Công nghệ chế biến acid gluconic

Sự hấp thu oxy của vi sinh vật là một quá trình rất phức tạp, con đường mà oxy chứa trong một bọt khí phải đi qua để tiếp xúc được với một enzyme chứa trong tế bào vi sinh vật ở thể lơ l

Glucose được sử dụng là nguồn carbon cho hầu hết các loài vi sinh vật sản xuất gluconic acid Tuy nhiên trong sản xuất hầu hết các nhà máy đều không sử dụng glucose tinh khiết, đa số đều sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền khác như mật rỉ hay sản phẩm từ sự thủy phân tinh bột Nguyên liệu sử dụng trong bài báo

cáo là mật rỉ

1.1 Mật rỉ

Mật rỉ ( rỉ đường ): là phế liệu chứa đựng nhiều đường không kết tinh trong sản xuất đường từ mía hoặc củ cải đường Thông thường tỷ lệ rỉ đường trong sản xuất đường mía chiếm 3 - 3.5% trọng lượng mía, tùy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, công nghệ

Thành phần mật rỉ dao động như sau: nước: 15 - 20%, chất khô: 80 - 85%, trong đó có 60% là đường (40% là đường saccharose, 20% là fructose và glucose, còn 40% còn lại là chất phi đường, thành phần cụ thể cho dưới bảng sau:

Trong mật rỉ luôn có mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn, thường gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua Vì vậy trong sản xuất người ta thường dùng fluosilicate natri với nồng độ 2 ‰ so với trọng lượng mật rỉ để dễ bảo quản Trước khi đưa mật rỉ vào sản xuất cần phải qua giai đoạn xử lý mật rỉ để tách tạp chất, đồng thời ức chế hoặc tiêu diệt hệ vi sinh vật có trong mật rỉ Có nhiều quy trình khác nhau để xử lý mật rỉ Ví dụ như theo Rehm và cộng sự (1996) thì đầu tiên mật rỉ sẽ được pha loãng với nước, sau đó bổ sung acid sulfuric và xử lí nhiệt

ở 900C để ức chế vi sinh vật Tiếp theo, bổ sung phosphate với hàm lượng 1-2%

để tách cặn lắng rồi làm nguội Ở một qui trình xử lí khác, người ta sẽ pha loãng

mật rỉ, gia nhiệt rồi ly tâm để tách bỏ những chất không hòa tan

1.2 Các phụ liệu khác

1.2.1 Nước: được sử dụng để pha loãng mật rỉ về giá trị nồng độ chất khô cho quá

trình lên men Nước phải đạt các tiêu chuẩn như tiêu chuẩn nước uống

Bảng 2: Chỉ tiêu chất lượng đối với nước dùng để ăn uống,

nước dùng cho các cơ sở để chế biến thực phẩm ( QCVN 01:2009/BYT )

- Chỉnh pH của rỉ đường về pH lên men 6.5 dùng tác nhân là H2SO4

- Chỉnh pH trong quá trình lên men trong khoảng 4.5 - 6.5 dùng tác nhân trung hòa là CaCO3

- Acid hóa dung dịch sau lên men để thu sản phẩm dùng H2SO4

Bảng 3: Các chỉ tiêu của CaCO 3 và H 2 SO 4

Sự hấp thu oxy của vi sinh vật là một quá trình rất phức tạp, con đường mà oxy chứa trong một bọt khí phải đi qua để tiếp xúc được với một enzyme chứa trong tế bào vi sinh vật ở thể lơ lửng trong môi trường bị ngăn cản do sự tồn tại của những diện tích tiếp xúc có bề mặt từ vài micromet tới vài milimet, kích thước của các bọt khí này phụ thuộc chặt chẽ vào tốc độ khuấy trộn của môi trường (tốc

độ khuấy cao đi đôi với kích thước bọt khí nhỏ) Chất phá bọt thực chất là làm giảm sức căng bề mặt của giao diện khí/ lỏng Như vậy, chất để phá bọt phải là một chất hoạt động bề mặt, phá hủy các bọt khí sinh ra góp phần tăng hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình lên men

Trong môi trường lên men gluconic acid do nồng độ glucose trong môi trường lên men lớn, dẫn đến môi trường có độ nhớt cao, khi đó các bọt không khí

dễ tái hợp lại thành những bọt không khí lớn hơn (nấm mốc không thể hấp thu)

Để tránh hiện tượng này trong sản xuất thường dùng ancol amylic 1/80.000 hay natri oleat 1/25.000 làm chất phá bọt

1.2.4 Các chất dinh dưỡng cho nấm mốc

- Nguồn N: (NH4)2SO4hoặc (NH4)2HPO4.

- Nguồn P: dung dịch H3PO470%

- Nguồn Mg: MgSO4.7H2O

Chương 2: GIỐNG VI SINH VẬT

2.1 Giới thiệu về Aspergillus

Đây là loài nấm mốc hiếu khí Tế bào có vỏ, trong tế bào chất có nhân và nhân con, có các tiểu thể Khi phát triển tế bào nấm mốc thành hệ sợi: khuẩn ty ăn sâu vào cơ chất – khuẩn ty khí sinh Giống mốc này có hệ khuẩn ty (hệ sợi) không màu hoặc vàng nhạt Có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường và khuẩn ty dinh dưỡng ăn sâu vào môi trường đặc (còn gọi là khuẩn

ty cơ chất) Khuẩn ty phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào Tế bào có hạch nhân Cuống đính bào tử không phân nhánh dài và thẳng đầu, có nhiều cuống nhỏ Tùy loại có cuống nhỏ 1 tầng hoặc 2 tầng Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình chai, khi trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống Các đính bào

tử xếp thành chuỗi dài và càng tận cùng càng lớn dần Những chuỗi đính bào tử xếp đối xứng từng quả tròn trên chóp nang trông như đóa hoa cúc Đính bào tử điển hình thường hình cầu, đơn bào, đa hạch bề mặt xù xì Do cuống sinh bào tử

và đính bào tử có màu sắc nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc mốc

Các khuẩn lạc của mốc Aspergillus thường là: vàng, vàng lục, đen, tro, nâu

Đặc điểm của giống Aspergillus là giàu các enzyme thủy phân ngoại bào

(amylase, protease, pectinase, lipase…) Hiện nay người ta sử dụng rộng rãi loài

Aspergilus vào công nghiệp thực phẩm và một số ngành khác để thu acid hữu cơ

và enzyme Một trong những chủng được nghiên cứu kỹ trong phòng thí nghiệm

và các quá trình sản xuất là Aspergilus niger Chủng này trong quá trình phân hủy

các glucid có khả năng tích lũy ở môi trường một lượng acid hữu cơ và enzyme khá lớn

2.2 Giới thiệu về Aspergillus niger

Vị trí phân loại của Aspergilus niger:

 Thuộc bộ các khuẩn (Plectascales), họ Aspergillaceae, lớp Ascomycetes

 Hội nghị Utrecht năm 1952 công nhận như sau: Ở giai đoạn đỉnh bào tử -

giai đoạn phát triển chính của A niger người ta xác định chúng thuộc bộ Moniliales , lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) Ở giai đoạn hình thành túi bào tử thì chúng thuộc bộ Plectascales, lớp nấm túi Ascomycetes

Chủng nấm mốc này có thể chịu được pH thấp 2.1-2.2, nhiệt độ thích hợp

là 30-33oC và dễ phát triển trên môi trường tinh bột

Aspergillus niger được dùng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để thu nhận các acid hữu cơ như citric acid, gluconic acid, fumaric acid Ngoài ra nó còn ứng dụng để thu nhận các chế phẩm enzyme như: amylase, protease,

pectinase, glucoseoxydase…

2.3 Tiêu chẩn chọn giống

 Là chủng nấm mốc thuần khiết, không lẫn các chủng vi sinh vật khác

 Khả năng thích ứng cao, sinh sản mạnh

 Lên men đường glucose với hiệu suất cao, thời gian lên men ngắn, sản phẩm chính là gluconic acid chiếm tỷ lệ cao

 Sau khi lên men dễ tách sinh khối và sản phẩm

 Khả năng bảo quản dễ dàng, các đặc tính di truyền được bảo tồn trong suốt

thời gian bảo quản và sử dụng

2.4 Môi trường nuôi cấy

Trong sản xuất gluconic acid môi trường nuôi cấy cần đáp ứng các yêu cầu sau:

Chương 3: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

Trong quá trình sản xuất gluconic acid tùy thuộc và tác nhân trung hòa là NaOH hay CaCO3, điều kiện lên men mà sản phẩm thu nhận có thể là các sản phẩm khác nhau như gluconic acid, calcium gluconate, sodium gluconate Vì mỗi sản phẩm đều có những vai trò hết sức khác nhau trong lĩnh vực dược phẩm hay trong lĩnh vực thực phẩm

Quy trình công nghệ sản xuất sodium gluconate 3.2 Sơ đồ thiết bị:

Chuẩn bị môi trường Thanh trùng Lên men Lọc

Cô đặc

Tiệt trùng Nhân giống

Nguyên liệu

Cặn

Sodium gluconate

Chương 4: GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

4.1 Xử lý mật rỉ

Mục đích:

 Tiêu diệt hệ vi sinh vật gây bệnh ngoại trừ Bacillus, Clostridium

 Tiêu diệt / ức chế các vi sinh vật khác trong môi trường

 Tách các chất không hòa tan trong mật rỉ

Các biến đổi:

 Vật lý: có sự thay đổi về gradient nhiệt độ

 Sinh học: các vi sinh vật bị tiêu diệt

Thiết bị:

Hình 2: Thiết bị xử lý nhiệt mật rỉ

Cấu tạo: thiết bị hình trụ, đáy côn, làm bằng thép không rỉ Bên trong có hệ thống ống xoắn để gia nhiệt, bên ngoài có lớp vỏ áo để làm nguội Động cơ gắn với cánh khuấy giúp cho quá trình đảo trộn nguyên liệu

Thông số công nghệ: thực hiện tuần tự theo các bước sau:

 Pha loãng mật rỉ với nước (45 – 50%)

 Môi trường được đun nóng đến một nhiệt độ nhất định (90 - 1000

C)

 Giữ ở nhiệt độ đó trong khoảng thời gian 45 – 60 phút

 Làm nguội đến nhiệt độ cần thiết (33-350C đối với đa số nấm mốc)

 Sau khi làm nguội nguyên liệu được cho qua thiết bị ly tâm để tách các tạp chất không tan

Hình 3: Thiết bị ly tâm làm sạch mật rỉ

Cấu tạo: thiết bị có dạng hình trụ, bên trong có bố trí các thanh chặn Khi động cơ truyền động cho rôto bên trong quay, dưới tác động của lực ly tâm các cấu tử không tan sẽ bị văng ra, giữ lại trên các thanh chặn

Thông số công nghệ:

 Đường kính trong của rôto: 1000 mm

 Số vòng quay lớn nhất: 1500 vòng/phút

4.2 Phối trộn

Mục đích: chuẩn bị môi trường lên men cho nấm mốc sinh trưởng, phát triển và

sinh tổng hợp gluconic acid

 Hóa lý: sự chuyển pha rắn sang lỏng của các muối vô cơ trong môi trường

hòa tan vào dung dịch khi khuấy trộn

Thiết bị: chọn thiết bị trộn có cánh khuấy mái chèo

Phương pháp thực hiện: trong công nghiệp sản xuất gluconic acid quá trình nhân

giống vi sinh vật thường được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh (nuôi cấy theo từng mẻ - batch culture) Nhân giống trên môi trường lỏng rất ít được sử dụng, lý do thời gian nuôi kéo dài và hoạt tính enzyme thường không cao so với

nuôi cấy bề mặt

Môi trường thường dùng để nuôi cấy nấm mốc thường là môi trường bán rắn với thành phần: cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê, hoặc một số loại hạt, bột kém chất lượng khác Để làm tăng độ xốp của môi trường, thường trong sản xuất

có trộn thêm các phụ liệu khác như vỏ trấu (15–20%)

Quá trình nhân giống tiến hành qua nhiều cấp nhân giống trên các khay

đựng canh trường đã phối trộn, thực hiện trong phòng nuôi cấy

Các biến đổi:

 Sinh học: trong suốt quá trình phát triển của nấm mốc theo thời gian nhân

giống trong môi trường bán rắn, nấm mốc thường trải qua 3 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: kéo dài 10–14h Bào tử bắt đầu trương nở và bắt đầu hô hấp do đó nhiệt độ phòng nuôi phải được duy trì 28–300C

 Giai đoạn 2: kéo dài 14–18h Hệ nấm bắt đầu phát triển, quá trình hô hấp diễn ra mạnh, nhiệt độ phòng nuôi tăng nhanh Vì vậy phải thông

gió và duy trì độ ẩm môi trường khoảng 80 – 90% trong giai đoạn này

trường bán rắn giảm Nấm mốc bắt đầu sinh bào tử

 Vật lý: thành phần môi trường thay đổi, nồng độ cơ chất tại mỗi điểm trên

khay nhân giống là khác nhau

Thông số công nghệ:

 Độ ẩm của môi trường bán rắn: 58–60%

 Nhiệt độ môi trường: 28–300

C

 Thời gian nuôi: 36–72h, theo mỗi cấp nhân giống

 Chiều dày của lớp môi trường tốt nhất: 5–10cm

 Thời gian kết thúc quá trình nhân giống khi thu được số lượng bào tử cần

thiết cho quá trình lên men (do nhà sản xuất đặt ra)

 Hóa học và hóa sinh: chuyển hóa glucose thành gluconic acid xúc tác enzyme glucose oxydase

Các yếu tố ảnh hưởng: hai yếu tố ảnh hưởng lớn nhất là oxy và pH

 Oxy: là chất nền của quá trình oxy hóa glucose

Gradient nồng độ và thể tích oxy vận chuyển qua môi trường ảnh hưởng đến sự chuyển pha của oxy từ thể khí sang thể lỏng Trong quá trình sản xuất gluconic acid đòi hỏi lượng oxy hòa tan cao, điều này là rất cần thiết cho nấm mốc chuyển hóa các hợp chất hữu cơ trong môi trường thành năng lượng, sinh tổng hợp

gluconic acid Ví dụ, khi Sakurai et al tiến hành sục oxy với áp suất cao lên xấp xỉ

6 bar kết quả đã duy trì được lượng oxy hòa tan 150 ppm

Nghiên cứu cũng cho thấy rằng trong sản xuất gluconic acid A niger sử

dụng oxy tinh khiết nhiều hơn so với khi chúng phát triển ngoài không khí Theo

Kapat et al: khi khuấy trộn với tốc độ 420 rpm và tốc độ thông khí 0.25 vvm,

nồng độ oxy hòa tan lúc này là tốt nhất cho sự sản sinh glucose oxidase Theo Lee

et al: để sản xuất đạt năng suất cao thì phải sử dụng áp suất sục khí cao (2-6 bar)

lúc này lượng oxy hòa tan trong môi trường có thể đạt đến 150 ppm

Nói chung trong quá trình phát triển của hệ sợi nấm lượng oxy cung cấp không đều, nguyên nhân do kích thước của các bong bóng khí ảnh hưởng nhiều bởi độ nhớt của môi trường nuôi cấy Nên cần theo dõi trong suốt quá trình sản xuất

 pH: là yếu tố quan trọng trong việc sản xuất gluconic acid vì ở những pH

khác nhau A niger cho những sản phẩm khác nhau như: citric acid ,

gluconic acid và oxalic acid

Việc tích lũy các sản phẩm này dựa vào các giá trị pH trung bình Ví dụ pH dưới 3,5 tạo điều kiện cho sự tích tụ citric acid, để sản xuất gluconic acid thì pH = 4,5-7,0 (pH tối ưu là 5.5) Nghiên cứu của Franke khi thu thập dữ liệu về mức độ hoạt động của của glucose oxidase ở các cấp độ pH khác nhau và thu được kết quả : 5% (pH=2.0 ) và 35 % (pH= 3.0) hoạt tính, trên nền tảng 100 % ( pH=5.6) hoạt tính

Hình 5: Nồng độ gluconic acid sinh ra theo thời gian lên men

Hình 6: Lượng oxy hòa tan theo thời gian lên men

Cấu tạo: thiết bị này có cấu tạo là một thùng hình trụ đứng được cấu tạo từ thép không rỉ hay lớp kim loại kép có đáy và nắp hình nón, trên nắp có gắn động cơ chuyển đảo và các ống nối cho môi trường và các tác nhân hỗ trợ quá trình lên men, van bảo hiểm và các khớp nối để gắn các dụng cụ kiểm tra

8) Máy khuấy trộn tuabin

9) Bộ trao đổi nhiệt dạng ống xoắn

Tiệt trùng thiết bị bằng hơi nước (0.2 bar),

làm nguội bằng tác nhân lạnh thông qua vỏ

 Thời gian lên men 40h

 Thời điểm kết thúc lên men khi nồng độ đường còn lại 0.1%

Thiết bị: chọn thiết bị lọc khung bản (lọc ép)

Cấu tạo: khung lọc và bản lọc đặt xen kẽ, ở giữa ta đặt vải lọc Ép chặt lại ta được máy lọc khung bản Khi bã lọc nằm đầy trong khung lọc ta tiến hành rửa bã để tận thu, sau đó làm vệ sinh rồi lọc tiếp

Calcium gluconate + H2SO4 = gluconic acid + CaSO4

 Hóa lý: sự tách làm hai pha rắn và lỏng, kết tủa sinh ra lắng xuống

Thiết bị: chọn thiết bị phản ứng có cánh khuấy

Thiết bị gồm: vỏ thép hàn có đáy hình nón và nắp phẳng làm bằng thép chịu acid đậy kín bằng mặt lát gỗ Bề mặt trong của thiết bị được chống gỉ bằng lớp chịu acid Bề mặt ngoài được phủ lớp cách nhiệt Trong nắp thiết bị đặt máy trộn bằng thép chịu acid, cửa nối để thoát khí ra khỏi thiết bị Trong phần nối phía dưới của thiết bị có khớp nối để nhận sản phẩm Khớp nối bên trong dùng để nạp acid H2SO4 Ở nắp và phần nón bên dưới có các cửa - khe nhìn để sửa chữa, làm sạch và khảo sát thiết bị

Hình 9: Thiết bị phản ứng

Thông số công nghệ:

 Lượng H2SO4 dùng để acid hóa môi trường tương đương với lượng CaCO3cho vào theo phương trình phản ứng:

Calcium gluconate + H2SO4= gluconic acid + CaSO4

 Dung dịch sau acid hóa có pH ≈ 3.7

4.7 Ly tâm

Mục đích: tách kết tủa CaSO4, huyền phù trong dung dịch

Các biến đổi:

 Vật lý: độ nhớt giảm, tỷ trọng giảm

 Hóa lý: sự tách làm hai pha rắn và lỏng riêng biệt

Thiết bị: chọn thiết bị ly tâm lắng

Cấu tạo máy gồm có hai rôto Rôto ngoài có dạng hình nón hoăc trụ-nón, rôto trong có dạng hình trụ mà mặt ngoài của nó có gắn vít tải Rôto trong và rôto ngoài quay cùng chiều nhưng rôto trong quay chậm hơn rôto ngoài 1,5-2 % (khoảng 20-100vg/ph) nhờ hộp giảm tốc vi sai Rôto trong có đục các lỗ để dẫn huyền phù nhập liệu Góc nghiêng phần hình nón của rôto khoảng 9-100

Quá trình lắng xảy ra trong khoảng không gian giữa hai rôto, bã bám vào mặt trong của rôto ngoài và được vít tải đẩy về phía cửa tháo bã Nước trong đi về phía ngược lại, chảy qua các cửa ở trên đáy rồi đi ra ngoài Trong phần rôto không

bị ngập nước, bã vừa được đưa ra khỏi rôto vừa được làm khô