế độ, môi trườngBG-11 không đạm được phun lên lá lúa sau khi cấy 15 ngày (lúa bắt đầu đẻ nhánh)

và sau khi cấy 50 ngày (lúa bắt đầu làm đòng); 2 lít môi trường BG-11 không đạmpha loãng 10 lần (20 lít) được sử dụng cho mỗi lần phun

- Công thức Nostoc calcicola HN9-1a: ngoài việc chăm sóc theo chế độ nêu trên, dịch huyền phù Nostoc calcicola HN9-1a (nồng độ 1,9 g khô/lít) được phun lên

lá lúa sau khi cấy 15 ngày và sau khi cấy 50 ngày; lượng phun 20 lít/sào/lần

+ Phương pháp thu thập và phân tích số liệu

Trong mỗi công thức thí nghiệm, 10 khóm lúa được lấy ngẫu nhiên để thu thập

số liệu Các chỉ tiêu về hàm lượng diệp lục, cường độ quang hợp được phân tích vàogiai đoạn lúa đẻ nhánh rộ (sau khi cấy 35 ngày) Bên cạnh đó, kích thước lá đòng(giai đoạn lúa trước trổ bông) và các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất thực tếsau thu hoạch cũng được đánh giá Các chỉ tiêu trên được phân tích theo nhữngphương pháp hiện hành dùng trong nghiên cứu sinh lý thực vật và cho cây lúa

+ Phương pháp phân tích hàm lượng diệp lục a, b, và a, b tổng số bằng phương pháp quang phổ.

2.3.8 Phương pháp thử nghiệm tác dụng của vi khuẩn Lam lên hệ thống chống ôxy hóa ở lá cây đậu tương

Bố trí thí nghiệm

Các công thức đã được thực hiện bao gồm:

- CT1: đối chứng - xử lý đậu tương với nước cất 2 lần

- Các công thức thí nghiệm được xử lý bằng dịch chiết VKL ở các nồng độkhác nhau, cụ thể như sau:

CT2: VKL pha cân bằng nồng độ 0,1g/L;

CT3: VKL pha cân bằng nồng độ 0,3g/L;

CT4: VKL pha cân bằng nồng độ 0,5g/L;

CT5: VKL pha suy vong nồng độ 0,1g/L;

CT6: VKL pha suy vong nồng độ 0,3g/L;

CT7: VKL pha suy vong nồng độ 0,5g/L

Mẫu lá được thu lần đầu vào thời điểm trước khi phun dịch VKL và thu các lầntiếp sau vào các giai đoạn V1 (lá kép ba đầu tiên mở rộng), V3 (có 3 lá kép ba hoànchỉnh, thân chính có 3 đốt hữu hiệu) và V5 (có 5 lá kép ba hoàn chỉnh, cây chuẩn bịbước sang giai đoạn sinh trưởng phát triển sinh sản) Lá đậu tương trong các côngthức thí nghiệm được thu riêng rẽ, cẩn thận, dùng làm nguyên liệu để phân tích cácchỉ số Lá được cân cẩn thận, xử lý bằng nitơ lỏng và bảo quản ở -80oC để phân tíchhoạt độ các enzyme chống oxy hoá Hàm lượng superoxide (O2-) và hydrogenperoxide (H2O2) được xác định trên nguyên liệu tươi

Phương pháp phân tích

Tất cả các hóa chất được sử dụng để phân tích đã được mua từ hãng Aldrich (Hoa Kỳ)

Sigma-+ Xác định hàm lượng hydrogen peroxide và gốc tự do superoxide

Hàm lượng H2O2 nội sinh trong lá đậu tương được xác định bằng phương pháp

so màu theo phương pháp của Becana và cộng sự (1986) và biểu thị theo đơn vị tính

là micromol/gram lá tươi (M.g-1FW)

Hàm lượng gốc tự do O2- được xác định theo phương pháp của Doke (1983) Đơn vị biểu thị lượng O2- trong lá đậu tương là độ hấp thụ ánh sáng của dịch chiết O2-

ở bước sóng 580/ khối lượng lá tươi (A580.g-1FW).

Quá trình phân tích được thực hiện trên máy quang phổ UV-Vis CARY 60(Agilent, USA) có kết nối máy tính cài đặt phần mềm xử lý số liệu UV-Win version 5.0

+ Xác định hoạt độ các enzyme chống oxy hóa

Trước hết, lá đậu tương được nghiền nhỏ và ngâm trong dung dịch đệmphotphat (pH 7,0) để chiết xuất các enzyme Hỗn hợp dịch nghiền được li tâm ở 4oC

với tốc độ 10.000 vòng/phút, trong 20 phút Loại bỏ cặn, thu phần dịch chiết trong để

phân tích hoạt độ enzyme

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu

Các chỉ số được phân tích lặp lại 3 lần

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đa dạng vi khuẩn Lam trong một số loại đất trồng ở tỉnh Nghệ An

3.1.1 Đa dạng thành phần loài vi khuẩn Lam được phát hiện trong đất trồng ở tỉnh Nghệ An

Kết quả điều tra VKL trong một số loại hình đất trồng của tỉnh Nghệ An,chúng tôi đã xác định được 76 loài Chúng thuộc 27 chi, 14 họ của 5 bộ BộOscillatoriales có 25 loài, 5 chi, 3 họ; bộ Nostocales gặp 23 loài, 10 chi, 4 họ; bộChroococcales gặp 14 loài, 5 chi, 3 họ; bộ Synechococales gặp 13 loài, 6 chi, 3 họ; bộPleurocapsales gặp 1 loài, 1chi, 1 họ

3.1.2 Đa dạng các taxon vi khuẩn Lam các bậc bộ, họ và chi vi khuẩn Lam

+ Đa dạng bậc bộ:

Trong đất trồng tỉnh Nghệ An đã gặp 5 bộ, trong đó bộ Oscillatoriales gặp 3 họ

và có số loài nhiều nhất với 25 loài (chiếm 33,89% tổng số loài), tiếp theo là bộNostocales gặp 4 họ và có 23 loài (chiếm 30,26%), bộ Chroococcales gặp 3 họ và có

14 loài (chiếm 18,42%) bộ Synechococcales gặp 3 họ và có 13 loài (chiếm 17,11%),

còn bộ Pleurocapsales gặp 1 họ và chỉ có 1 loài (chiếm 1,32 %) (Bảng 3.1).

B ng 3.1 ảng 3.1 S phân b các taxon VKL trong các b ự phân bố các taxon VKL trong các bộ ố các taxon VKL trong các bộ ộ

Bộ

Số lượng

Tỉ lệ (%)

Số lượng

Tỉ lệ (%)

Số lượng

Tỉ lệ (%)

Merismopediaceae, Pseudanabaenaceae, Aphanothecaceae, Chroococcaceae,

Coleofasciculaceae, Scytonemataceae, Microcoleaceae, Microcystaceae,Dermocarpellaceae, Hapalosiphonaceae và Rivulariaceae gặp từ 1 - 6 loài, trong số

đó Coleofasciculaceae, Dermocarpellaceae và Rivulariaceae mỗi họ gặp 1 chi và

trong mỗi chi gặp 1 loài (Bảng 3.2).

Bảng 3.2 Số lượng taxon trong các họ đã gặp

7 loài (chiếm 9,21%), chi Leptolyngbya, Chroococcus và Scytonema mỗi chi gặp 5

loài (chiếm 6,58%) Cả 6 chi trên tuy chỉ chiếm 22,22% tổng số chi đã gặp nhưng cótới 41 loài và dưới loài (chiếm 53,95% tổng số loài của vùng nghiên cứu)

+ Đa dạng về hình thái các loài VKL trong đất trồng tỉnh Nghệ An

VKL trong đất trồng ở tỉnh Nghệ An khá đa dạng về hình thái: có dạng cấutrúc hạt (đơn bào), cấu trúc sợi (sợi đồng nhất và sợi TBDH); sợi không phân nhánh

và sợi phân nhánh (gồm phân nhánh thực và phân nhánh giả) (Bảng 3.3).

Bảng 3.3 Đa dạng hình thái taxon bậc chi và loài VKL

Đơn bào Không có nội bào tửCó nội bào tử 71 8 161 Chi StanieriaSợi không có

có TNDH là 8 chi, sợi không phân nhánh có TBDH là 5 chi, phân nhánh thật có 3 chi

và phân nhánh giả 1 chi

3.1.3 Sự phân bố Vi khuẩn Lam ở trong đất lúa và đất trồng cây công nghiệp trong mối liên quan với một số chỉ tiêu nông hóa ở tỉnh Nghệ An

Trong đất trồng lúa của 5 huyện (Hưng Nguyên, Nghi Lộc, Diễn Châu, YênThành và Quỳnh Lưu) đã phát hiện được 58 loài và dưới loài; còn ở 5 huyện đấttrồng cây công nghiệp và cây ăn quả (Thanh Chương, Anh Sơn, Tân Kỳ, Nghĩa Đàn

và Quỳ Hợp) gặp 31 loài và dưới loài; có 13 loài gặp chung cho cả hai loại hình đấttrồng

Hệ số Sorenxen (S) [S=2c/a+b, trong đó c: là số loài gặp chung ; a, b là số loàigặp ở mỗi loại hình đất trồng]

S = 0,29 chứng tỏ thành phần loài VKL ở hai loại hình đất trồng khác nhau rõrệt Sự đa dạng loài trong đất trồng lúa ở Nghệ An chủ yếu tập trung trong các chi

Nostoc, Oscillatoria và Phormidium

Sự phân bố của VKL phụ thuộc vào độ ẩm của đất

3.1.4 So sánh về sự phân bố của Vi khuẩn Lam ở trong đất trồng ở tỉnh Nghệ An và đất trồng Việt Nam

Một số chi giữ vai trò chủ đạo (gặp nhiều loài) trong đất trồng Việt Nam cũng

là chi chiếm ưu thế về thành phần loài ở đất trồng Nghệ An, đó là Phormidium, Nostoc, Oscillatoria, Leptolyngbya, Chroococcus và Scytonema.

Tuy nhiên, VKL trong đất trồng tỉnh Nghệ An có một số nét đặc thù riêng, cụthể là:

Trong số 54 chi được tìm thấy ở đất trồng Việt Nam thì ở Nghệ An gặp 27 chi,

trong số này có 4 chi: Aphanothece, Stanieria, Mastigocladus và Isocystis chưa gặp ở các vùng đất khác nhau của Việt Nam, đặc biệt là chi Isocystis lần đầu tiên được

chúng tôi phát hiện cho khu hệ VKL của Việt Nam

Có 7 loài (Jaaginema minimum (Gicklhorn) Anagnostidis et Komárek 1988; Pseudanabaena dictyothalla (Skuja) Anagnostidis 2001; Leptolyngbya carnea (Kützing ex Lemmermann) Anagnostidis et Komárek 1988; Chroococcus helveticus Nägeli 1849; Geitlerinema acutissimum (Kufferath) Anagnostidis 1989; Westiellopsis prolifica Janet 1941 và Nostoc gelatinosum Schousboe ex Bornet et

Flahault 1888) lần đầu tiên được chúng tôi tìm thấy trong đất trồng Nghệ An và đây

là những loài bổ sung cho khu hệ VKL Việt Nam

3.2 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn Lam từ đất trồng ở Nghệ An

3.2.1 Danh lục các chủng vi khuẩn Lam được phân lập

Bảng 3.4 Các chủng VKL đã được phân lập từ đất trồng Nghệ An

chủng

Địa điểm thu mẫu

Thời gian phân lập (năm)

1 Chroococcus helveticus Nägeli 1849 DT2-01 DC1 2017

2 Jaaginema minimum (Gicklhorn) Anagnostidis

3 Pseudanabaena dictyothalla (Skuja)

4 Leptolyngbya carnea (Kützing ex

Lemmermann) Anagnostidis et Komárek 1988 DP3-03 DC3 2017

5 Geitlerinema acutissimum (Kufferath)

6 Westiellopsis prolifica Janet 1941 DP1-01 DC3 2017

7 Nostoc gelatinosum Schousboe ex Bornet et

8 Nostoc calcicola Brébisson ex Bornet et HN91a HN2 2014

Flahault 1888

9 Nostoc linckia (Roth) Bornet et Flahault 1888 Cam-C1 TK3 2017

10 Nostoc paludosum Kützing ex Bornet &

11 Nostoc ellipsosporum (Desmazières)

Rabenhorst ex Bornet et Flahault 1888 NH2X7 NL1 2017

Chúng tôi đã phân lập được 13 chủng thuộc 13 loài VKL trong các điểmnghiên cứu, cụ thể: 1 chủng đơn bào, 4 chủng dạng sợi không có TBDH, 7 chủngdạng sợi có TBDH và 1 chủng dạng sợi có bào tử nhưng không có TBDH từ đất trồngtỉnh Nghệ An

3.2.2 Kết quả phân lập một số chủng thuộc các loài vi khuẩn Lam bổ sung cho danh lục vi khuẩn Lam ở Việt Nam

Kết quả đối chiếu danh lục các loài VKL phân bố trong một số loại đất trồngtỉnh Nghệ An với danh lục thành phần loài VKL phân bố trong đất và nước ngọt ởViệt Nam được công bố từ năm 2010 trở về trước cho thấy:

- Chi Isocystis Borzì ex Bornet et Flahault 1886 lần đầu tiên được tìm thấy ở

Việt Nam Kết quả mô tả trình bày chi tiết ở bảng 3.5

- Có 7 loài VKL lần đầu tiên được tìm thấy ở Việt Nam và được mô tả chi tiết

Bảng 3.5 Danh lục các chi và loài VKL bổ sung cho danh lục

thành phần loài VKL ở Việt Nam

thu mẫu

Chi bổ sung cho Việt Nam

1 Isocystis Borzì ex Bornet et Flahault 1886 DC3

Các loài bổ sung cho Việt Nam

1 Chroococcus helveticus Nägeli 1849 DC1

2 Jaaginema minimum (Gicklhorn) Anagnostidis et Komárek

3 Pseudanabaena dictyothalla (Skuja) Anagnostidis 2001 QL1

4 Leptolyngbya carnea (Kützing ex Lemmermann)

5 Geitlerinema acutissimum (Kufferath) Anagnostidis 1989 DC2, DC3,